СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТВЕРДОГО ЭКСТРАКТА, ОБОГАЩЕННОГО УСНИНОВОЙ КИСЛОТОЙ, ИЗ СЛОЕВИЩ ЛИШАЙНИКА РОДА "Cladonia"

Изобретение относится к области биологии, в частности к области биотехнологии, микробиологии и может быть использовано в фармацевтической промышленности и ветеринарии. Способ реализуется путем обработки слоевищ лишайников рода Cladonia диоксидом углерода в субкритическом состоянии, при этом экстракт, содержащий усниновую кислоту, может быть получен сразу в твердом виде в одну технологическую стадию.

Усниновая кислота - желтое кристаллическое вещество с остовом дибензофурана обладает высокой активностью по отношению ко многим патогенным организмам вирусной, бактериальной и грибковой природы, благодаря своим свойствам используется в косметике, стоматологии и других областях медицины [Д.Н. Соколов, О.А. Лузина, Н.Ф. Салахутдинов. Усниновая кислота: получение, строение, свойства и химические превращения / Успехи химии. 2012. Т 81(8). С. 747-768]. Известно около 70 видов лишайников, содержащих усниновую кислоту. Однако промышленное значение могут иметь только те из них, в которых количество этой кислоты составляет не менее 0,5%. Перспективным источником усниновой кислоты является род лишайника Cladonia, в котором это соединение является основным метаболитом.

Способы получения усниновой кислоты основаны на экстракции лишайникого сырья различными органическими растворителями (бензолом, ацетоном, хлороформом, петролейным эфиром). По способу, описанному в [Моисеева Е.Н. Биохимические свойства лишайников и их практическое значение. Изд. АН СССР, 1961, с. 43-47], лишайник экстрагируется бензолом. Бензол удаляется, сухой экстракт лишайника обрабатывается хлороформом, хлороформный экстракт упаривается, остаток обрабатывается холодным спиртом. Выпавшие кристаллы усниновой кислоты далее еще раз растворяют в горячем хлороформе и высаживают холодным спиртом и эфиром. Таким образом, процедура извлечения усниновой кислоты из экстракта многостадийная, а достигаемый выход целевого продукта составляет всего 0,66% от исходного сырья.

В работе [А.с. СССР 833255, МКИ³ А61K 35/82. Способ получения усниновой кислоты, БИ №20, 1981] выход целевого продукта также невысок - 0,76%. Способ заключается в экстрагировании лишайника бензолом, удаления бензола, обработки сухого остатка хлороформом, после чего извлеченная из экстракта усниновая кислота очищается с использованием силикагеля. Сначала загрязненная усниновая кислота в растворе наносится на силикагель, растворитель удаляется, а целевой продукт элюируется с силикагеля на колонке смесью бензол-хлороформ. Такой многоступенчатый способ очистки с использованием силикагеля не является технологичным и будет затруднять выделение больших количеств усниновой кислоты.

Приведенный в работе [А.с. RU 2317076, МПК А61K 31/343 от 20.02.2008. Способ получения усниновой кислоты, авторы Половинка М.П., Салахутдинов Н.Ф., Панченко М.Ю.] способ получения усниновой кислоты из лишайников заключается в экстрагировании органическими растворителями (хлороформ, четыреххлористый углерод, ацетон, гексан, петролейный эфир, нефрос и их смесь). Выделение проводят путем упаривания органического растворителя и осаждения из экстракта в системе хлороформ - спирт (1:10) или гексана. Изобретение позволяет повысить выход целевого продукта до 0,99-2,44%, но при этом сохраняет все ранее перечисленные недостатки.

В работе [Патент №2318407. Российская Федерация. Способ получения водки, обладающей пониженным токсическим и наркотическим эффектом. Кершенгольц Б.М., Журавская А.Н., Ремигайло П.А., Шеин А.А., Шашурин М.М., Кершенгольц Е.Б. 32006100978/13, заявл. 10.01.2006, опубл. 10.03.2008] показано, что при обработке водки комплексом биологически активных веществ (БАВ), выделяемых диоксидом углерода в состоянии суперкритической жидкости из слоевищ лишайников рода Cladonia, основу которого составляют амино-β-олигосахариды (до 75 мас. %), снижается ее токсическое и наркотическое действие, при этом упоминается, что в состав БАВ входит природный антибиотик - усниновая кислота и ее производные. При этом авторы для получения экстрактов используют в качестве экстрагента только сверхкритический диоксид углерода, содержание в полученных экстрактах усниновой кислоты не приводится.

Недостатком приведенных способов получения экстрактов лишайника является либо их невысокий выход относительно исходного сырья, либо невысокое содержание самой усниновой кислоты в полученном экстракте.

Наиболее близким аналогом предлагаемого изобретения (прототипом) является изобретение [Патент №2358750 Фармацевтические композиции на основе лишайника бородатого (Usnea Barbata) и зверобоя обыкновенного (Hypericum Perforatum) и их применение]. Согласно изобретению для создания фармацевтической композиции используют СО₂-экстракт лишайника Usnea Barbata, причем одним из компонентов подобного экстракта является усниновая кислота. Экстракты лишайника содержат от 2 до 7 масс. % усниновой кислоты. В качестве основного недостатка прототипа можно отметить низкое содержание усниновой кислоты в экстрактах не более 7 масс. %. Наряду с диоксидом углерода, находящимся в сверхкритическом состоянии, в качестве экстрагента может быть использован субкритический диоксид углерода. Особенностью экстракции с применением субкритического диоксида углерода является проведение процесса таким образом, что один из параметров состояния системы (температура или давление), не превышает критического значения.

Сущность настоящего изобретения состоит в том, что воздушно-сухое сырье (слоевища лишайника рода Cladonia), предварительно очищенное от механических примесей, истирают на лабораторной мельнице или в фарфоровой ступке. Далее подготовленное сырье используют для экстракции диоксидом углерода в субкритическом состоянии.

Предлагаемое изобретение может быть реализовано следующим образом.

Подготовленное сырье помещают в сосуд высокого давления и непрерывно пропускают через него диоксид углерода в субкритическом состоянии, поддерживая заданные параметры процесса: давление и температуру. Температура экстрагента составляет 20°C. Избыточное давление в системе поддерживается на уровне 70 атм. Скорость подачи диоксида углерода составляет 0,1 кг/час. Удельный расход диоксида углерода составляет 100 кг/кг исходного сырья. Продолжительность экстракции составляет не менее 10 минут. Отбор экстракта происходит непрерывно. Отобранный диоксид углерода, насыщенный растворенными компонентами, подвергают декомпрессии в отдельном устройстве (сосуде) с отделением экстракта в твердом виде. Диоксид углерода после последующего сжатия может быть использован повторно. Полученный экстракт содержит до 85% усниновой кислоты. Выход усниновой кислоты от массы а.с. лишайникового сырья составляет 1%.

Пример, подтверждающий возможность реализации заявляемого способа

Подготовленное сырье (слоевища лишайника рода Cladonia) помещали в экстрактор. Экстракцию диоксидом углерода в субкритическом состоянии проводили при температуре 20°C, давлении 70 атм. Удельный расход диоксида углерода - 100 кг/кг исходного сырья. Скорость подачи диоксида углерода - 0,1 кг/час. Продолжительность экстракции - 10 минут. Экстракт подвергали декомпрессии и анализировали содержание в нем усниновой кислоты методом ВЭЖХ. Установлено, что в экстракте содержится 85% усниновой кислоты, что соответствует выходу усниновой кислоты 1,02% от а.с. сырья.

Таким образом, экстракт, получаемый из слоевищ лишайников рода Cladonia с использованием CO₂ в субкритическом состоянии, содержит до 85% усниновой кислоты и характеризуется ее высоким выходом относительно сырья - 1%. Кроме того, в получаемых в достаточно мягких условиях экстрактах отсутствуют тяжелые металлы и остатки растворителей. Преимуществом использования субкритического CO₂ в качестве экстрагента является также снижение энергетических затрат на повышение давления и нагрев CO₂, кроме того более мягкие условия процесса способствуют сохранению биологической активности выделяемых БАВ.