СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ НЕРВНЫХ СТРУКТУР В ТКАНЯХ

Изобретение относится к области медицины, в частности стоматологии, и может быть использовано для выявления нервных структур в зубочелюстной системе на нейрохимическом уровне.

В распоряжении нейроморфологов имеется широкий выбор методик для выявления нервных структур в тканях. Использование рекомендуемых прописей и условий на практике часто не позволяет получить желаемого результата.

Наиболее часто в нейрогистологической практике применяется методика Е.И. Рассказовой [Рассказова Е.И. Методы импрегнации нейроплазмы разных периферических нервных волокон и окончаний / Е.И. Рассказова // Вопросы психиатрии. В кн. Научные работы института психиатрии. М., Медицина, - 1956. - С. 349-353].

Сущность проведения нейрогистологической реакции по Расказовой Е.И. заключается в следующем:

A) объект исследования фиксируют на 7-10 суток в 12% растворе нейтрального формалина;

Б) режут на замораживающем микротоме;

B) промывают в проточной воде 2 ч;

Г) промывают срезы в дистиллированной воде 2 ч;

Д) помещают срезы на 30 мин в 60° спирт, после чего промывают в двух порциях дистиллированной воды;

Е) помещают срезы на 1 ч в 20% раствор AgNO₃ в термостате при t=37°. Затем промывают в течение 3-5 мин в дистиллированной воде;

Ж) проводят срезы в 1% растворе кислого формалина, приготовленного на водопроводной воде, затем просушивают срезы на фильтровальной бумаге;

З) помещают срезы на 2-3 мин в аммиачное серебро с последующей проводкой в 0,5% кислого формалина на водопроводной воде при комнатной температуре;

И) помещают срезы в аммиачную воду (1:1) на 3-5 мин;

К) проводят через спирты, заключают в бальзам классическим способом.

Способом Е.И. Рассказовой нервные элементы выявляются не всегда и это частично объясняется биохимической индивидуальностью органов и тканей в различные периоды онтогенетического развития.

По выявлению нервных структур в тканевых образованиях различных органов является способ Ю.Н. Майбороды [Способ выявления нервных волокон и сосудов микроциркуляторного русла / Майборода Ю.Н. авт. свид. №1171690 от 08.04.1985].

Способ осуществляется следующим образом:

A) кусочки органа размером 1,0-1,5 см³ фиксируют в течение 14 дней в 12% растворе нейтрального формалина (Ph=7,2-7,4), который сменяют 2-3 раза за весь период фиксации;

Б) после фиксации материал промывают сначала в проточной, а затем в дистиллированной воде - 2-3 ч соответственно;

B) приготавливают на замораживающем микротоме гистологические срезы в количестве 8-10, помещают на 10-15 мин в 1-5% раствор диметилсульфоксида на дистиллированной воде;

Г) из среды диметилсульфоксида, предварительно осушенные фильтровальной бумагой, переносят на 15-30 мин в 5% раствор AgNO₃;

Д) срезы проводят через ряд ванночек с 0,5-1% раствором кислого формалина (Ph=6,0-6,3) на смеси отстоявшейся водопроводной и кипяченой воды в соотношении 1:2;

Е) переносят срезы на 1-2 мин в раствор аммиачного серебра, в котором аммиака должно быть на 1-2 капли больше с целью подавления окрашивания элементов стромы;

Ж) из аммиачного серебра срезы помещают в 0,25-0,5% раствора нейтрального формалина на водопроводной воде комнатной температуры до приобретения ими соломенного оттенка;

З) фиксацию окрашенных срезов осуществляют в аммиачной воде из расчета 1 часть 25% аммиачного спирта и 4 части дистиллированной воды в течение 1 ч. Затем срезы промывают в дистиллированной воде 12 ч со сменой воды 2-3 раза;

И) обезвоживание в спиртах, карбоксилоле, ксилоле, заключение в бальзам производится общеизвестным способом.

Этот способ весьма трудоемкий, не дает полной информации о топографии нервного аппарата - нервных окончаний и, особенно, нейронов ганглиев парасимпатического отдела вегетативной нервной системы, их связей и требует проведения дополнительной окраски стромы. Кроме того, применяя методики импрегнации на основе AgNO₃, невозможно судить о биохимических процессах в изучаемых объектах.

Наиболее близким из способов выявления нервных элементов является метод с азотнокислым кобальтом по Де Фано [Пирс Э. Гистохимия. Теоретическая и прикладная. М. 1962; Лойд З., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. М., «Мир», - 1982].

Суть метода заключается в следующем:

а) кусочки толщиной 3-4 мм фиксируют в смеси следующего состава: Со(NO₃)₂ - 1 г, дистиллированной воды 100 см³, кислого формалина 15 см³. Продолжительность фиксации 6-8 ч для молодых и 12-24 ч для взрослых тканей. Комнатная температура;

б) фиксированный материал быстро ополаскивают и помещают в 1,5% раствор азотнокислого серебра (AgNO₃), в темноте, при комнатной температуре на 24-48 ч, в зависимости от величины кусочков;

в) далее, после быстрого ополаскивания в дистиллированной воде кусочки материала переносят на 8-24 ч для восстановления в смесь: гидрохинона 1-2 г, нейтрального формалина 15 см³, воды 100 см³, сульфида натрия (безводный!) 0,1-0,5 г (количество сульфида натрия достаточное, чтобы в ванне сразу появилась желтоватая окраска). Раствор готовят перед самым употреблением;

г) далее исследуемый материал быстро ополаскивают водой, заливают в парафин или целлоидин.

Однако проведение метода Де Фано является малоинформативным, так как неспецифичность окраски нервных структур и окружающих их соединительно-тканных и клеточных образований, приводит к наслаиванию ионов Ag+ на основные компоненты ткани.

Задачей изобретения является повышение эффективности выявления нервных элементов, информативности биохимических процессов и экономичности.

Поставленная задача достигается первоначальной перфузией исследуемого материала в 5% растворе глюкозы, выдержкой в растворе диметилсульфоксида на дистиллированной воде, промывкой в 5% растворе глюкозы сосудистого русла и заполнение его раствором 2% Со(NO₃)₂, последующей промывкой 5% раствором глюкозы и дальнейшим погружением исследуемого материала в смесь 10% Na₂S с 70% этиловым спиртом от 1 до 8 ч, промывкой до исчезновения запаха сероводорода, фиксацией трое суток в 10% нейтральном формалине с последующим докрашиванием гистологических срезов в 0,15% галлоцианине до 24 ч.

Способ осуществляют следующим образом:

A) сначала перфузируют кусочки исследуемого материала через сосуды 5% раствором глюкозы, чтобы смыть кровь;

Б) на 10-15 мин исследуемый материал помещают в 1-2% раствор диметилсульфоксида на дистиллированной воде с последующей промывкой сосудистого русла 5% раствором глюкозы шприцом;

B) далее шприцом вводят в сосуды 2% раствор Со(NO₃)₂ на 15-20 мин;

Г) промывают 5% раствором глюкозы в течение 1-2 мин;

Д) помещают объект исследования в смесь следующего состава: 10% Na₂S и 70% этиловый спирт от 1 до 8 ч (время определяют эмперическим путем в зависимости от структуры и массы органа);

Е) промывают в дистиллированной воде до исчезновения запаха сероводорода;

Ж) фиксируют в 10% нейтральном формалине 3 суток;

З) приготавливают на замораживающем микротоме гистологические срезы и докрашивают в 0,15% галлоцианина. Время окрашивания варьирует от 16 до 24 ч;

И) проводят традиционную проводку через реактивы, заключение в бальзам по стандартной методике.

Результат: нервные волокна (особенно безмякотные) - интенсивно черные на светлом фоне. Ядра клеток и их цитоплазма слегка синие.

Количество выявляемых нервных структур на единицу площади среза составляет 11,1±0,09, по сравнению с методом Де Фано - 4,9±0,07 (p<0,05).

Использование предлагаемого технического решения позволяет более полно выявить интраорганные компоненты нервных структур в различных по своей морфохимической природе органах и тканях. Присутствие отрицательного заряда на биологических субстратах способствует удержанию возле них положительно заряженного иона Со⁺⁺ в нейроплазме нервных волокон за счет электростатической связи между Со⁺⁺ и диметилсульфоксидом. Благодаря диметилсульфоксиду концентрация Со⁺⁺ в нервных проводниках становится более высокой, что способствует повышению чувствительности (катионизации) соединений кобальта в предлагаемом способе.

Способ более экономичен - не требует использования AgNO₃, время проведения анализа сокращается на сутки.