Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ЭКСПРЕССНОЙ ОЦЕНКИ БИОСОВМЕСТИМОСТИ МЕТАЛЛОВ И ИХ СПЛАВОВ ПО ПИЛИПЕНКО П.Н.

Изобретение относится к медицинской технике, точнее к технике лабораторных исследований, в частности к способам проведения анализа биосовместимости имплантируемых материалов.

Одним из важнейших критериев отбора имплантируемых материалов является биосовместимость - отсутствие негативного влияния на организм. Например, ортопедические имплантаты в настоящее время изготавливаются чаще всего из металлов, металлических сплавов и керамики. Известно, что после введения в организм имплантата, он и/или его компоненты вступают в контакт как с клетками окружающих тканей, так и со всей внутренней средой организма [1]. Наиболее перспективными способами доклинической оценки биосовместимости имплантируемых материалов считаются исследования их токсичности в опытах in vivo, а также тесты in vitro для оценки неспецифической токсичности материалов медицинского назначения.

Известен способ оценки биосовместимости титановых сплавов медицинского назначения [2], состоящий из изучения их влияния на параметры развития популяций различных штаммов бифидобактерий (Bifidobacterium adolescentis МС-42, В. adolescentis ГО-13, В. bifidum №1, В. longum В379М), такие как: количество жизнеспособных клеток (определяли методом предельных разведений), уровень накопления биомассы (нефелометрически), активности кислотообразования (потенциометрически) и формирование биопленок (визуально). Недостатком этого способа является большой перечень необходимого оборудования, реактивов и препаратов бактерий, а также участие персонала с высокой квалификацией для проведения сложных микробиологических исследований. И главное, получаемые результаты имеют очень отдаленное отношение к изучению биосовместимости металлических сплавов медицинского назначения, т.к. используемые в данном способе клетки-микроорганизмы (бифидобактерий) не являются иммунными клетками и, как правило, не участвуют в иммунных реакциях организма человека на имплантируемый материал.

Известен способ оценки биосовместимости [3], состоящий из определения показателей активности фагоцитирующей популяции клеток (моноцитов и нейтрофилов) крови индивидуума после их инкубирования с порошком исследуемого инородного материала. Биосовместимость организма с инородными материалами определяют по трем показателям бактерицидности, а именно активация сукцинатдегидрогеназы, миелопероксидазы и катионных белков и активности двух ферментов плазматической мембраны (АТФ-аза, 5′-нуклеозидаза). Полученные показатели выражают в виде индекса стимуляции T, который рассчитывают по формуле: T=N₀/N_k, где N₀ - средний показатель оптической плотности клеточной субстанции с инородным материалом, N_k - средний показатель оптической плотности клеточной субстанции без него. После этого рассчитывают среднеарифметическое значение индекса стимуляции каждого отдельного цитохимического показателя по реакции клеточной субстанции на инородный материал. Затем данные показатели суммируют, при этом используют только целую часть числа индекса стимуляции, строят шкалу биосовместимости и по ней судят о степени биосовместимости инородного материала и организма, при этом, чем меньше суммарный индекс стимуляции, тем больше инородный материал биосовместим с организмом.

Недостатком этого способа является использование дорогостоящих реактивов и оборудования, а также длительность и сложность производимых операций, выполнение которых требует квалифицированного персонала, что не позволяет проводить экспрессную оценку степени биосовместимости исследуемого металла или сплава. Другим существенным недостатком данного способа является необходимость использования порошка из исследуемого металлического материала, что не позволяет проводить оценку биосовместимости готового металлического имплантата при оптимизации технологических процессов пассивации его поверхности.

В тоже время известно, что одним из индукторов воспалительных реакций организма, а также сигнальной молекулой хемотаксиса для иммунных клеток является перекись водорода [4-7], которая образуется при контакте водных растворов, содержащих молекулярный кислород, с поверхностью различных металлов [8].

Технической задачей изобретения является создание способа экспрессной оценки степени биосовместимости металлов и их сплавов медицинского назначения.

Технический результат состоит в том, что предложенный способ оценки биосовместимости является экспрессным, простым, дешевым и не требует для его реализации специалистов высокой квалификации.

Поставленная задача решается тем, что в предлагаемом способе экспрессной оценки биосовместимости металлов и их сплавов, состоящем из подготовки образца испытуемого материала и тестирующей среды, измерения в ней концентрации перекиси водорода C₀, помещения образца в тестирующую среду и инкубирования при заданной температуре, повторного измерения концентрации перекиси водорода C₁ в тестирующей среде, параметром тестирующей среды, характеризующим степень биосовместимости, является изменение концентрации перекиси водорода ΔC=C₁-C₀, в тестирующей среде за время инкубирования в ней образца.

Кроме того, степень биосовместимости рассчитывают по формуле:

B=-lg(V·ΔC/S·τ)-8,

где V - объем буферного раствора (л),

ΔC - изменение концентрации перекиси водорода в буферном растворе (моль/л),

S - площадь поверхности металлического образца (см²),

τ - время инкубирования (мин), что позволяет сравнивать результаты исследований степени биосовместимости металлических образцов и их сплавов разной формы и размера, причем полученные в разное время, по удобной пятибалльной шкале (от 1 до 5), т.е. чем больше значение В, тем выше биосовместимость исследуемого материала.

Кроме того, тестирующей средой является фосфатно-солевой буферный раствор, т.к. данный буферный раствор является одним из наиболее простых по химическому составу физиологических растворов, не сложен в приготовлении и состоит из недорогих реактивов, что позволяет тестировать большие по размеру металлические образцы, причем как при оптимизации технологических процессов пассивации их поверхности, так и непосредственно перед медицинским применением.

Кроме того, изменение концентрации перекиси водорода определяется способом усиленной хемилюминесценции, что позволяет использовать недорогое стандартное оборудование, работа на котором не требует специальной подготовки персонала.

Кроме того, хемилюминесценцию измеряют в системе люминол-пара-йодфенол-пероксидаза хрена, т.к. данная система является одной из наиболее чувствительных к концентрации перекиси водорода в водных растворах и поэтому позволяет количественно, с низкой погрешностью тестировать металлы с высокой биосовместимостью, образующие наномолярные концентрации перекиси водорода в фосфатно-солевом буферном растворе.

Изобретение иллюстрируется графиками (фигуры 1-3), на которых показаны кинетики образования перекиси водорода в буферном растворе при инкубировании в нем одинаковых по площади пластин из различных металлов, где на фиг. 1 приведена данная зависимость для медной пластины (Cu), на фиг. 2 для пластин из железа (Fe), алюминия (Al) и серебра (Ag) и на фиг. 3 для пластины из медицинского титана (Ti) марки ВТ-0. На всех графиках по оси абсцисс отложено время в мин, а по оси ординат концентрация перекиси водорода, причем на фиг. 1 и фиг. 2 в мкМ, а на фиг. 3 в нМ.

Предложенный способ реализуется следующим образом. Подготавливается тестирующая среда (буферный раствор), в которой любым известным способом измеряется концентрация перекиси водорода C₀. Далее образец исследуемого материала (металлический имплантат) помещается в тестирующую среду и инкубируется в ней при заданной температуре при перемешивании. После инкубации снова измеряется концентрация перекиси водорода С₁ и вычисляется изменение концентрации перекиси водорода ΔС=С₁-С₀. Степень биосовместимости металлического имплантата вычисляется по формуле:

B=-lg(V·ΔC/S·τ)-8.

Пример конкретного применения

В данном примере способом усиленной хемилюминесценции в системе люминол-пара-йодфенол-пероксидаза хрена измеряли кинетические зависимости образования перекиси водорода в 20 мл фосфатно-солевого буферного раствора с pH=7.3÷7.5, во время инкубирования в нем металлических пластин различных металлов (Cu, Fe, Al, Ag, Ti) при температуре 20÷22°C. Площадь каждой пластины составляла 32 см². Буферный раствор содержал 0.01 М фосфат ионов, 0.137 М NaCl, 0.0027 М КСl, 7.5 мг/л O₂. Инкубирование проводили в чашках Петри, при постоянном перемешивании на шейкере. Для определения концентрации перекиси водорода регистрировали интегральную интенсивность хемилюминесценции раствора, получаемого при смешивании 100 мкл «счетного раствора» и 1 мл буферного раствора. Реакцию проводили в стеклянной пробирке объемом 5 мл, закрепленной в крышке люменометра. Исследуемый раствор вводили с помощью медицинского шприца (объемом 2 мл) через иглу, вмонтированную в крышку прибора. Предварительно определяли концентрацию перекиси водорода в исходном буферном растворе. Интенсивность люминесценции определяли с помощью люменометра «Lum-5773» и программы PowerGraph. «Счетный раствор» состоял из 0.5 М трис-HCl (pH=8.5), 0.65 мМ пара-йодфенола, 0.13 мМ люминола, 200 ед./мл пероксидазы хрена. Калибровку проводили методом добавок, используя растворы перекиси водорода с известной концентрацией, которые готовили из 30% раствора H₂О₂. Его концентрацию контролировали по плотности при Т=20°C.

Далее по формуле: В=-lg(V·ΔC/S·τ)-8 рассчитывали степень биосовместимости каждого металла. В расчетах использовали значения концентрации перекиси водорода, образующейся через 15 минут контакта металлических пластин (площадью 32 см²) с 20 мл фосфатно-солевого буферного раствора. Концентрация перекиси водорода в исходном буферном растворе составляла величину ~1 нМ. Результаты расчетов приведены в таблице.

Полученные значения степени биосовместимости B хорошо согласуются с известными сведениями о биосовместимости рассмотренных металлов. Так титан марки ВТ-0 является одним из основных материалов для создания разного рода имплантатов, а медь, наоборот, используют при моделировании хронического воспаления у лабораторных животных, для чего медные пластины обычно зашивают животным под кожу.

Источники информации

1. Заявка США №20130266629, «MEDICAL DEVICE HAVING А SURFACE COMPRISING ANTIMICROBIAL METAL», 2013.

2. Вегера И. и др. «Биосовместимость титановых сплавов медицинского назначения», «Наука и инновации» №2 (72), 2009.

3. Патент РФ №2402773, «Способ определения биосовместимости инородного материала с организмом», 2010.

4. Klyubin, I.V., Kirpichnikova, К.М., Gamaley, I.A. «Hydrogen peroxide-induced chemotaxis of mouse peritoneal neutrophils)). European Journal of Cell Biology, 70(4), 347-351, 1996.

5. Hattori H., Subramanian K.K., Sakai J., Luo H.R., «Reactive oxygen species as signaling molecules in neutrophil chemotaxis» Communicative & Integrative Biology, 2010 May, 3(3) 278-281, 2010.

6. Niethammer P., Grabher C., Look A.T., Mitchison T.J., «A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish» Nature, 459, 996-999, 2009.

7. Enyedi В., Niethammer P., «H₂O₂: a chemoattractant?» Methods Enzymol, 528, 237-255, 2013.

8. Пилипенко П.Н. «Образование перекиси водорода при контакте воды с поверхностью металлов», Труды XX Международной конференции и дискуссионного клуба «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 05-15 июня 2012 года, стр. 260-261, 2012.