Результат интеллектуальной деятельности: СРОЧНАЯ ФЛЮОРЕСЦЕНТНАЯ ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА МЕТАСТАТИЧЕСКОГО ПОРАЖЕНИЯ ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛОВ

Изобретение относится к лабораторной диагностике, а именно к интраоперационному исследованию раковых клеток в лимфатических узлах с использованием эпителиального маркера.

Причин гиподиагностики при срочном иммунофлюоресцентном исследовании лимфатических узлов несколько. Основные из них связаны с тем, что исследуются не все удаленные лимфатические узлы. И в этой ситуации надо искать «золотую середину»: недостаточно исследовать 1-2 лимфатических узла, но и значительное увеличение срочно исследуемых лимфатических узлов из-за ограниченности времени также может привести к ошибкам. На наш взгляд, оптимальным может быть исследование 5 лимфатических узлов.

Второй причиной ошибок является наличие микрометастазов, эту ошибку преодолеть очень трудно. Необходимо брать соскобы со всей поверхности разрезанного по длиннику лимфатического узла и обязательно из подкапсульной зоны. Неправильный забор материала из разволокненных или мелких неразрезанных лимфатических узлов - частая причина неадекватности оценки состояния лимфатических узлов.

Известен способ мультиплексной детекции опухолевых клеток с использованием панели агентов, связывающихся с внеклеточными маркерами. К образцу добавляют панель меченых агентов, которые связываются с двумя или более маркерами, экспрессируемыми на поверхности клетки, где по меньшей мере один из агентов является специфичным к раку и где панель содержит: один или нескольких агентов, связывающихся с ракспецифичными маркерами, экспрессируемыми на поверхности раковой клетки толстой кишки, где один агент или один из агентов является агентом, связывающимся с СА 19-9, и один или нескольких агентов, связывающихся с тканеспецифичными маркерами, которые являются эпителиальными и/или мезенхимальными экспрессируемыми на поверхности клетки, где один агент или один из агентов является агентом, связывающимся с Ер-САМ. Набор, содержащий один или несколько агентов, связывающийся с внеклеточными ракспецифичными маркерами, где один агент или один из агентов является антителом или фрагментом антитела, связывающимся с СА 19-9, и один или нескольких агентов, связывающихся с внеклеточными тканеспецифичными маркерами, которые являются эпителиальными маркерами и/или мезенхимальными маркерами, где один агент или один из агентов является антителом или фрагментом антитела, связывающимся с Ер-САМ (RU 2489720 С2).

Однако известный способ диагностики занимает много времени и является дорогостоящим, т.к. для исследования используют несколько маркеров.

Самым близким к заявляемому является иммунный гистохимический реагент для обнаружения лимфатических метастазов рака молочной железы. Указанный реагент представляет собой флуоресцентный краситель или HRP-меченого антитела, препарат антитела или антитела-HRP - флуоресцентный краситель-меченых комплексов, титр был измерен путем смешивания конфигурации меченого антитела (CN 1945333 А 20070411).

Однако известный способ диагностики предполагает обнаружение только метастазов рака молочной железы и не предназначен для более широкого исследования.

Задачей изобретения является разработка надежного и быстрого метода диагностики метастатического поражения лимфатических узлов, а также снижение себестоимости данного вида исследования.

Указанная задача достигается тем, что для получения клеточной суспензии клеточный материал помещают в питательную среду накопления, состоящую из раствора: Хенкса, реоплиглюкина и альбумина, смешанную в равных количествах, хорошо перемешанную клеточную суспензию вносят по 100 мл на дно каждой пробирки, добавляют 5 мкл моноклонального антитела Ber ЕР4 FITC и перемешивают 5 с, после этого материал инкубируют 20 мин в холодильнике при t° 2-8 C, полученную взвесь клеток распределяют по 50-100 мкл в контейнеры центрифуги и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, полученные препараты окрашивают ядерным флюоресцентным красителем и осуществляют флюоресцентную микроскопию.

Изобретение поясняется подробным описанием, клиническими примерами и иллюстрацией, на которой изображено: микрометастаз рака молочной железы в лимфатический узел. Экспрессия эпителиального маркера Вег-ЕР4 FITS. Флюоресцентная иммуноцитохимия (Ув.×1000).

Объектом цитологического исследования служат интраоперационные соскобы с поверхности разреза лимфатического узла либо тонкоигольные аспирационные биоптаты лимфатических узлов. Соскобы и отпечатки с удаленных лимфатических узлов готовит цитолог. Обязательными условиями адекватного исследования лимфатических узлов являются продольные многоступенчатые разрезы и соскоб со всей поверхности лимфатического узла. Пункцию лимфатических узлов осуществляет хирург.

Соскобы получают с лимфатического узла скальпелем или ребром и углом предметного стекла с последующим равномерным распределением полученного материала на втором предметном стекле.

Все мазки, приготовленные из лимфатических узлов, окрашивают азур-эозиновыми смесями методом срочной интраоперационной окраски.

Для успешного применения ФИЦХ необходимо соблюдение нескольких условий: полнота клинических сведений и достаточное количество опухолевых клеток - оптимально не менее 200 клеток в одном препарате.

С целью выявления опухолевых клеток применяют эпителиальный антиген Ber-EP4 FITC. Данный антиген представляет молекулу адгезии эпителиальных клеток и состоит из двух гликопротеинов молекулярной массой 34 и 39 кД, которые находятся преимущественно на поверхности клеточной мембраны почти всех эпителиальных клеток за исключением некоторых видов плоского эпителия, гепатоцитов, проксимальных отделов эпителия почечных канальцев, желудочных париетальных и миоэпителиальных клеток. Неизмененный мезотелий и элементы лимфатического узла Ber-EP4-отрицательны. Ber-EP4 является маркером клеток эпителиальной природы, его экспрессия отмечается в клетках широкого спектра новообразований эпителиального происхождения, включая мелкоклеточные, недифференцированные раки и нейроэндокринные опухоли.

Для ФИЦХ-исследования лучше использовать жидкостные препараты, приготовленные с помощью центрифуги Cytospin 3, что позволяет получить монослой клеток, обеспечивает сохранность клеточных структур, снижает содержание в препарате элементов воспаления, концентрирует клеточные элементы на ограниченном участке, что экономит дорогостоящие реактивы.

Для получения жидкостных препаратов клеточный материал после пункции или соскоба лимфатических узлов помещают в специальную питательную среду (раствор Хенкса, реоплиглюкин и альбумин, смешивается в равных количествах) накопления, находящуюся в микропробирке (800 мкл).

Затем в случае исследования лимфатических узлов взвесь клеток распределяют по 50-100 мкл в контейнеры центрифуги Cytospin 3 и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин. Контроль качества проводят окрашиванием двух цитоспиновых препаратов методом срочной интраоперационной цитологической окраски. При наличии в мазках достаточного количества клеточного материала (200-300 клеток) проводят ФИЦХ-исследование.

Срочную флюоресцентную иммуноцитохимическую диагностику (ФИЦХ) метастатического поражения лимфатических узлов выполняют следующим образом.

Материалом для проведения срочной флюоресцентной иммуноцитохимиии являются клеточные суспензии различных лимфатических узлов. Клеточный материал после пункции или соскоба лимфатических узлов помещают в специальную питательную среду накопления, находящуюся в микропробирке (800 мкл), для получения клеточной суспензии. Хорошо перемешанную клеточную суспензию вносят по 100 мл на дно каждой пробирки, добавляют 5 мкл моноклонального антитела Ber ЕР4 FITC (эпителиального маркера) и перемешивают 5 с на вортексе. Материал инкубируют 20 мин в темноте в холодильнике (2-8°C). В процессе инкубации происходит реакция взаимодействия поверхностных антигенов со специфическим антителом Ber-EP4 FITC, меченным соответствующим флюорохромным красителем с образованием комплексов антиген+антитело. Затем взвесь клеток распределяют по 50-100 мкл в контейнеры центрифуги Cytospin 3 и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин. Полученные препараты окрашивают ядерным флюоресцентным красителем Dapi, после чего осуществляют микроскопию полученных препаратов.

Оценка полученных результатов

При добавлении к клеточной суспензии моноклональных антител Ber-EP4 FITC, коньюгированных с флюорохромами, происходит связывание их с поверхностными антигенами клеток, возбуждение флюоресценции и последующая ее регистрация при длине волны 488 нм (в спектре Green) ФИЦХ-реакция оценивается качественно. При проведении реакции с эпителиальным антигеном Ber-EP4 FITC наблюдаем окрашивание мембраны клетки рака (зеленое свечение). При оценке ФИЦХ-реакции принимают во внимание интенсивность и полноту окрашивания. Были отмечены некоторые особенности экспрессии эпителиального маркера Ber-EP4 FITS, выявляемые при флуоресцентной микроскопии. Характерной особенностью является хорошо выраженная четкая мембранная реакция в виде секреторных вакуолей, которые располагаются на поверхности клетки иногда в виде своеобразного кружева. Иногда наблюдается отрыв цитоплазмы в виде секреторных вакуолей. Такой характер экспрессии характерен для клеток аденогенного рака (Фиг.1) Наличие таких клеток не вызывает сомнений в их эпителиальной природе. Для предотвращения гипердиагностики метастазов рака в лиматические узлы следует учитывать, что макрофагальные элементы, присутствующие в лимфатических узлах или экссудате, захватывают частицы красителя и выглядят как светящиеся включения в цитоплазме.

В отделении МНИОИ им. П.А. Герцена методом ФИЦХ исследовано 70 лимфатических узлов: 19 - при раке молочной железы, 7 - при перстневидноклеточном раке желудка, 5 - при аденокарциноме кишки, 2 - при серозном раке яичников, 12 - при плоскоклеточных раках, 14 - при аденокарциноме легкого, 6 - при раке щитовидной железы, 1 - при раке простаты, 1 - при раке мочевого пузыря, 1 - при раке поджелудочной железы, 2 - при неопухолевых заболеваниях.

Экспрессия эпителиального маркера Ber-EP4 отмечена в 12 наблюдениях при раке молочной железы.

Из 7 исследованных лимфатических узлов при перстневидноклеточном раке желудка опухолевые клетки выявлены в 6.

При аденокарциноме кишки метастазы рака с помощью ФИЦХ установлены в 5 наблюдениях.

В 14 наблюдениях у пациентов при раке легкого (12 - низкодифференцированными аденокарциномами, 2 - мелкоклеточным раком) подтверждены метастазы рака. Дифференциальный диагноз проводился с лимфомами и гиперплазированными лимфатическими узлами.

Клетки серозного рака яичников установлены в двух наблюдениях, причем опухолевые клетки были немногочисленными.

В 5 наблюдениях при раке щитовидной железы был подтвержден метастатический характер процесса.

При 12 плоскоклеточных раках различных локализаций (гортань, шейка матки, носоглотки) в 10 случаях подтверждены метастазы рака, причем в 2 случаях клетки были малочисленны. В одном случае при низкодифференцированном плоскоклеточном инвазивном раке шейки матки с тотальным ее поражением методом ФИЦХ обнаружены немногочисленные клетки рака в лимфатическом узле, гистологически не подтверждены.

В 1 наблюдении при раке простаты, 1 - мочевого пузыря, 1 - поджелудочной железы подтверждены метастазы рака.

В 2 случаях установлен саркоидоз и туберкулез - Ber-EP4 FITS не экспрессировался.

Клинические примеры

Клинический пример 1

Больная М. 42 года. Клинический диагноз - рак молочной железы справа. По данным УЗИ - рак правой молочной железы, подозрение на наличие метастазов рака в лимфатические узлы правой подмышечной области. Во время операции на молочной железе проводилось срочное цитологическое исследование сигнального лимфатического узла правой подмышечной области. Лимфатический узел разрезали по длиннику несколько раз (в виде «книжки»). Соскобы брали со всей поверхности лимфатического узла. При интраоперационном цитологическом исследовании методом световой микроскопии соскобов, взятых из лимфатического узла, было дано заключение о гиперплазии лимфатического узла с синус-гистиоцитозом. Часть клеточного материала соскоба поместили в специальную питательную среду накопления в микропробирку, содержащую 800 мкл питательной среды. К взвеси клеток добавляли эпителиальный маркер Ber-EP4 FITS и оставляли на 20 мин в темном месте для прохождения флюоресцентной иммуноцитохимической реакции. Затем взвесь клеток распределяли по 50-100 мкл в контейнеры центрифуги системы Cytospin (Shandon, UK) и центрифугировали в режиме 1000 об/мин в течение 5 мин. Готовили жидкостные цитологические препараты. Для визуализации ядер клеток препараты окрашивали DAPI. Микроскопию осуществляли на флуоресцентном микроскопе Imager M1 фирмы «Karl Zeiss».

При проведении нтраоперационной флюоресцентной иммуноцитохимии с эпителиальным маркером Ber-EP4 в этом лимфатическом узле были обнаружены клетки рака с положительной экспрессией эпителиального маркера, что определили при исследовании с помощью флюоресцентного микроскопа. В метастатических лимфатических узлах в спектре эмиссии FITC (520-524 нм) хорошо видна мембранная экспрессия эпителиального маркера Ber-EP4 на клетках рака. Отмечается четкая выраженная мембранная реакция, характеризующая экспрессию эпителиального маркера Ber-EP4 FITS, выявляемая при флуоресцентной микроскопии на клетках метастаза рака молочной железы. Диагноз - метастаз умереннодифференцированного протокового рака молочной железы, что было подтверждено последующим гистологическим исследованием, где был обнаружен микрометастаз рака молочной железы.

Клинический пример 2

Больная П., 64 года. Клинический диагноз - рак молочной железы слева. По данным УЗИ - рак левой молочной железы, подозрение на наличие метастазов рака в лимфатические узлы левой подмышечной области. Во время операции на молочной железе проводилось срочное цитологическое исследование сигнального лимфатического узла левой подмышечной области. Лимфатический узел разрезали по длиннику несколько раз (в виде «книжки»). Соскобы брали со всей поверхности лимфатического узла. При интраоперационном цитологическом исследовании методом световой микроскопии соскобов, взятых из лимфатического узла, было дано заключение о подозрении на метастаз рака в лимфатический узел. Часть клеточного материала соскоба поместили в специальную питательную среду накопления в микропробирку, содержащую 800 мкл питательной среды. К взвеси клеток добавляли эпителиальный маркер Ber-EP4 FITS и оставляли на 20 мин в темном месте для прохождения флюоресцентной иммуноцитохимической реакции. Затем взвесь клеток распределяли по 50-100 мкл в контейнеры центрифуги системы Cytospin (Shandon, UK) и центрифугировали в режиме 1000 об/мин в течение 5 мин. Готовили жидкостные цитологические препараты. Для визуализации ядер клеток препараты окрашивали DAPI. Микроскопию осуществляли на флуоресцентном микроскопе Imager M1 фирмы «Karl Zeiss». При проведении интраоперационной флюоресцентной иммуноцитохимии с эпителиальным маркером Ber-EP4 в этом лимфатическом узле не было обнаружено клеток рака, что определили при исследовании с помощью флюоресцентного микроскопа. Диагноз - гиперплазированный лимфатический узел с синус-гистиоцитозом, что было подтверждено последующим гистологическим исследованием.

Применение предлагаемой диагностики в МНИОИ им. П.А. Герцена показало, что ФИЦХ является новым надежным и быстрым методом диагностики метастатического поражения лимфатических узлов. Особенно перспективно применение этого метода при срочных интраоперационных исследованиях лимфатических узлов, так как не требует сложной предподготовки материала и значительных временных затрат: исследование занимает 20 минут. Эпителиальный маркер Ber-EP4 является гликопротеином и находится на поверхности клеточной мембраны. ИЦХ-реакция прямая: флуорохром непосредственно коньюгирован с антителом. Все это способствует сокращению времени инкубации антитела с антигеном и применению эпителиального маркера Ber-EP4 в срочной интраоперационной диагностике экссудатов и метастазов рака в лимфатические узлы.

Таким образом, показана высокая эффективность и быстрота ФИЦХ при срочных интраоперационных исследованиях лимфатических узлов с целью установления распространенности опухолевого процесса.