ПОЛИМЕРНАЯ ПЛЁНКА С НАФТОХИНОНОВЫМ КОМПЛЕКСОМ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ВОРОБЕЙНИКА КРАСНОКОРНЕВОГО

Изобретение относится к области медицины, к разделу фармации, и может быть в дальнейшем использовано для профилактики и лечения инфекционно-воспалительных заболеваний пародонта, а также в терапевтической практике с целью повышения эффективности и сокращения сроков лечения раневой инфекции, язвенных и рожистых поражений мягких тканей.

Увеличение ассортимента лекарственных средств ранозаживляющего, противовоспалительного, противомикробного действия представляет собой актуальную задачу для медицины и фармации. Это обусловлено, в первую очередь, возросшей антибиотикорезистентностью микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний, что стимулирует научное сообщество на поиски новых антимикробных веществ [Козлов Р.С. Селекция резистентных микроорганизмов при использовании антимикробных препаратов: концепция «параллельного ущерба» // Клиническая Микробиология и Антимикробная Химиотерапия. - 2010. - Т. 12, №4. - С. 284-294]. Кроме того, возрастает интерес к биологически активным веществам (БАВ) растительного происхождения, обладающих выраженным фармакологическим действием при низкой токсичности и малой вероятности развития неблагоприятных побочных эффектов, свойственных некоторым современным химиотерапевтическим лекарственным средствам [Минина С.А., Каухова И.Е. Химия и технология фитопрепаратов: учебное пособие. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. - 560 с.: ил.].

Одним из перспективных объектов исследования, по нашему мнению, является нафтохиноновый комплекс биологически активных веществ, который содержится преимущественно в корнях воробейника краснокорневого - Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc., представителя семейства бурачниковые - Boraginaceae. Данный комплекс включает в себя нафтохинон шиконин, его химическая формула: 5,8-диокси-2(1-окси-4-метилпентил-3)-1,4-нафтохинон. Также комплекс включает эфиры шиконина, такие как ацетилшиконин, изовалерилшиконин, изобутирилшиконин, пропионилшиконин, β,β-диметилакрилшиконин и другие производные шиконина.

Шиконин и его эфиры известны с давних времен как красные природные пигменты и как перспективные лекарственные средства. Так, в обзорной статье Papageorgiou et al. [Papageorgiou V.P., Assimopoulou A.N., Couladouros E.A., Hepworth D., Nicolaou К.C. The chemistry and biology of alkannin, shikonin, and related naphthazarin natural products // Angewandte Chemie International Edition in English. - 1999. - Vol. 38. - P. 270-301] описаны фармакологические свойства данных веществ и обсуждаются возможности их медицинского применения. Авторы статьи ссылаются также и на другие независимые исследования, в которых было доказано наличие у шиконина и у его эфиров противовоспалительного, ранозаживляющего и противомикробного эффектов.

Однако на сегодняшний день применение нафтохинонового комплекса БАВ в медицине ограничено ввиду отсутствия удобной лекарственной формы. В технологии изготовления лекарств известно, что многие органические полимеры, например производные целлюлозы, такие как метилцеллюлоза (МЦ), натрий-карбоксиметилцеллюлоза (Na-КМЦ), способны высвобождать активные вещества в течение некоторого периода времени, обеспечивая местное воздействие вещества на зону патологического очага и обеспечивая пролонгированное действие лекарственной формы [Фармацевтическая технология. Технология лекарственных форм: учебник / И.И. Краснюк, Г.В. Михайлова, Т.В. Денисова, В.И. Скляренко; под ред. И.И. Краснюка, Г.В. Михайловой. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013. - 656 с.].

В настоящее время появилась возможность выделения незаявляемого нафтохинонового комплекса БАВ воробейника краснокорневого из культуры клеток и его дальнейшего применения в составе полимерных систем для местного лечения слизистых оболочек и кожи, что является перспективным направлением в медицине.

Известен аналог - пластырь для слизистой оболочки ротовой полости, содержащий шикониновый экстракт из корней воробейника краснокорневого (Заявка №1-226823, Япония, А61К 35/78, 9/70 от 11.09.89). Известен также аналог - гигиенический состав для ухода за полостью рта, содержащий шиконин (Заявка №59-24993, Япония, А61К 7/16, 7/26, 31/35, публ. от 15.02.84, прототип). Состав содержит в качестве активного компонента шиконин с чистотой 80%, для получения которого сырье, содержащее шиконин, экстрагируют органическим растворителем, гидролизуют с применением водного раствора щелочи и осаждают кислотой. Недостатками данных изобретений является их однокомпонентность, ведь известно, что шиконин в комплексе с суммой его эфиров обладает более выраженным фармакологическим действием, а также недостаток натурального растительного сырья, так как воробейник краснокорневой - редкое, эндемичное растение с ограниченным ареалом произрастания в Японии, Китае и на Дальнем Востоке РФ, занесенное в Красную книгу Амурской области.

Известен также аналог - средство для лечения ран, содержащее коллаген и шиконин, для использования в хирургической практике: перевязочный материал «Гешиспон» (патент РФ №2071788). Недостатком данного изобретения является невозможность применения на слизистых оболочках ротовой полости при воспалительных процессах.

В качестве аналога известно масло шикониновое (патент РФ №2141840), однако недостатками данного изобретения являются неудобство применения на слизистых оболочках ротовой полости ввиду отсутствия у масла адгезивных свойств и, как следствие, невозможность обеспечить пролонгированное воздействие активного компонента на зону патологического очага из-за регулярного омывания слюной.

Наиболее близким аналогом-прототипом изобретения является известная методика изготовления полимерных пленок с шиконином и его производными [Башаров А.Я., Булгаков В.П. Полимерные стоматологические пленки на основе эфиров шиконина // Леса и лесное хозяйство в современных условиях: материалы Всерос. конф. с междунар. участием / отв. ред. А.П. Ковалев. - Хабаровск: Изд-во ФГУ «ДальНИИЛХ», 2011. - С. 152-153], которая заключалась в следующем: растворы полимеров - метилцеллюлозы, натрий-карбоксиметилцеллюлозы и их смесь готовили в концентрации 3-4%, после чего подвергали стерилизации при 100°C в течение 30 минут для уменьшения естественной контаминации полимеров. В качестве пластификатора использовали глицерин в количестве 0,7-0,9 г на 1,0 г полимеров. Сумму эфиров шиконина вводили в раствор готового полимера в виде 0,25% раствора на 95% этаноле. Готовую композицию разливали на стеклянную подложку таким образом, чтобы после высыхания полимера образовалась пленка толщиной 110-120 мкм. Содержание суммы эфиров шиконина в готовых пленках составило 85 мкг на 1 см² пленки. Таким образом, при помощи описанной методики возможно получить полимерные пленки на трех разных полимерных основах с содержанием нафтохинонового комплекса 85 мкг/см². Однако недостатками описанной методики являются:

1. Низкая концентрация вводимого спиртового раствора суммы эфиров шиконина 0,25%, что требует введения в раствор полимера относительно большего объема спиртового раствора, следствием чего является избыточное разбавление полимера и, как результат, возникновение деформаций в процессе сушки, что снижает качество готового продукта.

Чтобы избежать нежелательного разбавления полимера и деформации пленок в процессе сушки, предлагается уменьшить объем вводимого спиртового раствора эфиров шиконина за счет увеличения его концентрации.

2. Недостатком является также низкая доза нафтохинонового комплекса биологически активных веществ в готовых пленках. Микробиологическое исследование определения чувствительности микроорганизмов к шиконину и его эфирам в составе пленок данного состава с дозой 85 мкг/см² не выявило противомикробной активности у данных образцов пленок. В то же время по литературным данным шиконин и его эфиры обладают противомикробной активностью [Isabel Andújar, José Luis Ríos, Rosa María Giner, María Carmen Recio. Pharmacological properties of shikonin - a review of literature since 2002 // Planta Medica. - 2013. - Vol. 79. - P. 1685-1697]. Следовательно, концентрация нафтохинонового комплекса БАВ в составе описанных выше пленок 85 мкг/см² является недостаточной для обеспечения противомикробного эффекта в клинической практике.

Для расширения спектра действия и повышения противомикробной активности полимерных пленок с шиконином и его эфирами предлагаем увеличить концентрацию нафтохинонового комплекса в составе пленок путем введения в состав полимера более концентрированного шиконинсодержащего спиртового раствора. Введение более концентрированного спиртового раствора позволит ввести меньший, по сравнению с прототипом, объем спиртового раствора суммы эфиров шиконина в состав полимера.

3. Следующий недостаток - это отсутствие в составе описанных выше пленок веществ, способствующих лучшему высвобождению нафтохинонового комплекса.

С целью улучшения процесса высвобождения активного компонента из полимерной пленки было решено ввести в ее состав поливинилпирролидон ввиду его известных технологических и физических свойств. Поливинилпирролидон - водорастворимый полимер из мономера N-винилпирролидона, также известный как поливидон или повидон, который широко используется в технологии получения лекарств в качестве связующего вещества, а также за счет образования водорастворимых комплексов улучшает растворимость и биодоступность лекарственных веществ [Фармацевтическая технология. Технология лекарственных форм: учебник / И.И. Краснюк, Г.В. Михайлова, Т.В. Денисова, В.И. Скляренко; под ред. И.И. Краснюка, Г.В. Михайловой. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013. - 656 с.].

Задача изобретения: разработать и изготовить полимерную пленку оптимального состава, содержащую нафтохиноновый комплекс биологически активных веществ - шиконин и его эфиры, выделенный из культуры клеток воробейника краснокорневого - Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc., с ожидаемым противомикробным действием.

Технический результат состоит в изготовлении полимерной пленки оптимального состава, содержащей нафтохиноновый комплекс биологически активных веществ - шиконин и его эфиры, выделенный из культуры клеток воробейника краснокорневого - Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc.

Технический результат достигается следующим образом. На первом этапе выделяют незаявляемый нафтохиноновый комплекс БАВ из каллусной культуры клеток воробейника краснокорневого - Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc., выращенной на искусственной питательной среде по установленной методике [Bulgakov V.P., Kozyrenko М.М., Fedoreyev S.A. et al. Shikonin production by p-fluorophenylalanine resistant cells of Lithospremum erythrorhizon // Fitoterapia. 2001. 72. 394-401]. Выделение проводят по известной методике [Журавлев Ю.Н., Федореев С.А., Булгаков В.П., Музарок Т.И., Береснева Н.В., Головко Е.И. Противовоспалительное и антимикробное средство "Масло шикониновое" // Патент Российской Федерации №2141840, 1999. Бюл. №33]. Для этого навеску культуры клеток воробейника краснокорневого экстрагируют в сокслете гексаном до полного обесцвечивания сырья, затем гексан отгоняют, а навеску сушат до постоянной массы в вакуум-сушильном шкафу. При этом извлечение представляет собой ярко-красную вязкую массу.

На втором этапе предлагаемой методики полученное извлечение нафтохинонового комплекса БАВ растворяют в 95% этиловом спирте до концентрации 5%, и, таким образом, концентрация шиконинсодержащего спиртового раствора для введения в полимерную пленку увеличивается в 20 раз по сравнению с описанным прототипом [Башаров А.Я., Булгаков В.П. 2011 г.] Использование такой концентрации раствора суммы эфиров шиконина позволяет значительно уменьшить объем вводимого в состав полимера спиртового шиконинсодержащего раствора, что не приведет к избыточному разбавлению полимера и последующей деформации пленок при сушке.

На третьем этапе готовят комбинированный раствор полимеров из метилцеллюлозы и натрий-карбоксиметилцеллюлозы по методике, описанной нами ранее в заявке «Оптимальная основа для полимерной пленки с нафтохиноновым комплексом биологически активных веществ воробейника краснокорневого» авторов Таран Л.М., Башарова А.Я., Слободенюк Е.В., Булгакова В.П., Стрельниковой Н.В., отправленной 21.04.2015 г. Для этого в 25 мл воды очищенной, доведенной до температуры +70-90°C, добавляют 0,45 г метилцеллюлозы и 7 капель глицерина, дополнительно по предлагаемой методике добавляют 0,5 г поливинипирролидона. Затем по описанной нами ранее методике смесь помещают в холодильник при температуре +8-10°C на 30 минут для набухания полимера. Далее смесь тщательно перемешивают, на поверхность тонким слоем равномерно насыпают второй полимер - 0,45 г натрий-карбоксиметилцеллюлозы и оставляют для набухания при комнатной температуре +22-24°C на 30-40 минут. Затем смесь гомогенизируют и помещают в холодильник при +8-10°C на 24 часа. По истечении суток проводят повторную гомогенизацию смеси.

На четвертом этапе по предлагаемой методике в готовый раствор полимеров вводят 0,68 мл 5% спиртового раствора суммы эфиров шиконина, гомогенизируют и разливают на стандартную стеклянную подложку площадью 85 см². Сушат в сушильном шкафу при температуре не более +50°C в течение 6-8 часов. После полного высыхания готовый продукт представляет собой гладкие, прозрачные, эластичные полимерные пленки ярко-красного цвета с концентрацией нафтохинонового комплекса 400 мкг/см², что представлено на Фиг. 1. Упаковывают пленки в индивидуальные стерильные полиэтиленовые пакеты.

Для определения противомикробной активности изготовленных полимерных пленок было проведено микробиологическое исследование на базе бактериологической лаборатории КГБУЗ «Краевая клиническая больница №1 им. профессора С.И. Сергеева» г. Хабаровска (главный врач С.С. Пудовиков). Исследовано 48 штаммов микроорганизмов двенадцати различных видов. Определение проводили стандартным диско-диффузным методом, помещая образец пленки площадью 1 см² на поверхность питательной среды Мюллера-Хилтона с засеянной суточной культурой бактерий и грибов (мутность 0,5 по McFarland), и выдерживали в термостате 24 часа при температуре +37°C. После суточной экспозиции учитывали результат по наличию или отсутствию зоны задержки роста микроорганизмов в мм. Эксперимент проводили четыре раза и за конечный результат принимали среднее значение. Полученные результаты приведены в Таблице 1. Так, проведенный микробиологический эксперимент подтвердил наличие противомикробной активности у пленок с содержанием нафтохинонового комплекса в концентрации 400 мкг/см² в отношении некоторых клинически значимых видов микроорганизмов: Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Kocuria varians. Незначительный противомикробный эффект был обнаружен в отношении Enterococcus faecium, Hafnia alvei, Pseudomonas aeruginosa, Bacteroides fragilis, Candida albicans, Candida krusei, Candida tropicalis. He было обнаружено противомикробного эффекта в отношении видов Escherichia coli, Proteus mirabilis.

Преимуществами предлагаемого изобретения являются:

- возможность применения пленок с оптимальной концентрацией нафтохинонового комплекса БАВ воробейника краснокорневого, обеспечивающей противомикробный эффект;

- возможность применения пленок для лечения воспалительных процессов на слизистых оболочках ротовой полости и коже исходя из свойств шиконина и его эфиров;

- безвредность;

- возможность использования пленок как в сочетании с другими лекарственными средствами, так и без них;

- возможность обеспечения местного пролонгированного действия на слизистых оболочках благодаря свойствам полимеров;

- прочная фиксация пленок в зоне патологического очага;

- отсутствие механизмов привыкания к шиконину и его эфирам у микроорганизмов, что дает возможность многократного применения пленок и продления курса лечения в случае необходимости;

- простота применения пленок: возможность применения пациентом самостоятельно в любых условиях.

Пример 1.

Были изготовлены полимерные пленки по предлагаемой методике, количество введенного шиконинсодержащего спиртового раствора 5% составило 0,17 мл, что обеспечило концентрацию нафтохинонового комплекса в пленках 100 мкг/см². Для определения противомикробной активности изготовленных полимерных пленок с концентрацией 100 мкг/см² было проведено микробиологическое исследование. Исследовано 48 штаммов микроорганизмов двенадцати разных видов, включая музейные культуры и штаммы АТСС. Определение проводили стандартным диско-диффузным методом, помещая образец пленки площадью 1 см² на поверхность питательной среды Мюллера-Хилтона с засеянной газоном суточной культурой (мутность 0,5 по McFarland) и выдерживали в термостате 24 часа при температуре 37°C. После суточной экспозиции учитывали результат по наличию или отсутствию зоны задержки роста микроорганизмов вокруг образца пленки. Эксперимент проводили четыре раза и за конечный результат принимали среднее значение. Полученные результаты приведены в Таблице 1. Так, была подтверждена активность данных образцов пленок только против двух видов бактерий: Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis.

Пример 2.

Были изготовлены полимерные пленки по предлагаемой методике, количество введенного шиконинсодержащего спиртового раствора 5% составило 0,34 мл, что обеспечило концентрацию нафтохинонового комплекса в пленках 200 мкг/см². Для определения противомикробной активности изготовленных полимерных пленок данной концентрации было проведено микробиологическое исследование. Исследовано 48 штаммов микроорганизмов двенадцати разных видов, включая музейные культуры и штаммы АТСС. Определение проводили стандартным диско-диффузным методом, помещая образец пленки площадью 1 см² на поверхность питательной среды Мюллера-Хилтона с засеянной газоном суточной культурой (мутность 0,5 по McFarland) и выдерживали в термостате 24 часа при температуре 37°C. После суточной экспозиции учитывали результат по наличию или отсутствию зоны задержки роста микроорганизмов вокруг образца пленки. Эксперимент проводили четыре раза и за конечный результат принимали среднее значение. Полученные результаты приведены в Таблице 1. Так, была выявлена активность данных образцов пленок только против трех видов бактерий: Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Kocuria varians.

Пример 3.

Были изготовлены полимерные пленки по предлагаемой методике, количество введенного шиконинсодержащего спиртового раствора 5% составило 0,51 мл, что обеспечило концентрацию нафтохинонового комплекса в пленках 300 мкг/см². Для определения противомикробной активности изготовленных полимерных пленок с концентрацией 300 мкг/см² было проведено микробиологическое исследование. Исследовано 48 штаммов микроорганизмов двенадцати разных видов, включая музейные культуры и штаммы АТСС. Определение проводили стандартным диско-диффузным методом, помещая образец пленки площадью 1 см² на поверхность питательной среды Мюллера-Хилтона с засеянной газоном суточной культурой (мутность 0,5 по McFarland) и выдерживали в термостате 24 часа при температуре 37°C. После суточной экспозиции учитывали результат по наличию или отсутствию зоны задержки роста микроорганизмов вокруг образца пленки. Эксперимент проводили четыре раза и за конечный результат принимали среднее значение. Полученные результаты приведены в Таблице 1. Так, была выявлена активность данных образцов пленок против трех видов бактерий: Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Kocuria varians. Причем наблюдаемые зоны задержки роста превышали аналогичные у образцов пленок с концентрацией 200 мкг/см², описанные в примере 2.

Пример 4.

Были изготовлены полимерные пленки по предлагаемой методике, количество введенного шиконинсодержащего спиртового раствора 5% составило 0,68 мл, что обеспечило концентрацию нафтохинонового комплекса в пленках 400 мкг/см². Для определения противомикробной активности изготовленных полимерных пленок с концентрацией 400 мкг/см² было проведено микробиологическое исследование. Исследовано 48 штаммов микроорганизмов двенадцати разных видов, включая музейные культуры и штаммы АТСС. Определение проводили стандартным диско-диффузным методом, помещая образец пленки площадью 1 см² на поверхность питательной среды Мюллера-Хилтона с засеянной газоном суточной культурой (мутность 0,5 по McFarland) и выдерживали в термостате 24 часа при температуре 37°C. После суточной экспозиции учитывали результат по наличию или отсутствию зоны задержки роста микроорганизмов вокруг образца пленки. Эксперимент проводили четыре раза и за конечный результат принимали среднее значение. Полученные результаты приведены в Таблице 1. Так, была выявлена активность данных образцов пленок против десяти видов микроорганизмов: Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Kocuria varians, Enterococcus faecium, Hafnia alvei, Pseudomonas aeruginosa, Bacteroides fragilis, Candida albicans, Candida krusei, Candida tropicalis. Причем наблюдаемые зоны задержки роста Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Kocuria varians превышали аналогичные у образцов пленок с концентрацией 300 мкг/см², описанные в примере 3.

Пример 5.

Были изготовлены полимерные пленки по предлагаемой методике, количество введенного шиконинсодержащего спиртового раствора 5% составило 0,85 мл, что обеспечило концентрацию нафтохинонового комплекса в пленках 500 мкг/см². Для определения противомикробной активности изготовленных полимерных пленок с концентрацией 500 мкг/см² было проведено микробиологическое исследование. Исследовано 48 штаммов микроорганизмов двенадцати разных видов, включая музейные культуры и штаммы АТСС. Определение проводили стандартным диско-диффузным методом, помещая образец пленки площадью 1 см² на поверхность питательной среды Мюллера-Хилтона с засеянной газоном суточной культурой (мутность 0,5 по McFarland) и выдерживали в термостате 24 часа при температуре 37°C. После суточной экспозиции учитывали результат по наличию или отсутствию зоны задержки роста микроорганизмов вокруг образца пленки. Эксперимент проводили четыре раза и за конечный результат принимали среднее значение. Полученные результаты приведены в Таблице 1. Результаты проведенного эксперимента значимо не отличались от результатов предыдущего опыта, описанного в примере 4. Таким образом, по результатам проведенных экспериментов было доказано, что для обеспечения противомикробного действия оптимальной является полимерная пленка с концентрацией нафтохинонового комплекса 400 мкг/см².

Пример 6.

Были изготовлены полимерные пленки по предлагаемой методике, с концентрацией нафтохинонового комплекса 400 мкг/см², двух типов: с поливинилпирролидоном и без поливинилпирролидона. Затем было проведено исследование на определение скорости высвобождения нафтохинонового комплекса из пленок стандартным диско-диффузным методом. На поверхность агара помещали образец пленки площадью около 1 см² и в течение двух часов с интервалом в 30 минут измеряли диаметр зоны диффузии активного вещества, определяемый по ярко-красной окраске агара. В результате эксперимента было выявлено, что образец, содержащий в составе поливинилпирролидон, быстрее высвобождал нафтохиноновый комплекс, так как по истечении двух часов диаметр зоны диффузии данного образца был 20 мм, что изображено на Фиг. 2, а диаметр зоны диффузии образца, не содержащего поливинилпирролидон, был 12 мм, что изображено на Фиг. 3.