СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ ДИАТОМОВОЙ ВОДОРОСЛИ Cylindrotheca closterium

Изобретение относится к биотехнологии микроводорослей и может быть использовано при промышленном получении биомассы диатомовой водоросли Cylindrotheca closterium.

Микроводоросль С. closterium является ценным сырьем для получения биологически активных веществ. Она содержит в достаточном количестве полиненасыщенные жирные кислоты (40% от общего содержания жирных кислот) и каротиноиды, что предполагает возможность ее массового культивирования. Содержание фукоксантина в клетках составляет 78% от общего количества каротиноидов (Das et al., 2008; Peng et al., 2011). Известно, что фукоксантин обладает антиоксидантными, антимутогенными и антиканцерогенными свойствами, которые обусловливают его антиокислительное действие (Kotake-Nara et al., 2001; Das et al., 2008). Благодаря этим ценным качествам биомасса Cylindrotheca closterium широко применяется в мировой практике в качестве кормовых добавок для двустворчатых моллюсков.

Известен способ (см. Guillardet al., 1963), в котором микроводоросль С. closterium культивировали на питательной среде F/2 с содержанием NaNO₃ - 7,5 мг·л^-1; NaH₂PO₄×2H₂O - 5 мг·л^-1; Na₂SiO₃×9H₂O - 30 мг·л^-1; Na₂EDTA - 4,36 мг·л^-1; FeSO₄×7H₂O - 3,15 мг·л^-1 в колбах объемом 125 мл при освещенности 240 мк·моль·фотон·м^-2·с^-1 и температуре 27°С в накопительном режиме культивирования (Kingston, 2009). При таких условиях культивирования зафиксирована максимальная плотность культуры (2,94±0,02)^.10⁶ клеток на 1 мл.

Известен способ, в котором культуру С.closterium выращивали на питательной среде F/2 (Guillard et al., 1963) с содержанием NaNO₃ - 7,5 мг·л^-1; NaH₂PO₄×2H₂O - 5 мг·л^-1; Na₂SiO₃×9H₂O - 30 мг·л^-1; Na₂EDTA - 4,36 мг·л^-1; FeSO₄×7H₂O - 3,15 мг·л^-1 в колбах объемом 200 мл при различных уровнях освещенности: при высоком уровне - 268 мк·моль·фотон·м^-2·с^-1 и при низком уровне - 27 мк·моль·фотон·м^-2·с^-1 и температуре 15°С в накопительном режиме культивирования (Rijstenbil, 2003). При высоком уровне освещения зафиксирована максимальная плотность культуры (5±0,02)·10⁵ клеток на 1 мл.

Наиболее близким к заявляемому по технической сущности является способ выращивания Cylindrotheca closterium на питательной среде F (Guillard, Ryther, 1963) с содержанием NaNO₃ - 150 мг·л^-1; NaH₂PO₄×2H2O - 10 мг·л^-1; Na₂SiO₃×9H₂O - 60 мг·л^-1; Na₂EDTA - 8,72 мг·л^-1; FeSO₄×7H₂O - 6,3 мг·л^-1 в колбах объемом 250 мл при освещенности 180 мк·моль·фотон·м^-2·с^-1 и температуре 20°С в накопительном режиме культивирования (Affan et al., 2009). При таких условиях культивирования зафиксированы максимальная плотность культуры (7,2±0,02)·10⁴ клеток на 1 мл и выход биомассы 1,6 г сухого вещества на 1 л культуры. Недостаток данного метода заключается в получении небольшого количества биомассы культуры Cylindrotheca closterium из-за использования питательной среды F, обедненной биогенными элементами.

В основу изобретения «Способ культивирования диатомовой водоросли Cylindrotheca closterium» поставлена задача увеличения выхода биомассы культуры микроводоросли путем увеличения скорости роста и накопления биомассы Cylindrotheca closterium.

Поставленная задача достигается тем, что культуру диатомовой водоросли Cylindrotheca closterium выращивают на модифицированной питательной среде (табл. 1). Модификация заключается в увеличении концентрации всех биогенных элементов среды соответственно представлениям о субстрат зависимом росте микроорганизмов в культуре (Тренкеншу, 2010 а, б). Показано, что использование обедненной стандартной питательной среды F для интенсивного культивирования С. closterium с целью накопления биомассы нецелесообразно. Но при увеличении концентрации биогенных элементов (см. Фиг. 1) угол наклона накопительной кривой повышается, т.е. продуктивность культуры в начальный момент времени зависит от концентрации биогенных элементов в среде. Максимальное значение плотности культуры (8·10⁶ кл.·мл^-1) в стационарной фазе роста, так же, как и продуктивность, прямо пропорционально зависит от концентрации биогенных элементов в среде.

Выращивание осуществляется при круглосуточном освещении 13,5 клк в накопительном режиме в культиваторах с рабочей толщиной освещаемого слоя 2 и 5 см. При таких условиях культивирования выход биомассы микроводоросли С.closterium составляет 6,98 г сухого вещества на 1 л культуры в культиваторе с рабочей толщиной освещаемого слоя 2 см и 4,94 г сухого вещества на 1 л культуры в культиваторе с рабочей толщиной освещаемого слоя 5 см (см. Фиг. 1 и Фиг. 2).

Общим для прототипа (Affan et al., 2009) и заявляемого способа является применение накопительного режима культивирования. Основное отличие от прототипа заключается в том, что в заявляемом способе при культивировании используется питательная среда, обогащенная макро и микроэлементами, количественный состав которой авторами был подобран в результате экспериментов.

Способ поясняется иллюстрациями. Фиг. 1 - Динамика плотности накопительной культуры С. closterium при различной концентрации биогенных элементов в питательной среде, выращенной в культиваторе с рабочей толщиной освещаемого слоя 5 см. Фиг. 2 - Динамика плотности накопительной культуры С.closterium при различной концентрации биогенных элементов в питательной среде, выращенной в культиваторе с рабочей толщиной освещаемого слоя 2 см.

Способ культивирования одноклеточной диатомовой водоросли С.closterium реализуется следующим образом.

Для культивирования использовалась диатомовая водоросль С.closterium, коллекционное хранение которой осуществлялось на питательной среде F/2 при температуре 20-21°С. Для получения инокулята культуру водоросли в течение 5-7 дней выращивают методом накопительной культуры на среде F, в которой концентрации всех биогенных элементов увеличены в пять раз (5F) при освещении 6 клк. при непрерывном барботаже воздухом (1 л·мин^-1·л^-1 культуры).

Для засева культиваторов используют активно делящуюся культуру, взятую на линейной стадии роста, когда ее продуктивность максимальна. Суспензию клеток вносят в культиваторы из такого расчета, чтобы начальная плотность культур составляла не менее 0,1-0,2 г сухого вещества на 1 л культуры. Процесс культивирования осуществляют на модифицированной питательной среде (табл. 1).

Пример 1

Для культивирования использовали штамм из коллекции культур микроводорослей отдела экологической физиологии водорослей ИМБИ им. А.О. Ковалевского РАН.

Для получения инокулята штамм в течение 7 суток выращивали методом накопительной культуры в колбах объемом 1 л при освещении 6 клк на питательной среде F, в которой концентрации всех биогенных элементов увеличены в пять раз (5F). Полученную культуру использовали в качестве инокулята. Культуру переносили в культиваторы плоскопараллельного типа объемом 3 л c рабочей толщиной слоя 5 см, содержащие модифицированную питательную среду (табл. 1), и продолжали выращивать в течение 7 суток при освещении 13,5 клк и непрерывном барботаже воздухом со скоростью 1 л·мин^-1·л^-1 культуры, и при температуре 20-21°С до плотности 5 г сухой биомассы на 1 л культуры. Выход сухой биомассы в стационарной фазе роста составил 5 г на 1 л культуры.

Пример 2

Для культивирования использовали штамм из коллекции культур микроводорослей отдела экологической физиологии водорослей ИМБИ им. А.О. Ковалевского РАН.

Для получения инокулята штамм в течение 7 суток выращивали методом накопительной культуры в колбах объемом 1 л при освещении 6 клк на питательной среде F, в которой концентрации всех биогенных элементов увеличены в пять раз (5F). Полученную культуру использовали в качестве инокулята. Культуру переносили в культиваторы плоскопараллельного типа объемом 2 л с рабочей толщиной слоя 2 см, содержащие модифицированную питательную среду (табл. 1), и продолжали выращивать в течение 10 суток при освещении 13,5 клк и непрерывном барботаже воздухом со скоростью 1 л·мин^-1·л^-1 культуры, и при температуре 20-21°С до плотности 7 г сухой биомассы на 1 л культуры. Выход сухой биомассы в стационарной фазе роста составил 7 г на 1 л культуры.

Таким образом, продуктивность по биомассе в известном способе в 25 раз ниже, чем в предлагаемом способе.

Источники информации

1. Тренкеншу Р.П. Простейшие модели роста микроводорослей. 5. Скорость энергообмена // Экология моря. - 2010 а. - Спец. вып. 80: Биотехнология водорослей. - С. 79-84.

2. Тренкеншу Р.П. Простейшие модели роста микроводорослей. 6. Предельные скорости роста // Экология моря. - 2010 б. - Спец. вып. 80: Биотехнология водорослей. - С. 85-91.

3. Affan А., Нео S-.J., Jeon Y-.J., Lee J.-В. Optimal growth conditions and antioxidative activities of Cylindrotheca closterium // J. Phycol. - 2009. - 45. - P. 1405-1415.

4. Das, S.K., Hashimoto, Т., Kanazawa, K. Growth inhibition of human hepatic carcinoma HepG2 cells by fucoxanthin is associated with down regulation of cyclin D // Biochim. Biophys. Acta. - 2008. - 4. - P. 743-749.

5. Guillard, R.R., Ryther, J.H. Studies on marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Husted and Detonula confervacea (Cleve) Cran // Can J. Microbiol. - 1963. -8. - P. 229-239.