СПОСОБ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ЛИНИЯ ПРОИЗВОДСТВА НИЗИНА

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к производству целевого продукта с использованием микробиологических процессов, и может быть использовано при производстве пищевой добавки низина, применяемого в качестве консерванта при изготовлении плавленых и твердых сыров, томатопродуктов, овощных, суповых и грибных консервов, а также молочных продуктов.

Известен (RU, патент 2374320, опубл. 10.07.2009) способ получения антибиотического комплекса LGS, характеризующийся тем, что проводят культивирование штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 284 - Коллекция микроорганизмов Московского государственного Университета им. М.В. Ломоносова продуцента низиноподобного целевого продукта в ферментационной среде, содержащей источник углерода, калий фосфорнокислый, магний сернокислый, хлористый натрий, изолейцин и дрожжевой автолизат в количестве, обеспечивающем биосинтез с последующим высушиванием культуральной жидкости, содержащей целевой продукт, и при необходимости разделение его на антибиотики LGS-B и LGS-H, в состав которого входит низиноподобный продукт.

Недостатком известного способа следует признать невозможность получения чистого низина.

Известен (RU, патент 2151796, опубл. 27.06.2000) способ получения низина. Согласно известному способу штамм Lactococcus lactis ВКПМ-В-7699 выращивали на питательной среде. В качестве питательной среды использовали гидролизованное молоко и молочную сыворотку. Приготовленное сухое обезжиренное молоко разводили водой до содержания сухих веществ 30 г/л, добавляли 20 г/л молочной сыворотки, кипятили, охлаждали до 45-50°C, доводили до pH 7,2-7,5 единиц, вносили мегатерии, растворенный в небольшом количестве теплой дистиллированной воды из расчета 0,5 г/л среды. Гидролиз проводили при температуре 50°C в течение 3 ч. По окончании гидролиза pH среды доводили до 7,0 единиц и стерилизовали 20 мин при 0,8 атм. Питательная среда может быть использована для качалочных колб и ферментеров различного объема. Регулирование pH среды в колбах и ферментерах производили добавкой 10% раствора гидроксида натрия. Активность образования низина штаммом Lactococcus lactis ВКПМ-В-7699 в периодическом режиме в колбах составила 10350 МЕ/мл.

Известный способ малопригоден для промышленной реализации.

Известен (SU, авт. св. 707320, опубл. 30.11.1981) способ производства низина. Согласно известному способу проводят выращивание продуцента низина на основе питательной среды, в состав которой входят молочная сыворотка и экстракт кормовых дрожжей, с последующей экстракцией низина из микробных клеток, отделение экстракта, его концентрирование, высаливание, фильтрацию и высушивание, причем очищенную культуральную жидкость концентрируют с сорбиталем С-20, фильтрацию осуществляют через фильтр - перлит, полученную пасту низин-перлит растворяют в соляной кислоте с последующей повторной фильтрацией, полученный концентрат высушивают путем напыления его на казеинат натрия.

Недостатком известного способа следует признать его сложность, а также низкий выход готового продукта.

Известный источник информации принят в качестве ближайшего аналога по объекту способ. Технологическая линия, применяемая при реализации данного способа, не раскрыта.

Техническая задача, решаемая посредством разработанного технического решения, состоит в обеспечении возможности промышленного получения низина с использованием отходов молочного производства.

Технический результат, достигаемый при реализации разработанного технического решения, состоит в разработке промышленного способа получения низина с одновременной утилизацией ранее не использованных отходов промышленного производства.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать разработанный способ производства низина. Согласно разработанному способу проводят культивирование продуцента низина в ферментере с использованием штамма-продуцента низина Lactococcus (Streptococcus) lactis с последующей экстракцией низина, причем в качестве компонентов питательной среды используют рассол после сушки молочной сыворотки, молочную сыворотку и ополоски, получаемые после мойки технологического оборудования на молочных предприятиях, а также, по меньшей мере, частично гидролизованные отходы зернохранилища, и мегатерии, культивирование проводят с использованием автоматического pH-статирования и термостатирования, экстракцию низина проводят подкислением с последующим выделением низина центрифугированием.

При реализации способа предпочтительно используют штамм Lactococcus lactis subsp. Lactis гибридный штамм F-116, коллекция Московского государственного университета им. В.М. Ломоносова, хотя возможно использование и других штаммов, в том числе и других культур, - продуцентов низина.

Рассол после сушки молочной сыворотки, используемый при реализации разработанного способа, обычно содержит до 9,0 г/дм³ минеральных солей. Состав указанного рассола достаточно известен (http://www.molz.ru/produkty-iz-molochnoi-syvorotki?page=11).

Используемая при реализации способа молочная сыворотка предпочтительно содержит не свыше 1,4% белка. Используемые ополоски, получаемые после мойки технологического оборудования на молочных предприятиях, предпочтительно содержат не свыше 0,2% белка. Состав их известен (http://www.molz.ru/tekhnologicheskie-tsikly-molochnogo-zavoda?page=6).

Общее содержание молочного белка в питательной среде преимущественно составляет не свыше 1,6%.

В процессе проведения подготовительных операций могут использовать питательную среду с содержанием, по меньшей мере, частично гидролизованных отходов зернохранилища, содержание питательных веществ в которых соответствует их количеству в 0,05 кг сухого дрожжевого экстракта.

Обычно используют питательную среду, содержащую 0,07-0,15% мегатерина.

В предпочтительном варианте реализации разработанного способа низин экстрагируют действием на культуральную жидкость раствором ортофосфорной кислоты при pH 2,4÷2,6 при перемешивании и последующем нагреве до 100°C, а ферментацию проводят, поддерживая в ферментере температуру 28±1°C и pH 6,8 при перемешивании со скоростью 180 об/мин.

Также указанный технический результат достигается при использовании технологической линии производства низина. Разработанная технологическая линия содержит ферментер со сферическим днищем и крышкой, снабженный барботером, рубашкой, мешалкой и системой автоматического pH-статирования и термостатирования, входы которого совмещены с системами подачи питательной среды и засевного материала, а выход по культуральной жидкости сообщен через блоки экстракции, центрифугирования, ультрафильтрации и нанофильтрации с блоком сушки препарата низин.

Указанный ферментер может дополнительно содержать средство взятия пробы культуральной жидкости.

В предпочтительном варианте реализации технологическая линия может дополнительно содержать участок подготовки питательной среды, а также участок подготовки засевного материала.

В предпочтительном варианте реализации разработанной технологической линии блок экстракции выполнен в виде термостатируемой емкости, снабженной мешалкой, блок сепарации выполнен в виде бактофуги, при этом линия может дополнительно содержать блок очистки низина, включающий установленные последовательно узел ультрафильтрации и узел нанофильтрации, подключенный к выходу по фугату блока сепарации.

Также в предпочтительном варианте реализации для промышленного использованя образующихся отходов производства линия может дополнительно содержать блок получения органо-минеральной добавки, подключенный к выходу по осадку блока сепарации, а также блок получения раствора молочной кислоты, подключенный пермеату к узлу нанофильтрации.

Разработанная технологическая линия для производства низина приведена на блок-схеме, при этом использованы следующие обозначения: блок 1 подготовки растворов соляной кислоты и гидроксида натрия, блок 2 гидролиза молочных продуктов, блок 3 введения культуры микроорганизмов, блок 4 приготовления маточных колб, блок 5 приготовления посевной питательной среды, блок 6 приготовления инокулянта, блок 7 приготовления посевного материала, блок 8 приготовления стерильной питательной среды, ферментер 9, блок 10 экстракции, центрифуга 11, блок 12 ультрафильтрации, блок 13 нанофильтрации, блок 14 сушки препарата низина, блок 15 упаривания пермеата, блок 16 нейтрализации и сушки твердой фазы центрифугирования, блок 17 осаждения лактата, блок 18 упаривания маточника лактата, блок 19 получения раствора молочной кислоты.

Процесс получения препарата низина состоит из следующих основных этапов:

- подготовка оборудования, получение стерильных растворов и сред;

- выращивание посевного материала;

- культивирование продуцента низина в ферментере с автоматическим pH-статированием и термостатированием;

- экстракция низина;

- отделение экстракта от клеток продуцента;

- утилизация отходов производства низина.

Разработанное техническое решение может быть реализовано следующим образом.

При подготовке стерильного воздуха исходный воздух подают централизованно из заводского воздушного коллектора, и в цехе проходит через теплообменник для подогрева воздуха, маслоотделитель и через систему удаления механических частиц поступает на места потребления. Фильтры и воздушный коллектор предварительно стерилизуют острым паром согласно инструкции.

При подготовке раствора щелочи операцию взвешивания и растворения сухого гидроксида натрия проводят при включенной вентиляции или в хорошо проветриваемом помещении, в средствах индивидуальной защиты. Растворение щелочи в воде сопровождается выделением большого количества тепла, что приводит к повышению температуры раствора, поэтому данную операцию проводят с соблюдением мер предосторожности, обязательных при работе с концентрированными щелочами.

В частности, для приготовления стерильного раствора щелочи готовят 10%-ный (мас./об.) раствор щелочи из сухого гидроксида натрия в количестве 12 л в 2-х стеклянных бутылях вместимостью 10 л или в одной вместимостью 15 л.

На весах в стеклянной или эмалированной посуде взвешивают 0,6 кг сухой гидроокиси натрия. В эмалированную 10 л емкость заливают 4 л воды, постепенно при постоянном перемешивании засыпают сухую гидроокись. После растворения объем раствора доводят до 6 л. Раствор щелочи переливают в бутыль для стерилизации. Аналогично готовят следующие 6 л раствора. Отливают 1 л раствора щелочи для использования на стадии приготовления питательной среды ТП 2.2.

Раствор стерилизуют при 0,8 ати в течение 30 мин. Стерильную щелочь используют для поддержания pH в процессе ферментации в ферментере.

Раствор фосфорной кислоты готовят в аппарате с мешалкой и охлаждением вместимостью 250 л путем разведения концентрированной 85%-ной фосфорной кислоты водой в соотношении 1:1 по объему: 25 л воды и 25 л концентрированной кислоты. В аппарат заливают 25 л воды и при перемешивании, через верхний люк постепенно вливают кислоту, в рубашку подают охлаждающую воду.

При проведении данной операции соблюдают все меры предосторожности, необходимые при работе с концентрированными кислотами: включенная вентиляция и средства индивидуальной защиты.

Раствор соляной кислоты готовят в емкости, устойчивой к действию соляной кислоты, снабженной датчиком pH. Данную операцию проводят в хорошо проветриваемом помещении или под тягой. При проведении данной операции соблюдают все меры предосторожности, необходимые при работе с концентрированными кислотами, в частности с соляной кислотой. К 180 л воды постепенно приливают концентрированную 36%-ную соляную кислоту до установления pH раствора 2,5.

Для получения инокулята проводят следующие операции.

Готовят 5 л суспензии 12%-ного (мас./об.) молока. Для этого взвешивают 600 г сухого молока и растворяют его в теплой воде 40-45°C. Суспензию молока разливают по 100 и 600 мл в стерильные колбы, вместимостью 250 и 2000 мл, соответственно, и стерилизуют в автоклаве при 0,5 ати (112°C) в течение 30 мин. После стерилизации молоко охлаждают до температуры 30°C и термостатируют при 30°C в течение 22-24 ч для проверки стерильности. Колбы, в которых молоко свернулось, отбраковывают. Молоко для размножения и масштабирования посевной культуры готовят заранее за 4-5 суток.

Навеску сухого дрожжевого экстракта 20 г растворяют в 100 мл теплой воды, раствор переливают в колбу вместимостью 250 мл и стерилизуют в автоклаве при 0,8 ати (117-118°C) в течение 30 мин.

Сухое молоко может быть заменено молочной сывороткой, рассолом от сушки молочной сыворотки, а также ополосками молочной промышленности, при этом содержание молочного белка должно соответствовать его содержанию в использованном сухом молоке.

Аналогично сухой дрожжевой экстракт может быть заменен, по меньшей мере, частично гидролизованными отходами зернохранилищ, содержание питательных веществ в которых соответствует их количеству в сухом дрожжевом экстракте.

Хранение полученной культуры осуществляют преимущественно в виде молочного сгустка в 12% обезжиренном стерильном молоке в условиях бытового холодильника при температуре 4-6°C или в сухом (лиофилизированном) виде в защищенной среде, содержащей, г/л, желатин - 140, сахарозу - 220, глютамат натрия - 44, цитрат натрия трехзамещенный - 500, в стеклянных ампулах, запаянных под вакуумом. Ампулы с культурой хранят в холодильнике при минус 10°C в течение 12 месяцев.

Пересев производят через 30 дней. Предпочтительно, по 1 мл сброженного этой культурой молока вносят в 10 мл стерильного 12% (мас./об.) обезжиренного молока с добавкой 0,1 мл дрожжевого экстракта из 20%-ного раствора. Затем термостатируют при 30°C в течение 18-20 ч до образования сгустка. Выросшую культуру хранят в холодильнике при температуре 5-7°C и используют для приготовления рабочей посевной культуры на стадии ТП 1.2. Культуру таким образом можно хранить и в большем объеме 100-1000 мл.

Для получения рабочей посевной культуры в предварительно простерилизованную колбу вместимостью 1 л вносят асептически 450 мл стерильного молока, приготовленного как указано ранее. Далее в колбу вносят 5 мл стерильного 20%-ного раствора дрожжевого экстракта и 45 мл культуры, выращенной предварительно, возраст которой не более 10 дней. Помещают в термостат на 30°C и выдерживают 18-20 ч до образования сгустка. На этой стадии также можно использовать рассол от сушки молочной сыворотки, саму молочную сыворотку, а также обмывки оборудования молочной промышленности в соответствующих количествах, определенных из расчета потребности в питательных элементах.

Для получения рабочей посевной культуры в 3 предварительно простерилизованные колбы вместимостью 2 л вносят асептически по 1,2 л стерильного молока, приготовленного ранее. Далее в колбы вносят по 12 мл стерильного 20%-ного раствора дрожжевого экстракта и по 120 мл свежевыросшей культуры, возраст которой не более 10 дней. Помещают в термостат на 30°C и выдерживают 18-20 ч до образования сгустка. Готовый инокулят в количестве 4 л асептически переносят в стерильную колбу с отводом.

Ферментацию проводят в ферментере с геометрическим объемом 70 л, имеющем перемешивающее устройство, обеспечивающее скорость перемешивания до 1000 об/мин, штуцер для подачи питательной среды, штуцер для подачи посевного материала, пробоотборник и линию для передачи культуральной жидкости из ферментера. Аппарат имеет автоматические системы контроля и поддержания pH и температуры.

Перед загрузкой ферментера производят его проверку на герметичность в соответствии с инструкцией, в случае выявления неисправностей их устраняют. После этого аппарат стерилизуют при 130°C в течение 1 ч согласно инструкции по использованию ферментера.

Ферментационную среду готовят ферментере, используя питьевую воду. Компоненты берут в расчете на объем среды 37,3 л.

Питательную среду готовят из рассола после сушки молочной сыворотки, молочной сыворотки и ополосок, получаемых после мойки технологического оборудования на молочных предприятиях, при этом содержание питательных элементов должно соответствовать их содержанию в смеси, содержащей, г/л:

К полученному составу добавляют фермент мегатерии в количестве 0,7-1,0 г/л

Сухой фермент взвешивают на лабораторных весах в количестве 26 г. Тщательно растворяют в теплой воде 40-45°C в объеме 500 мл в эмалированной емкости.

Сухие компоненты смеси взвешивают на весах, растворяют в эмалированной емкости в 7-10 л теплой - 40-45°C воды, тщательно перемешивают. Жидкие компоненты отмеряют с использованием мерительного оборудования и добавляют в указанную емкость. Суспензию переливают в аппарат через фильтрующий материал (марля). Доводят pH суспензии до 8,0, вводя ранее полученный 10%-ный раствор щелочи. Эта операция, как и все последующие, связанные с доведением pH, выполняется при постоянном перемешивании 70-100 об/мин.

В ферментере корректируют pH до 8,0 введением 10%-ного раствора NaOH, доводят питьевой водой объем до 37,3 л, нагревают до 50±1°C подачей пара в рубашку аппарата при постоянном перемешивании. После этого вносят фермент, перемешивают в течение 20-30 мин и проводят гидролиз в течение 2,5 ч, поддерживая постоянную температуру 50±1°C, подачей пара в рубашку. После окончания гидролиза среду быстро нагревают и начинают стерилизацию.

Среду стерилизуют, подачей пара в рубашку, выдерживая 25 мин при температуре 113-114°C. После окончания стерилизации среду охлаждают до 29±1°C подачей воды в рубашку. Необходимо обеспечить максимально быстрый нагрев до стерилизации и охлаждение среды после стерилизации. Это обязательное условие для получения качественной питательной среды.

В стерильной среде устанавливают pH 7,0 подачей насосом из стеклянной бутыли стерильного 10%-ного раствора NaOH, значение pH сверяют с контрольным pH-метром, температуру доводят до 28°C.

Колбу с инокулятом стерильно под факелом присоединяют к ферментеру через посевной штуцер. Далее перестальтическим насосом передавливают инокулят в ферментер при постоянном перемешивании.

Ферментацию ведут, поддерживая в ферментере температуру 28±1°C, избыточное давление, перемешивание 300 об/мин, постоянную величину pH 6,8. Поддержание постоянного уровня pH осуществляется автоматически системой pH-статирования, подачей стерильного 10%-ного раствора NaOH из стеклянной бутыли. В процессе ферментации каждый час отмечают температуру, pH, объем титранта потребленного в час (мл/ч), количество оборотов мешалки в минуту, избыточное давление в аппарате. Производят отбор проб на стерильность - в пустые стерильные пробирки: после стерилизации среды, после засева среды, через 7 ч от начала ферментации и после завершения ферментации - всего 4 пробы; на активность по 9,5 мл культуральной жидкости в пробирки с 0,5 мл соляной кислоты: каждый час, начиная через 2 ч после максимума титрования и до окончания ферментации, пробы хранят в холодильнике. Пробирки с кислотой готовят предварительно: в мерные пробирки вносят по 0,5 мл раствора соляной кислоты, разведенной 1:1 водой, закрывают резиновыми пробками и ставят отметку на уровне 10 мл.

Ферментацию останавливают, когда скорость титрования упадет до нуля. Продолжительность процесса ферментации примерно 12-14 ч.

Ферментацию проводят в аппарате с геометрическим объемом 1 м³, имеющим перемешивающее устройство, обеспечивающее до 180 об/мин, рубашку с подводом пара и холодной воды, люк для подачи питательной среды, штуцер для подачи посевного материала, пробоотборник и линию для передачи культуральной жидкости из ферментера,. Аппарат снабжен автоматической системой контроля и поддержания pH.

Перед загрузкой ферментера производят его проверку на герметичность в соответствии с инструкцией, в случае выявления неисправностей их устраняют. После этого аппарат стерилизуют при 130°C в течение 1 ч.

Ферментационную среду готовят, используя питьевую воду. Компоненты берут в расчете на объем среды 505 л.

Питательную среду готовят из рассола после сушки молочной сыворотки, молочной сыворотки и ополосок, получаемых после мойки технологического оборудования на молочных предприятиях, при этом содержание питательных элементов должно соответствовать их содержанию в смеси, содержащей, г/л:

Сухие компоненты смеси взвешивают на весах, растворяют в эмалированной емкости теплой - 40-45°C воды, тщательно перемешивают. Жидкие компоненты отмеряют с использованием мерительного оборудования и добавляют в указанную емкость. Суспензию переливают в аппарат через фильтрующий материал (марля). Доводят pH суспензии до 8,0, вводя ранее полученный 10%-ный раствор щелочи. Эта операция, как и все последующие, связанные с доведением pH, выполняется при постоянном перемешивании 70-100 об/мин.

Загрузочную линию и ферментер начинают стерилизовать за 1 ч до окончания гидролиза среды. Стерилизацию ведут при 131±1°C в течение 1 ч. После окончания стерилизации отключают подачу пара на загрузочную линию и в ферментер. Ферментер сразу же охлаждают подачей воды в рубашку, при падении давления в аппарате до 0,7±0,2 ати подают стерильный воздух для поддержания избыточного давления 0,5 ати.

После окончания гидролиза среду быстро передают в стерильный ферментер через фильтрующий материал (марля) и сразу начинают стерилизацию подачей пара в рубашку. Режим стерилизации - выдержка в течение 25 мин при температуре 113-114°C. Необходимо обеспечить максимально быстрый нагрев до стерилизации и охлаждение среды после стерилизации. Это обязательное условие для получения качественной питательной среды.

В стерильной среде устанавливают pH 7,0 подачей ранее приготовленного 10%-ного стерильного раствора NaOH, значение pH сверяют с контрольным pH-метром, температуру доводят до 28°C, сбрасывают избыточное давление, отключают перемешивание.

Ранее полученный посевной материал по посевной линии стерильно под факелом вносят в ферментер через посевной штуцер. Далее штуцер закрывают, включают мешалку, устанавливают избыточное давление в аппарате 0,5 ати подачей стерильного воздуха.

Ферментацию ведут, поддерживая в аппарате температуру 28±1°C, pH 6,8 подачей стерильного 10%-ного раствора NaOH по стерильной линии, при перемешивании 180 об/мин. В процессе каждый час отмечают температуру, pH, количество щелчков на счетчике прибора pH-статирования, давление в ферментере. Ферментацию останавливают, когда скорость титрования упадет до 1/3 от максимального количества щелочи, потребленной в час. Производят отбор проб на стерильность - в пустые стерильные пробирки: после стерилизации среды, после засева среды, через 7 ч от начала ферментации и после завершения ферментации - всего 4 пробы; на активность по 9,5 мл культуральной жидкости в пробирки с 0,5 мл соляной кислоты: каждый час, начиная через 2 ч после максимума титрования и до окончания ферментации, пробы хранят в холодильнике. Пробирки с кислотой готовят предварительно: в мерные пробирки вносят по 0,5 мл раствора соляной кислоты, разведенной 1:1 водой, закрывают резиновыми пробками и ставят отметку на уровне 10 мл.

Концентрация низина в культуральной жидкости 7000-7500 МЕ/мл. Продолжительность процесса ферментации 8-10 ч. Культуральная жидкость предается на стадию экстракции.

После окончания процесса ферментации культуральную жидкость (КЖ) закисляют до конечного pH 2,5 раствором фосфорной кислоты. Затем КЖ нагревают через рубашку (или одновременно подачей пара в аппарат) до 100°C и выдерживают в течение 10 мин. Охлаждают до 30°C подачей в рубашку холодной воды и передают на стадию сепарации (центрифугирования). Операцию осуществляют при перемешивании 180 об/мин.

После экстракции культуральную жидкость 700 л сепарируют на бактофуге. Скорость подачи КЖ со стадии экстракции определяют экспериментально по качеству фугата, добиваясь получения наиболее чистой от клеток жидкости. Качество оценивают визуально. Фугат собирают в аппарат ультрафильтрации. Осадок собирают в блоке нейтрализации и сушки.

В предпочтительном варианте реализации разработанного технического решения фугат, содержащий целевой продукт - низин, последовательно пропускают через блок ультрафильтрации, блок нанофильтрации, а также установку сушки препарата низина, при этом в качестве блока ультрафильтрации может быть использовано оборудование, применяемое при переработке молока и молочных продуктов, в качестве блока нанофильтрации может быть также может использовано оборудование для молочной промышленности, а для сушки может быть применено оборудование, предназначенное для получения сухого молока.

К блоку нейтрализации и сушки кроме выхода бактофуги по осадку могут быть подключены через блок осаждения лактата кальция и блок упаривателя маточника блок упаривателя пермеата, подключенный к выходу по пермеату блока нанофильтрации. На выходе блока нейтрализации и сушки отходов получают органо-минеральную добавку для корма скота и птицы.

Выход по осадку блока осаждения лактата кальция может быть подключен к входу блока получения раствора молочной кислоты.

Разработанные технология и технологическая линия обеспечивают промышленное производство низина, а также переработку в полезные продукты получаемые в производстве низина отходы.