Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОЧИСТКИ ТРИПТОРЕЛИНА

Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности и медицины.

Распространенным методом лечения ряда заболеваний в настоящее время является гормонотерапия - метод лечения, предполагающий воздействие с помощью гормонов или антигормонов.

Одним из хорошо исследованных и широко применяемых аналогов гонадотропин рилизинг-гормона, используемых для медикаментозной терапии, является Трипторелин (Triptorelin, Triptorelin pamoate, Triptorelin acetate) - противоопухолевый препарат, синтетический аналог гонадотропин-рилизинг гормона.

Трипторелин оказывает антигонадотропное, противоопухолевое, цитостатическое действие и используется при эндометриозе, миоме матки (для уменьшения размеров перед хирургическим удалением), в симптоматическом лечении прогрессирующего гормонозависимого рака предстательной железы (альтернатива хирургической кастрации, для подавления секреции тестостерона), раннем половом созревании, программе экстракорпорального оплодотворения, гипогонадотропной аменорее.

Для применения в медицине и для медико-биологических исследований необходимы гомогенные высокоочищенные препараты. Поэтому исследователи в данной области большое внимание уделяют разработке новых эффективных способов очистки гормональных препаратов.

Известен способ синтеза трипторелина, который описан в патенте US 4301066, опубл. 1981-11-17. Предпочтительный способ очистки согласно данному источнику включает следующие шаги. Декапептиды, полученные из реакции, обрабатывают раствором гидроксида аммония в водном метаноле и раствор выпаривают. Остаток помещают затем на колонку с силикагелем, используя раствор хлороформ-метанол-уксусная кислота в качестве элюанта. Очищенная фракция декапептидов подвергается другой хроматографии с использованием карбоксиметилцеллюлозы и буферного градиента водного ацетата аммония.

Заявка CN 103122023 А, 2013.05.29 описывает двустадийный метод очистки трипторелина. Метод включает в себя следующие шаги: растворение образца с использованием водного раствора, содержащего органические растворители, и проведение градиентного элюирования на образец, используя октадецилсилан химически связанного кремнезема в качестве неподвижной фазы, в качестве буфера солей фосфорной кислоты или серной кислоты в качестве фазы А, с ацетонитрилом в качестве фазы В; затем преобразование трипторелин фосфатов в ацетаты с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) и сублимационную сушку полученных ацетатов, так что трипторелин ацетат с чистотой более чем 99,7%. Способ обеспечивает процесс очистки с низкой себестоимостью, высоким выходом, простой в технологическом процессе, уменьшением примесей.

В качестве ближайшего аналога может быть указан патент CN 103012564 В, 2013.11.13, который касается высокоочищенного трипторелина и способа его очистки. Способ включает следующие шаги: (а) растворение трипторелина, фильтрацию; (b) загрузку фильтрата на ионообменную колонку, элюирование с подвижной фазой, преобразование трипторелина в соль и сбор основного пика элюата; (с) нагрузку элюата, полученного на этапе (b), на колонку из силикагеля, элюирование с подвижной фазой, собирая основной пик элюата, и удаление растворителя. Метод имеет высокий выход, стабильное качество продукции и низкую себестоимость.

Задача изобретения состоит в разработке нового оптимизированного способа очистки трипторелина.

Задача решается способом очистки трипторелина, включающим растворение трипторелина в 0,5-2% водном растворе уксусной кислоты, фильтрование методом ультрафильтрации, добавление к раствору изопропилового спирта до концентрации 2% по объему и перемешивания, проведение жидкостной хроматографии низкого давления на колонке с сферическим полистиролом, сшитым дивинилбензолом типа LPS-500, используя элюирование водным раствором изопропилового спирта (ИПС) и уксусной кислоты (УК) в градиенте концентраций от 2-7% ИПС+0,2-2% УК до 8-15% ИПС+0, 2-2% УК с последующей изократикой водным раствором, содержащим 8-15% ИПС+0, 2-2%УК, проведение ионообменной хроматографии на колонне с сульфоэтильными группами на сшитом полиакрилате марки СПС-Био SP Сульфопропил (SPS-bio) с размером частиц 75 мкм, используя градиентное элюирование: линейный градиент 0 до 0,8М ацетата аммония за 3 объема колонки, далее изократика 0,8М ацетатом аммония, проводят высокоэффективную жидкостную хроматографию на колонке с обращенно-фазным сорбентом на основе силикагеля с частицами сферической формы и размером 5 мкм типа Kromasil С18, используя в качестве элюента водный раствор, содержащий 2-7% ИПС и 0, 2-2% УК, полученные фракции очищенного продукта с содержанием трипторелина более 98% подвергают концентрированию на гидрофобном сорбенте с последующим элюированием раствором, содержащим смесь изопропилового спирта и уксусной кислоты, упариванием элюата и его лиофильным высушиванием.

Технический результат: получение желаемого конечного продукта с высокими выходами, селективностью и степенью чистоты.

Способ осуществляют следующим образом.

1. Растворение и фильтрование трипторелина-сырца

Готовят раствор «0,6% уксусной кислоты (УК)».

Растворяют трипторелин-сырец в «0,6% УК» из расчета 1,0 л на 100 г трипторелина-сырца.

В ходе растворения следует периодически измерять с помощью индикаторной бумаги рН раствора сырца. В случае если значение рН выше 5, следует понизить его, добавляя уксусную кислоту.

Образовавшийся в результате раствор фильтруют через стеклянный фильтр пор. 3. Закрытую емкость с отфильтрованным раствором убирают в холодильник на ночь.

Если после фильтрации и отстаивания в растворе образовался осадок, раствор подвергают осветлению на установке проточной ультрафильтрации «Pellicon» с мембранами 100 кДа.

К отфильтрованному раствору добавляют изопропиловый спирт (ИПС) до концентрации 2% по объему и тщательно перемешивают.

2. Предварительная очистка трипторелина-сырца с помощью жидкостной хроматографии низкого давления ЖХ НД на колонне с LPS-500

Уравновешивание колонны

Уравновешивают колонну с сорбентом LPS-500 до стабилизации базовой линии «2,0% ИПС и 0,6% УК».

Наносят раствор трипторелина-сырца на колонну с LPS-500 из расчета 20-70 г трипторелина-сырца на 1 л упакованного сорбента.

Элюция трипторелина с колонны LPS-500.

Линейный градиент 4% ИПС+0,25% УК до 10% ИПС+0,25% УК за 3 объемов колонки, далее изократика 10% ИПС+0,25% УК.

Объединенные фракции после предварительной очистки на LPS-500 подвергают дальнейшей очистке с помощью ионообменной хроматографии на колонне, упакованной полиакрильным сорбентом СПС-Био SP Сульфопропил (Сульфопропильные группы на сшитом полиакрилате).

3. Ионообменная хроматография низкого давления на колонне упакованной СПС-био

Уравновешивают колонну с сорбентом СПС-Био SP Сульфопропил до стабилизации рН раствором «0,6% УК».

Наносят «раствор после предварительной очистки на LPS-500» на колонну с СПС-Био SP Сульфопропил из расчета 20-30 г трипторелина на 1 л упакованного сорбента.

Элюция трипторелина с колонны СПС-Био SP Сульфопропил.

Линейный градиент 0 до 0,8М ацетата аммония за 3 объема колонки, далее изократика 0,8М ацетатом аммония

Объединенные фракции после очистки на СПС-Био SP Сульфопропил подвергают дальнейшей очистке с помощью обращенно-фазовой хроматографии на колонне Kromasil С18.

4. Очистка трипторелина с помощью ВЭЖХ на колонне с Kromasil

Уравновешивание колонны.

Уравновешивают колонну с сорбентом Kromasil С18 до стабилизации базовой линии раствором «3% ИПС+0,25% УК».

К «раствору после очистки на СПС-Био SP Сульфопропил» добавляют до 3% ИПС и подкисляют уксусной кислотой до рН=5.

Загружают полученный раствор на колонну с Kromasil С18 из расчета 4-7 г трипторелина на 1 л упакованного сорбента.

Элюируют трипторелин с колонны Kromasil «5% ИПС+0,25% УК».

Дополнительно, после осуществления ВЭЖХ полученные фракции очищенного продукта с содержанием трипторелина более 98% подвергают концентрированию на гидрофобном сорбенте с последующим элюированием раствором изопропилового спирта, упариванием элюата и его лиофильным высушиванием.

Ниже приведен конкретный пример осуществления очистки.

850 г трипторелина-сырца (чистота 18% по ВЭЖХ), полученного в результате пептидного синтеза трипторелина, содержащего 150 г целевого пептида перемешивают в 10 л 0,6% раствора уксусной кислоты в течение 8 часов и оставляют на 8 часов для отстаивания.

Осадок отделяют на целлюлозном фильтре 0,2 мкм и промывают 0,5 л 0,6% раствором уксусной кислоты. К фильтрату добавляют изопропиловый спирт до концентрации 2% и наносят на колонну 200X500 мм, заполненную сополимером стирола с дивинилбензолом марки LPS-500 с размером частиц 75 мкм, предварительно уравновешенную раствором 2% ИПС+0,6%УК. Проводят градиентное элюирование: Линейный градиент 4% ИПС+0,25% УК до 10% ИПС+0,25% УК за 3 объема колонки, далее изократика 10% ИПС+0,25% УК. Собирают фракции с чистотой трипторелина по хроматограмме не менее 40%. Выход трипторелина на стадии предварительной очистки составляет 85%.

Полученный раствор полупродукта подвергают ионообменной хроматографии на колонне 150×300 мм, упакованной СПС-Био SP Сульфопропил с размером частиц 75 мкм, предварительно уравновешенную 0,6% водным раствором уксусной кислоты. Проводят градиентное элюирование: линейный градиент 0 до 0,8М ацетата аммония за 3 объема колонки, далее изократика 0,8М ацетатом аммония. Собирают фракции с чистотой трипторелина по хроматограмме не менее 60%. Выход трипторелина на стадии ионообменной хроматографии составляет 95%.

Полученный раствор полупродукта подвергают ВЭЖХ. Раствор наносят порциями по 2,5-3 л (со скоростью 200 мл/мин) на стальную колонну аксиального сжатия диаметром 100 мм и высотой 300 мм, заполненную обращенно-фазным сорбентом Kromasil С18 10 мкм 100А и уравновешенную буфером, представляющим собой водный раствор, содержащий 3% изопропилового спирта и 0,25% уксусной кислоты. Элюируют трипторелин водным раствором, содержащим 5% ИПС+0,25% УК, затем регенерируют сорбент водным раствором, содержащим 15% ИПС+0,25% УК и уравновешивают водным раствором, содержащим 3% ИПС+0,25% УК. Скорость элюирования 200 мл/мин. Детектирование ведут по УФ поглощению при 254 нм. Фракции собирают объемом не более 1 л. Чистоту фракций контролируют по аналитической ВЭЖХ.

Фракции с содержанием трипторелина более 98% объединяют, упаривают на роторном испарителе в 2 раза и концентрируют на колонке с гидрофобным сорбентом, элюируя смесью 25% ИПС+0,25% УК. Элюат собирают и упаривают на роторном испарителе и лиофильно высушивают. Получают 104 г лиофильно высушенного продукта.

Степень очистки более 99,8%.

Биодоступность при в/м введении - 45,8%, при и/к - 76%. В интервале месяц повторные инъекции не вызывают повышения концентрации. Распределение по органам и тканям заканчивается через 4 ч, объем распределения - 104 л. Т1/2 - 7.6 ч. Плазменный клиренс - 161.5 мл/мин, двухфазный.