Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОЧИСТКИ ДЕСМОПРЕССИНА (ВАРИАНТЫ)

Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности и медицины.

Болезнь Виллебранда - общее наследственное кровоточащее нарушение, вызванное количественными или качественными расстройствами фактора Виллебранда, липкого гликопротеида, обычно находимого в плазменных, эндотелиальных клетках, субэндотелиальном пространстве, мегакариоцитах и тромбоцитах. Фактор Виллебранда участвует в первичном и вторичном гемостазе, способствует спайке тромбоцитов к пострадавшему субэндотелию и участвует в скоплении тромбоцитов, особенно при состояниях высоких ломающих воздействий. Он также служит как защитный курьер для плазменного фактора VIII (ФVIII). Поэтому дефекты фактора при болезни Виллебранда могут вызвать кровотечение и выражены фенотипично низкими плазменными уровнями активности коагулянта VIII (FVIII:C) и длительным временем кожного кровотечения (ВТ), по крайней мере, в наиболее тяжелых и клинически очевидных случаях.

Основными средствами, используемыми для лечения спонтанного кровотечения и для предотвращения кровотечения во время хирургических процедур, являются десмопрессин и полученные из плазмы концентраты фактора коагуляции.

Десмопрессин (DDAVP) - синтетический аналог антидиуретического гормона вазопрессина. Это хорошо переносимое и удобное гемостатическое лекарственное средство, которое может использоваться при многих клинических состояниях с геморрагическим диатезом. Препарат выпускают в концентрированных формах для подкожного и интраназального применения, которое может быть удобно для домашнего лечения.

Для применения в медицине и для медико-биологических исследований необходимы гомогенные высокоочищенные препараты. Поэтому исследователи в данной области большое внимание уделяют разработке новых эффективных способов очистки гормональных препаратов.

Патент SU 1747456 A1, 15.07.1992, касается способа очистки синтетического [8-аргинин]вазопрессина. Сущность решения состоит в очистке на колонке при использовании в качестве носителя сополимера 1-винил-2- пирролидона с N.N-диметакроилгексаметилендиамином.

Патент US 5500413 описывает способ производства десмопрессина, который включает стадию очистки с помощью ионообменной хроматографии на катионообменной смоле, уравновешенной кислотой.

Патент US 20060148699 раскрывает способ синтеза пептидов в твердой фазе с использованием катионоамидной смолы с последующими двумя этапами очистки для получения чистого десмопрессина.

ЕР 0710243 (A1) раскрывает способ получения и очистки циклических пептидов, имеющих дисульфидный фрагмент в одну операцию обработки, что упрощает синтез и снижает производственные затраты, но обеспечивает высокий выход чистого пептида путем прямой ионообменной хроматографии.

В качестве ближайшего аналога может быть указана международная заявка WO 2010119450 (А2), которая относится к способу получения 1-дезамино-8-D-аргинин вазопрессина (десмопрессина) или его фармацевтически приемлемых солей, а также к способу очистки десмопрессина или его фармацевтически приемлемых солей. Процесс очистки десмопрессина осуществляется методом ВЭЖХ, на колонке С-18 или С-8 типа Novasep с обратной фазой. Очистка сырого десмопрессина осуществляется градиентным методом, путем элюирования с градиентом, состоящим из буфера А: вода/уксусная кислота и буфера Б: метанол/ уксусная кислота. Очищенные объединенные фракции десмопрессина затем подвергают испарению для удаления растворителя метанола.

Концентрированные чистые объединенные фракции, полученные таким образом, лиофилизируют.

При получении десмопрессина образуется ряд примесей, влияющих на конечную эффективность препарата, такие как эпимеры и соединения с неполностью удаленной ацетамидометильной защитой с одной из двух тиольных групп (примеси «hvost-l» и «hvost-2»). Способом по прототипу возможно удаление эпимеров, однако примеси с защищенными группами плохо отделяются методом ВЭЖХ.

Задача настоящего изобретения в разработке усовершенствованного нового метода очистки десмопрессина.

Для решения задачи предлагается два варианта способа очистки десмопрессина.

Первый вариант включает растворение десмопрессина-сырца в 0,2-2% растворе уксусной кислоты, фильтрование, предварительную очистку методом жидкостной хроматографии низкого давления (ЖХ НД) на колонне с сорбентом, представляющим сильносшитый сополимер стирола с дивинилбензолом с размером 75-150 микрон, марки LPS-500, элюцию водным раствором, содержащим 5-15% изопропилового спирта и 0,2-2% уксусной кислоты, упаривание, очистку методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖК(ACN)) на колонне со сферическим силикагелем типа Vydac Denali C₁₈, элюирование ацетонитрилом, упаривание и лиофильную сушку.

Предварительную очистку проводят сорбентом LPS-500. Данный сорбент активно применяется для сорбционной очистки флавоноидов, пептидов, белков, лекарственных субстанций и радиоактивных изотопов, имеет площадь поверхности 700-800 м/г, объем пор 1,5-1,8 мл/г, размер пор 50-500 Å.

Окончательную очистку проводят с помощью Grace Vydac Denali С₁₈ колонки, которая содержит сорбент нового поколения на основе кремния 120 Å мономерного С₁₈. Ранее лучший мономерный С₁₈ сорбент имел диапазон углеродного покрытия от 2,8 до 3,6 мкмоль/м². Денали С18 имеет покрытие в количестве 4 мкмоль/м², что приближается к теоретическому пределу площади поверхности.

Возможно проведение дополнительной фильтрации перед очисткой на установке проточной ультрафильтрации с мембранами 100 кДа.

Второй вариант включает растворение десмопрессина-сырца в 0,2-2% растворе уксусной кислоты, фильтрование, предварительную очистку методом жидкостной хроматографии низкого давления (ЖХ НД) на колонне с сорбентом типа LPS-500, элюцию водным раствором, содержащим 5-15% изопропилового спирта и 0,2-2% уксусной кислоты, очистку методом жидкостной хроматографии низкого давления (ЖХ НД) на колонне с СПС-био Сульфопропил (SPS-Bio), элюируют водным раствором ацетата аммония очистку методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ(ACN)) на колонне с сферическим силикагелем типа Vydac Denali С₁₈, элюирование ацетонитрилом, упаривание и лиофильную сушку.

Полимерные гидрофильные сорбенты СПС-Био Сульфопропил представляют собой сшитый полиакрилат с сульфопропильными группами с емкостью ионных групп 2.0-2.5 мэкв/г. Используются для хроматографической очистки белков и являются российскими аналогами популярных зарубежных сорбентов: Sepharose FF, Toyopearl 650, Fractogel EMD. Имеют более высокую микробиологическую и гидролитическую устойчивость и пропускную способность.

Возможно проведение дополнительной фильтрации перед очисткой на установке проточной ультрафильтрации с мембранами 100 кДа.

Возможность осуществления изобретения продемонстрирована нижепредставленными примерами.

Пример 1

Взвешивание, отбор архивного образца и ВЭЖХ-анализ десмопрессина-сырца

Емкость с десмопрессином-сырцом взвешивают на технических весах с точностью до 0,1 г.

Порции сырца, поступившие в разных банках, чаще всего отличаются между собой (по содержанию в них десмопрессина и примесей, по цвету, по растворимости). По этой причине выполняют ВЭЖХ анализ каждой поступившей партии сырца.

Для приготовления испытуемого раствора в пластиковую пробирку с завинчивающейся крышкой объемом 50 мл помещают навеску 40-50 мг десмопрессина-сырца, взвешенную на аналитических весах с точностью до 1 мг, заносят значение в таблицу «Сырец». Добавляют по весу тысячекратное количество «50 мМ водный раствор KH₂PO₄, рН 3.0» (Приложение 4.2.2) с точностью 0,1 г. Например, если навеска десмопрессина-сырца составляла 45,8 мг, то добавляют 45,8 г «50 мМ водный раствор KH₂PO₄, рН 3.0». При этом получается раствор с концентрацией 1,0 мг/мл. После этого пробирку несколько раз встряхивают и на 10-15 мин помещают в ультразвуковую баню при 35°C до получения гомогенного прозрачного раствора.

Затем одноразовым шприцем отбирают около 1 мл раствора, фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм в виалу (для аналитического хроматографа) объемом 1,5 мл, закрывают крышкой, снабженной прокладкой, маркируют виалу в соответствии с маркировкой банки, например «DES12-01-AF».

Приготовленный испытуемый раствор анализируют с помощью ВЭЖХ (метод Plat_grad_DES.lcm на колонке Platinum Rocket C18 100А 7×53 мм) и с помощью СВЭЖХ (метод Kinetex_grad_DES(MeOH) 1 см на колонке Kinetex С18 300А 2.6 мкм 3×100 мм), результаты анализа заносят в электронный журнал (таблица «Сырец») и определяют содержание десмопрессина в партии сырца (в процентах и по весу). См. хроматограмму 1 на фиг. 1. Если при анализе десмопрессина-сырца на колонке Kinetex C18, 100А, 2.6 мкм, 3×100 мм примесь "hvost-1"<0,5% относительно пика десмопрессина и содержание «hvost-2»<2%, то очистка предпочтительно проводится способом по варианту 1. Если "hvost-1">0,5% относительно пика десмопрессина или содержание «hvost-2»>2%, то очистка предпочтительно проводится способом по варианту 2.

Растворение и фильтрование

Приготовляют раствор «0,6% уксусной кислоты (УК)» из расчета 1,2 л на 100 г сырца. В емкость на 5 л наливают «0,6% УК» из расчета 1,0 л на 100 г десмопрессина-сырца, но не более 4 л. При перемешивании на магнитной мешалке прибавляют десмопрессин-сырец порциями по 20-40 г (столовая ложка), затем перешивают при комнатной температуре в течение 1 ч. В ходе растворения следует периодически измерять с помощью индикаторной бумаги рН раствора сырца. В случае если значение рН выше 5, следует понизить его, добавляя уксусную кислоту (порциями по 10 мл на стакан с последующей проверкой рН).

Если в результате образуется прозрачный раствор (желтого или коричневого цвета), то его фильтруют через стеклянный фильтр пор. 3, проложив дно стеклянного фильтра фильтровальной бумагой, в колбу Бунзена. При фильтровании раствор десмопрессина-сырца пенится. Необходимо фильтровать с осторожностью, не допуская переброса пены в вакуумные шланги.

Если в результате образуется мутный или опалесцирующий раствор, то проводят осветление раствора на установке проточной ультрафильтрации «Pellicon» с мембранами на 100 кДа.

Фильтруемый раствор циркулирует с помощью перистальтического насоса под давлением 1,3-1,8 атм над фильтрами и прошедший фильтрат собирается в емкость. После прохождения через фильтрующие элементы более 0,8 исходного объема раствора, его разбавляют очищенной водой до 0,5 исходного объема и продолжают фильтрацию. Разбавление повторяют три раза. В последний раз фильтрование ведут до конца (давление в системе самопроизвольно возрастает до 2,0 атм). Полученный фильтрат (в 2,5-3 раза больше по объему, чем исходный раствор) не содержит видимых механических включений.

Фильтрующие элементы тщательно промывают очищенной водой и 0,1 М раствором гидроксида натрия в очищенной воде.

К отфильтрованному раствору добавляют изопропиловый спирт (ИПС) до концентрации 2% по объему и тщательно перемешивают.

Предварительная очистка десмопрессина-сырца с помощью жидкостной хроматографии низкого давления на колонне с LPS-500

Выбор колонны зависит от количества сырца. При этом учитывают нагрузку на сорбент (количество грамм сырца на литр сорбента). Оптимальное значение - 50-60 г сырца на литр сорбента. При меньших значениях колонна остается недогруженной, при этом в результате разделения получают излишне разбавленный раствор. При больших значениях происходит перегрузка колонны, ухудшается разделение.

200-400 г сырца разделяют на колонне №1 (150×320 мм, 5,6 л, 75-150 мкм).

400-700 г сырца разделяют на колонне №3 (150×480 мм, 8,5 л, 75-150 мкм).

700-1300 г сырца разделяют на колонне №5 (200×530 мм, 16,6 л, 60 мкм).

Уравновешивание колонны

Готовят 20 л «2,0% ИПС и 0,6% УК». При необходимости по мере расходования готовят дополнительные количества.

Подсоединяют колонку №3 к K-Prime II и открывают верхний (входной) и нижний (выходной) краны.

Уравновешивают колонну с LPS-500 раствором «2,0% ИПС и 0,6% УК». Наносят раствор десмопрессина-сырца на колонну с LPS-500.

Элюируют десмопрессин с колонки LPS-500. Для этого готовят 60 л «8% ИПС и 0,6% УК». Подсоединяют емкость с «8% ИПС и 0,6% УК» к входному каналу. Открывают кран питающей линии, которая опущена в «8% ИПС и 0,6% УК», при этом другим краном перекрывают линию нанесения раствора десмопрессина-фильтрата. Запускают выполнение метода.

При первом разделении при достижении показания детектора 1 AU начинают сбор фракций, при этом используются только 1 и 2 каналы коллектора фракций:

- 1-5 фракция по 1,5 л,

- 6 - последующие фракции - 3 л.

После того как относительное содержание «hvost-2» превысит 50% или величина mAU опустится ниже 0,1 AU, сбор фракций прекращают, выполнение метода разделения останавливают (кнопка «Стоп»).

Фракции, в которых чистота десмопрессина по хроматограмме <50% или концентрация десмопрессина <0,5 г/л, отбрасывают. Объединенные фракции упаривают на роторном испарителе Buchi Rotavapor R220 до концентрации примерно 100 г/л и направляют на ВЭЖХ высокого давления.

Колонку с LPS-500 промывают «80% ИПС и 2% УК» (15-25 л, момент окончания промывки определяют по детектору и визуально по исчезновению окраски сорбента).

Очистка десмопрессина с помощью ВЭЖХ на колонне Grace 101mm с Vydac Denali.

Окончательную очистку десмопрессина-сырца выполняют на хроматографической установке высокого давления AZURA (Knauer, Германия).

Подготовка к процессу ВЭЖХ на Grace 101mm. Готовят водный раствор «12% ацетонитрила (ACN) и 0,25% уксусной кислоты УК» из расчета: 15 л элюента на одно разделение. Подключают к переключателю потока насоса А, вход 1.

Готовят водный раствор «50% ACN и 0,25% УК» из расчета: 1,3 л элюента на одно разделение. Подключают к переключателю потока насоса В, вход 2.

Уравновешивают колонну «12% ACN и 0,25% УК».

Переключают кран инжектора в положение «Inject», промывают насос ASM2.1 уравновешивающим раствором «12% ACN и 0,25% УК» с расходом 20 мл/мин. При этом собирают выходящий элюент в мерный цилиндр на 50 мл. Промывают до тех пор, пока расход не стабилизируется.

Переносят входной капилляр насоса ASM2.1 в емкость с раствором десмопрессина.

С помощью насоса ASM2.1 вводят в колонку объем раствора, содержащий 20 г десмопрессина.

Процесс ВЭЖХ-очистки. Первое разделение

Наносят десмопрессин. Около 20 мин (±4 мин), когда показание детектора достигнет 200 mAU, начинают собирать фракции сначала по 0,25 л, после прохождения максимума интенсивности в районе 23 мин - по 0,5 л до 40 мин, далее собирают последнюю градиентную фракцию.

Собранные фракции анализируют с помощью ВЭЖХ. При отборе проб на анализ из фракций, собранных при показании детектора от 50 до 200 раствор разбавляют в 2 раза, от 200 до 1000 в 5 раз, от 1000 до 1500 в 10 раз, свыше 1500 в 20 раз. Фракции с чистотой десмопрессина менее 75% или концентрацией менее 1,8 мг/мл отбрасывают.

Для оставшихся фракций производят расчет возможности их объединения в «Целевые фракции ВЭЖХ».

- Для этого по формуле определяют суммарную чистоту (Р) при последовательном добавлении к фракциям с содержанием десмопрессина не менее 98,5% менее чистых фракций (где mi - масса десмопрессина в i фракции, pi - процентное содержание десмопрессина в i фракции):

- Для тех примесей, содержание которых хотя бы в одной из объединяемых фракций превышает 0,5% перед объединением производят расчет суммарного содержания этих примесей (А) после возможного объединения фракций по формуле (где Si - площадь пика примеси в i фракции, Vi - объем фракции, di - разбавление пробы, ai - процентное содержание примеси в i фракции):

Объединяют фракции, для которых в «Целевой фракции ВЭЖХ» Р>98,5% и содержание единичных пиков<0,5%.

Последующие ВЭЖХ-разделения

Момент начала сбора фракций при последующих разделениях определяют на основании результатов первого разделения таким образом, чтобы начало сбора 3 фракции при последующих разделениях соответствовало времени начала сбора первой фракции, попавшей в «Целевые», при первом разделении. Сбор 1 фракции начинают на 2 минуты раньше начала сбора третьей фракции. Таким образом:

- 1 фракция (слив) - 1 минута (0,25 л);

- 2 фракция (по результатом анализа ее определяют либо в «утилизируемый отход - предпик», либо в «целевые») - 1 минута (0,25 л);

- 3 фракция (целевая) - до показания детектора 100 mAU

- 4 фракция («утилизируемый отход - хвост»)- момент резкого увеличения интенсивности сигнала до показания детектора 20 mAU (около 3 мин)

Фракции последующих разделений объединяют (соответственно, «Утилизируемый отход - предпик» - пластиковая канистра на 3 л, «целевые фракции ВЭЖХ» - пластиковая канистра на 10 л, «Утилизируемый отход - хвост» - пластиковая канистра на 5 л) и хранят в холодильнике до упаривания. По мере накопления 9-10 л «целевых фракций ВЭЖХ» их анализируют с помощью ВЭЖХ (Метод Yupi_grad_DES.lcm). Если содержание "hvost-l"<0,5%, упаривают до концентрации 10-15% по массе и подвергают повторной ВЭЖХ-очистке на колонне GRACE 101 мм.

С помощью насоса А вводят в колонку объем раствора, содержащий 20 г десмопрессина.

Концентрирование десмопрессина

После очистки с помощью ВЭЖХ (HPLC) и упаривания до примерной концентрации 20 г/л возможно проведение концентрирования с целью удаления избыточного количества уксусной кислоты из смеси. Для этого готовят раствор для разделения на HPLC.

Подготовка к процессу концентрирования с помощью ВЭЖХ.

Готовят водный раствор «3,0% ACN и 0,25% УК» из расчета: 10 л элюента на одно концентрирование. Подключают к переключателю потока насоса А, вход 1.

Приготовляют «25% ACN и 0,25% УК» из расчета 7 л на одно разделение. Подключают к переключателю потока насоса В, вход 1.

Уравновешивают колонну «3% ACN и 0,25% УК».

В емкость с раствором десмопрессина погружают до дна снабженный фильтром входной капилляр. Подключают к переключателю потока насоса А, вход 2. Устанавливают время нанесения 100 г десмопрессина при F=200 мл/мин. Наносят рассчитанный объем раствора десмопрессина на колонну.

Процесс концентрирования с помощью ВЭЖХ

Сбор 1 фракции начинается с начала метода элюирования. Сбор второй фракции- с момента, когда показание детектора достигнет 500 mAU, до тех пор, пока показание детектора не уменьшится до 200 mAU.

Все собранные фракции анализируют с помощью HPLC. При отборе проб на аналитику из фракций, собранных при показании детектора до 300, раствор не разбавляют, от 300 до 1000 - разбавляют в 5 раз, от 1000 до 2000 в 10 раз, свыше 2000 в 20 раз.

Фракции с содержанием десмопрессина менее 75% отбрасывают. Для оставшихся фракций производят расчет возможности их объединения в «Целевые фракции ВЭЖХ».

Для этого по формуле определяют суммарную чистоту (Р) при последовательном добавлении к фракциям с содержанием десмопрессина не менее 98,5% менее чистых фракций (где mi - масса десмопрессина в i фракции, pi - процентное содержание десмопрессина в i фракции):

- Для тех примесей, содержание которых хотя бы в одной из объединяемых фракций превышает 0,5%, перед объединением производят расчет суммарного содержания этих примесей (А) после возможного объединения фракций по формуле (где Si - площадь пика примеси в i фракции, Vi - объем фракции, di - разбавление пробы, ai - процентное содержание примеси в i фракции):

Объединяют фракции, для которых в «Целевой фракции ВЭЖХ» Р>98,5% и содержание любых единичных пиков <0,5%.

Фракции последующих разделений объединяют («концентрированные фракции ВЭЖХ» - пластиковая емкость на 10 л) и хранят в холодильнике до упаривания.

По мере накопления 9-10 л «концентрированных фракций ВЭЖХ» их анализируют с помощью ВЭЖХ и упаривают до примерной концентрации 15 г/л. В конце серии промывают колонну «50% ИПС».

Упаривание и лиофилизация

Целевые фракции упаривают на вакуумном испарителе Buchi Rotavapor R220 при температуре бани не выше 40°C до концентрации примерно 100-200 г/л.

Разливают в предварительно взвешенные грушевидные колбы на 2-3 л, маркируют и лиофилизуют.

Лиофилизованную субстанцию десмопрессина хранят в укупоренных колбах в морозильной камере (-19°C).

Пример 2

Взвешивание, отбор архивного образца и ВЭЖХ-анализ десмопрессина-сырца

и Растворение и фильтрование

Как по примеру 1.

Предварительная очистка десмопрессина-сырца с помощью жидкостной хроматографии низкого давления на колонне с LPS-500 (на примере колонны №2).

Уравновешивание колонны

Готовят 20 л «2,0% ИПС и 0,6% УК». При необходимости по мере расходования готовят дополнительные количества.

Подсоединяют колонку №2 к K-Prime II и открывают верхний (входной) и нижний (выходной) краны.

Уравновешивают колонну с LPS-500 раствором «2,0% ИПС и 0,6% УК». Наносят раствор десмопрессина-сырца на колонну с LPS-500.

Элюируют десмопрессин с колонки LPS-500. Для этого готовят 60 л «8% ИПС и 0,6%о УК». Подсоединяют емкость с «8% ИПС и 0,6% УК» к входному каналу. Открывают кран питающей линии, которая опущена в «8% ИПС и 0,6% УК», при этом другим краном перекрывают линию нанесения раствора десмопрессина-фильтрата. Запускают выполнение метода.

При первом разделении при достижении показания детектора 1 AU начинают сбор фракций, при этом используются только 1 и 2 каналы коллектора фракций:

- 1-5 фракция по 1,5 л,

- 6 - последующие фракции - 3 л.

После того как относительное содержание «hvost-2» превысит 50% или величина mAU опустится ниже 0,1 AU, сбор фракций прекращают, выполнение метода разделения останавливают (кнопка «Стоп»).

Фракции, в которых чистота десмопрессина по хроматограмме <50% или концентрация десмопрессина <0,5 г/л, отбрасывают. Объединенные фракции упаривают на роторном испарителе Buchi Rotavapor R220 до концентрации примерно 100 г/л и направляют на ИОХ на СПС-био (SPS-био).

Колонку с LPS-500 промывают «80% ИПС и 2% УК» (15-25 л, момент окончания промывки определяют по детектору и визуально по исчезновению окраски сорбента).

Ионообменная хроматография низкого давления на колонне, упакованной СПС-био (SPS-bio)

Объединенные фракции после предварительной очистки на LPS-500 подвергают очистке на хроматографической установке K-Prime-II с помощью ионообменной хроматографии на колонне, упакованной СПС-био. Уравновешивают колонну 20 л «0,6% УК». Подсоединяют колонну №2 к K-Prime II, открывают верхний (входной) и нижний (выходной) краны, подставляют под выходные трубки коллектора фракций сливную емкость объемом 10 л. Уравновешивают колонну с SPS-bio «0,6% УК». Наносят раствор десмопрессина на колонну с SPS-bio (70 мкм, 4.2L, 150×240 мм).

После завершения процесса нанесения емкость из-под раствора обмывают 5 л очищенной воды, наносят этот раствор на колонну. В режиме ручного управления насосом прокачивают очищенную воду через колонну до тех пор, пока показания кондуктометра на выходе из колонны не опустятся ниже 1 мСм.

Элюируют десмопрессин с колонки СПС-био. Для этого готовят 5 л концентрата «4,0 М ацетат аммония». Готовят 30 л «0,2М NH40Ac». При достижении показания детектора АТ-5 (254 нм) 1 AU начинают сбор фракций по 3 л. По мере сбора фракции анализируют с помощью ВЭЖХ (используем метод Kinetex_grad_DES(MeOH).l cm (Shimadzu Nexera2). При отборе проб на аналитику из фракций, собранных при показании детектора ниже 2, раствор не разбавляют, от 2 до 3 раствор разбавляют в 2 раза, от 3 до 4 в 5 раз, свыше 4 в 10 раз. После того как показания детектора опустятся ниже 0.5 AU, сбор фракций прекращают, выполнение метода разделения останавливают.

Фракции, в которых или чистота десмопрессина по хроматограмме <50% или концентрация десмопрессина <0,1 г/л, отбрасывают. Промывают колонну с СПС-био, прокачивая 20 л очищенной воды (направление потока сверху вниз, заданный расход подвижной фазы 300 мл/мин, входная линия №1).

Промывают колонну с СПС-био, прокачивая «0,1 М соляную кислоту», пока рН на выходе из колонны не станет меньше 2 (потребность примерно 30 л), затем промывают колонну очищенной водой, пока показание кондуктометра на выходе из колонны не опустится ниже 1 mCm (потребность примерно 15 л). Уравновешивают колонну с СПС-био, прокачивая 20 л «0,6% УК» (Метод DES_SPS_eq.opn; направление потока сверху вниз; заданный расход подвижной фазы 300 мл/мин). Очистка десмопрессина с помощью ВЭЖХ на колонне Grace 101mm с Vydac Denali.

Окончательную очистку десмопрессина-сырца выполняют на хроматографической установке высокого давления AZURA (Knauer, Германия).

Подготовка ВЭЖХ-очистки

Готовят водный раствор «3% ACN и 0,25% УК» из расчета: 5 л элюента на одно разделение. Подключают к переключателю потока насоса А, вход 3.

Готовят водный раствор «11% ACN и 0,25%» УК» из расчета: 11 л элюента на одно разделение. Подключают к переключателю потока насоса А, вход 1.

Готовят водный раствор «50% ACN и 0,25% УК» из расчета: 1,3 л элюента на одно разделение. Подключают к переключателю потока насоса В, вход 2.

Уравновешивают колонну «3% ACN и 0,25% УК» с помощью метода «DES_eq_3%.met». В емкость с десмопрессином погружают до дна снабженный фильтром входной капилляр насоса А, вход 2.

С помощью насоса А вводят в колонку объем раствора, содержащий 20 г десмопрессина.

Процесс ВЭЖХ-очистки. Первое разделение

Наносят раствор десмопрессина.

После 25 мин, когда показание детектора достигнет 200 mAU, начинают собирать фракции сначала по 0,25 л, после прохождения максимума интенсивности в районе 30 мин - по 0,5 л до 45 мин, далее собирают градиентную фракцию.

Собранные фракции анализируют с помощью ВЭЖХ. При отборе проб на аналитику из фракций, собранных при показании детектора от 50 до 100, раствор разбавляют в 2 раза, от 100 до 500 в 5 раз, от 500 до 1500 в 10 раз, свыше 1500 в 20 раз. Фракции с чистотой десмопрессина менее 75% или концентрацией менее 1,8 мг/мл отбрасывают.

Для оставшихся фракций производят расчет возможности их объединения в «Целевые фракции ВЭЖХ».

Для этого по формуле определяют суммарную чистоту (Р) при последовательном добавлении к фракциям с содержанием десмопрессина не менее 98,5% менее чистых фракций (где mi - масса десмопрессина в i фракции, pi - процентное содержание десмопрессина в i фракции):

- Для тех примесей, содержание которых хотя бы в одной из объединяемых фракций превышает 0,5%, перед объединением производят расчет суммарного содержания этих примесей (А) после возможного объединения фракций по формуле (где Si - площадь пика примеси в i фракции, Vi - объем фракции, di - разбавление пробы, ai - процентное содержание примеси в i фракции):

Объединяют фракции, для которых в «Целевой фракции ВЭЖХ» Р>98,5% и содержание единичных пиков <0,5%.

Последующие ВЭЖХ-разделения

Момент начала сбора фракций при последующих разделениях определяют на основании результатов первого разделения таким образом, чтобы начало сбора 3 фракции при последующих разделениях соответствует времени начала сбора первой фракции, попавшей в «Целевые», при первом разделении. Сбор 1 фракции начинают на 2 минуты раньше начала сбора третьей фракции. Таким образом:

- 1 фракция (слив) - 1 минута (0,25 л);

- 2 фракция (по результатом анализа ее определяют либо в «утилизируемый отход - предпик», либо в «целевые») - 1 минута (0,25 л);

- 3 фракция (целевая) - до показания детектора 100 mAU;

- 4 фракция («утилизируемый отход - хвост») - момент резкого увеличения интенсивности сигнала до показания детектора 20 mAU (около 3 мин). По мере накопления 9-10 л «целевых фракций ВЭЖХ» их анализируют с помощью ВЭЖХ. Если содержание "hvost-1" <0,5%, упаривают до концентрации 10-15% по массе и подвергают повторной ВЭЖХ-очистке на колонне GRACE 101 мм.

В конце серии промывают колонну «50% ИПС и 1% УК».

Концентрирование десмопрессина и Упаривание и лиофилизация

Как по примеру 1.

Способ позволяет получать синтетический десмопрессин чистотой не менее 98,5% и единичной примесью менее 0,5%.

Технический результат: более качественная очистка целевого продукта.

Как видно из таблицы, отдельное использование стадий очистки не приводит к качественной очистке от всех примесей. При использовании заявленных вариантов полное отделение градиентных и эпимерных примесей, могут быть незначительные количества Hvost-1 и Hvost-1- до 0,5%.