СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УСНИНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЗ ТАЛЛОМОВ ЛИШАЙНИКОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПРЕДЭКСТРАКЦИОННОЙ МЕХАНОХИМИЧЕСКОЙ ОБРАБОТКИ

Изобретение относится к биотехнологической промышленности и может использоваться для производства препаратов противомикробного действия.

Использование механохимической стадии в технологическом цикле получения усниновой кислоты из талломов лишайников на стадии обработки сухого сырья и последующей водно-спиртовой экстракции позволяют выделить более 90% усниновой кислоты, содержащейся в исходном сырье.

Техническим эффектом изобретения является получение усниновой кислоты, обладающей выраженным антибактериальным действием против грамположительных и микобактерий (туберкулезная палочка), включая штаммы, устойчивые к другим видам антибиотиков (Cocchietto, et al., 2002; Lauterwein et al., 1995; Stoll et al., 1950). В связи с этим препараты на основе усниновой кислоты нашли свое применение в медицине как противомикробные средства для обработки ран и ожогов (Машковский, 2005). Эффект достигается тем, что использование механохимической обработки лишайникового сырья в присутствии щелочи приводит к переводу водонерастворимой формы усниновой кислоты в водорастворимое состояние.

Сущность изобретения состоит в том, что предэкстракционная механохимическая обработка сухих талломов лишайников с добавлением сухой щелочи позволяет переводить плохо растворимую в воде и водно-спиртовых смесях усниновую кислоту в хорошо растворимый в водно-спиртовых смесях фенолят (уснинат натрия, рис.).

Аналогом предлагаемому способу получения усниновой кислоты является метод, описанный в патенте «Способ получения усниновой кислоты» (RU 2317076), который основан на экстракции усниновой кислоты из воздушно-сухого сырья хлороформом, четыреххлористым углеродом, ацетоном, гексаном, петролейный эфиром, нефрасом и их смесями при кипячении, с последующей перекристаллизацией. Недостатком данного способа является использование токсичных и легко воспламеняющихся органических растворителей, что может создать дополнительные трудности при организации технологического цикла получения усниновой кислоты.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ получения препарата, содержащего в составе усниновую кислоту, с широким спектром фармакологического действия «ЯГЕЛЬ-М», реализуемый путем механохимической обработки талломов лишайников в присутствии сильной щелочи с последующей водно-спиртовой экстракцией (патент RU 2385159). Отличием предложенного нами способа является получение сухого порошка, содержащего до 93,3-98,5% по массе усниновой кислоты.

Изобретение может быть реализовано следующим образом. Высушенные талломы лишайников, содержащие усниновую кислоту (например, Cladonia stellaris), подвергают предэкстракционной механохимической обработке на шаровой мельнице (например, АГО-3) в присутствии сильной щелочи при скорости вращения ротора 1800 об/мин в течение двух минут для перевода усниновой кислоты в растворимую форму уснината (см. рис.). Для этого в каждый стальной стакан объемом 2 л помещалось по 2.5 кг стальных шариков с d=0.5 см, 142.5 г воздушно-сухих талломов лишайников и 7.5 г сухого гидрооксида натрия.

Полученный высокодисперный порошок экстрагировали 50%-ной водно-этанольной смесью в соотношении 1:20 по массе в течение 14 суток при температуре 20-25°С.

Экстракт центрифугировали при 4000g в течение 10 мин, надосадочную жидкость фильтровали для удаления из нее нерастворившейся взвеси и сливали в отдельную емкость. Для исчерпывающего извлечения уснината натрия проводили повторную экстракцию 50%-ным этанолом, после чего полученные экстракты объединяли.

Для перевода уснината натрия обратно в усниновую кислоту рН-среды фильтрата доводили лимонной кислотой до значения ≈6.0, после чего водно-этанольную смесь отгоняли при помощи роторного испарителя до ≈20% от исходного объема. Этанол после вакуумной перегонки (регенерация этанола) не требовал дополнительной очистки и использовался для повторных экстракций. В полученном водном концентрате выпадал желтый осадок, который отделяли центрифугированием при 4000g в течение 10 мин, после чего проводили высушивание осадка на воздухе до порошкообразного состояния.

Для определения содержание усниновой кислоты в полученном порошке брали навеску массой 0.01 г и растворяли в 100 мл ацетонитрила. Полученный раствор пропускали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Анализ проводили методом ВЭЖХ на микроколоночном хроматографе Милихром А-02 фирмы «ЭкоНова» (Россия) с последующей компьютерной обработкой результатов исследования, используя программу «МультиХром для «Windows».

Разделение проводили на обращено-фазовой колонке ProntoSIL 120-5-С18 AQ размером 2×75 мм. В качестве оптимальных были выбраны условия: подвижная фаза «А» - 0.1% водный раствор уксусной кислоты, «В» - ацетонитрил, градиентный режим элюирования с возрастанием доли «В» от 10 до 50% в течение 5 мин и от 50 до 100% в течение 20 мин при скорости потока 100 мкл/мин и температуре колонки 40°С. Объем вносимой пробы - 4 мкл. Детектирование осуществляли с помощью сканирующего УФ-спектрофотометрического детектора при длинах волн 230, 240, 260 и 280 нм. Длина волны 230 нм была взята в качестве опорной и аналитической, так как на нее приходится максимум поглощения усниновой кислоты.

В качестве стандарта использовали усниновую кислоту производства Sigma-Aldrich. Стандартные образцы готовили в концентрациях 6.25, 12.5, 25.0, 50.0, 100.0 и 200.0 мкг/мл в ацетонитриле. Построение калибровочных графиков проводили на основе линейной регрессии площади пиков усниновой кислоты и ее концентраций. Идентификацию усниновой кислоты в исследуемых образцах проводили путем сопоставления времен удерживания и спектральных отношений пиков аналита и стандарта.

Для определения содержания усниновой кислоты в исходном лишайниковом сырье на примере Cladonia stellaris брали навеску из измельченных воздушно-сухих талломов лишайников массой 0.1 г и экстрагировали в 10 мл ацетонитрила при постоянном перемешивании в течение 24 ч и комнатной температуре, после чего полученный экстракт пропускали через мембранный фильтр и анализировали по вышеописанной методике.

Проведенный анализ исходного лишайникового сырья на примере Cladonia stellaris показал, что содержание в нем усниновой кислоты составляет 1.1% от сухой массы талломов, что можно считать теоретически возможным выходом продукта. Использование предложенного нами способа получения усниновой кислоты дало выход 11.4 г продукта с содержанием 90-95% усниновой кислоты в пересчете на 1 кг сырья, то есть практический выход усниновой кислоты составил 93-98% от содержащейся в исходном сырье.