Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ПРОГРЕССИРОВАНИЮ АТЕРОСКЛЕРОЗА У БОЛЬНЫХ С ХРОНИЧЕСКОЙ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА ПО СОДЕРЖАНИЮ ИНТЕРЛЕЙКИН-10-ПРОДУЦИРУЮЩИХ Т-ЛИМФОЦИТОВ В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ

Изобретение относится к медицине, в частности, к кардиологии, а именно к лабораторным диагностическим способам определения предрасположенности больных с хронической ишемической болезнью сердца (ИБС) к прогрессированию атеросклероза.

Прогрессирование атеросклероза в коронарных артериях обуславливает возобновление стенокардии и необходимость госпитализации, а также в ряде случаев проведения дорогостоящего оперативного лечения. Прогрессирование атеросклероза сонных артерий повышает риск развития нарушения мозгового кровообращения. В ряде случаев атеросклероз может развиваться даже при коррекции основных общепринятых факторов риска заболевания (снижение уровня холестерина и глюкозы до целевых значений, отказ от курения, и др.). Своевременное выявление таких пациентов, усиление контроля над ними и назначение соответствующей терапии позволят уменьшить количество повторных госпитализаций и сократить затраты на оперативное лечение.

В настоящее время нет маркеров, однозначно указывающих на риск прогрессирования атеросклероза и развития сердечно-сосудистых осложнений у пациентов со стабильными проявлениями ИБС при коррекции основных общепринятых факторов риска. Наиболее изученный маркер, ассоциированный с высоким риском развития осложнений у пациентов с острым коронарным синдромом (ОКС) и инфарктом миокарда (ИМ), - С-реактивный белок, - не показал прогностической значимости в отношении риска прогрессирования и развития осложнений при хроническом течении ИБС (2013 ESC guidelines on the management of stable coronary artery disease).

Известен способ экспресс-диагностики предрасположенности больного с ИБС к прогрессированию атеросклероза. Сущность способа заключается в том, что проводят оценку степени стимуляции атерогенной функции моноцит-производных макрофагов из крови больных с ИБС по способности макрофагов а) продуцировать активные формы кислорода, оцененные по величине люминол-зависимой хемилюминесценции, б) окислять липопротеины низкой плотности, оцененные по накоплению в них продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, в) поглощать липопротеины низкой плотности, оцененные по накоплению в макрофагах общего холестерина, и г) по сохранению 50-70% жизнеспособных макрофагов в процессе 1 часа инкубации в безбелковой субстрат-дефицитной среде.

(Патент РФ №2408019, МПК G01N 33/50, опубл. 27.12.2010 г.)

Назначением способа является «диагностика предрасположенности к прогрессированию атеросклероза», но в нем отсутствуют клинические подтверждения прогрессирования атеросклероза у лиц с повышенной проатерогенной функцией моноцит-макрофагов, в частности нет данных ультразвукового исследования сонных артерий или коронарной ангиографии, указывающих на изменение размеров атеросклеротических поражений сосудов в отдаленном периоде.

Известен также способ диагностики, определения прогноза или идентификации предрасположенности к атеросклерозу и восприимчивости к развитию атеросклеротических бляшек и/или обструкции сосудов, где способ включает анализ образца для определения процентной частоты по меньшей мере двух субпопуляций Т-лимфоцитов и сравнение данных со сравнительными и/или контрольными данными, где по меньшей мере одна из указанных субпопуляций Т-лимфоцитов представляет собой популяцию CD8 Т-клеток, выбранную из списка, состоящего из CD8+/CD11L+/CD45RA+, CD8+/CD11L+/CD45RO+, CD8+CD11a+, CD8+CD62L+, CD8+CD11highRO+и CD8+CD38+RO+, и по меньшей мере одна другая из указанных субпопуляций Т-лимфоцитов представляет собой популяцию CD4 Т-клеток, выбранную из списка, состоящего из CD4+/62L+, CD4+CD49d+, CD4+CD25+, CD4+DRII+, CD4+CD44+и CD4+CD3+RO+.

(Патент РФ №2384847, МПК G01N 33/50, опубл. 20.03.2010 г.)

Недостатки данного способа заключаются в том, что в нем не указано конкретное практическое применение: какие именно показатели из множества перечисленных и в каком сочетании дают возможность судить о предрасположенности к атеросклерозу.

Задачей изобретения является создание эффективного и достоверного способа диагностики предрасположенности к прогрессированию атеросклероза у больных с хронической ИБС по содержанию интерлейкин-10 (ИЛ-10)-продуцирующих Т-лимфоцитов в периферической крови, позволяющего в краткосрочной перспективе выявлять пациентов с высоким риском прогрессирования атеросклероза коронарных и сонных артерий, что способствует уменьшению количества повторных госпитализаций и сокращению затрат на оперативное лечение таких пациентов.

Технический результат изобретения заключается в эффективности способа выявления пациентов с высоким риском прогрессирования атеросклероза, уменьшении количества повторных госпитализаций и сокращении затрат на лечение.

Это достигается тем, что в заявляемом способе диагностики предрасположенности к прогрессированию атеросклероза у больных с хронической ИБС, включающем анализ образца для определения субпопуляции Т-лимфоцитов, которая представляет собой популяцию CD4 Т-клеток, согласно изобретению из периферической венозной крови выделяют мононуклеарную фракцию клеток с последующей активацией клеток в культуре в течение 4 ч в присутствии 25 нг/мл форболмиристатацетата (ФМА), 1 мкг/мл иономицина и 10 мкг/мл монензина в среде RPMI 1640-10% фетальной бычьей сыворотки, фенотипированием лимфоцитов с использованием моноклональных антител к CD4 и интерлейкину-10 (ИЛ-10), меченных флуоресцентными метками, и цитофлуориметрией в потоке, при этом содержание ИЛ-10-продуцирующих Т-лимфоцитов (CD4+ИЛ-10+ клеток), выраженное в процентном (%) отношении от CD4+ лимфоцитов, менее 3,5% свидетельствует о высоком риске прогрессирования атеросклероза.

Получение достоверной диагностической информации по указанным иммунологическим показателям объясняется следующим. Известно, что атеросклероз представляет собой хронический воспалительный процесс в артериальной стенке, протекающий на фоне накопления модифицированных липидов в слое интимы. Лимфоциты, присутствующие в атеросклеротической бляшке на всех стадиях ее развития, модулируют течение воспалительного процесса. Субпопуляции лимфоцитов с провоспалительными свойствами (Т-хелперы 17, продуцирующие ИЛ-17) способствуют прогрессированию атеросклероза, субпопуляции лимфоцитов с противовоспалительными свойствами (регуляторные Т-лимфоциты, продуцирующие ИЛ-10) подавляют воспалительную реакцию в артериальной стенке и тем самым сдерживают развитие атеросклероза. Определение содержания субпопуляций лимфоцитов в крови позволяет получить информацию о течении воспалительного процесса в артериальной стенке.

Для осуществления способа исследуют периферическую венозную кровь. Забор крови в количестве 7-10 мл осуществляют в пробирки с цитратным антикоагулянтом, производят выделение и активацию фракции мононуклеарных лейкоцитов в культуре в течение 4 ч в присутствии 25 нг/мл форболмиристатацетата (ФМА), 1 мкг/мл иономицина и 10 мкг/мл монензина в среде RPMI 1640-10% фетальной бычьей сыворотки, типирование лимфоцитов методами прямой иммунофлуоресценции и цитофлуориметрии в потоке с использованием флуоресцентно меченных моноклональных антител к CD4 и ИЛ-10, наборов для фиксации и пермеабилизации клеток.

Содержание ИЛ-10-продуцирующих Т-лимфоцитов (с фенотипом CD4+ИЛ-10+), выраженное в % отношении от CD4+ лимфоцитов, менее 3,5% свидетельствует о высоком риске прогрессирования атеросклероза в краткосрочной перспективе (1-2 года).

Клинический пример 1.

Пациент К., мужчина, 70 лет, в марте 2012 г. поступил в стационар с направительным диагнозом "ИБС: состояние после стентирования правой коронарной артерии в 2009 г. Постоянная форма фибрилляции предсердий. Артериальная гипертензия". Не курит, инфаркт миокарда в анамнезе отрицает. В 2008 году в связи с клиникой стенокардии напряжения выполнена ангиопластика со стентированием правой коронарной артерии, при контрольной коронарографии в 2010 г. признаков прогрессирования атеросклероза не было выявлено. Лабораторные показатели при поступлении: общий холестерин 4,28 ммоль/л, триглицериды 1,76 ммоль/л, глюкоза 6,17 ммоль/л.

По вышеописанному способу подготовили пробы для исследования. Выполнили выделение из периферической крови и дальнейшую активацию фракции мононуклеарных лейкоцитов в культуре в течение 4 ч в присутствии 25 нг/мл форболмиристатацетата (ФМА), 1 мкг/мл иономицина и 10 мкг/мл монензина в среде RPMI 1640-10% фетальной бычьей сыворотки. Лимфоциты типировали методами прямой иммунофлуоресценции и цитофлуориметрии в потоке с использованием флуоресцентно меченных моноклональных антител к CD4 и ИЛ-10, наборов для фиксации и пермеабилизации клеток.

Иммунологические показатели: содержание ИЛ-10-продуцирующих Т-лимфоцитов с фенотипом CD4+ИЛ-10+ (% от CD4+ лимфоцитов) в периферической венозной крови составило 2,5%, что указывает на предрасположенность у этого больного к прогрессированию атеросклероза.

При коронарографии: ствол левой коронарной артерии (ЛКА) не изменен, передняя нисходящая артерия (ПНА) имеет неровные контуры, в средней трети стеноз до 50%, огибающая артерии (OA) не стенозирована, правая коронарная артерия (ПКА) значимо не стенозирована, в средней трети сосуда стентированный участок, потеря просвета не превышает 30%. Заключение: отсутствие значимого стенозирования.

В стационаре и на протяжении периода наблюдения пациенту проводилась стандартная для больных хронической ИБС терапия согласно Национальным рекомендациям по диагностике и лечению стабильной стенокардии (2008), из гиполипидемической терапии пациент получал аторвастатин 20 мг/сут.

Повторно пациент К. поступил спустя 26 месяцев после предыдущей госпитализации с жалобами на возобновление ангинозных болей. Факт прогрессирования атеросклероза подтвердился после проведенного клинико-инструментального обследования. При коронарографии ствол ЛКА и ПНА без значимого стенозирования, выявлен стеноз 80% в бассейне OA, стеноз 50% в устье ПКА, краевой рестеноз дистального стента в ПКА 90%. Заключение: стенозирующий атеросклероз коронарных артерий, краевой рестеноз дистального стентированного участка в правой коронарной артерии. Пациенту выполнено стентирование ПКА.

Клинический пример 2.

Пациент Б., мужчина, 60 лет, в январе 2012 года поступил в стационар с направительным диагнозом "ИБС: стенокардия напряжения 2 ФК. Артериальная гипертензия". Курит, ИМ в анамнезе (1999 г.), при МСКТ коронарных артерий выявлены стенозы ПНА-50%, ДА-60%, ПКА-40%. Лабораторные показатели при поступлении: общий холестерин 5,86 ммоль/л, триглицериды 1,26 ммоль/л, глюкоза 5,26 ммоль/л.

По вышеописанному способу подготовили пробы для исследования. Выполнили выделение из периферической крови и дальнейшую активацию фракции мононуклеарных лейкоцитов в культуре в течение 4 ч в присутствии 25 нг/мл форболмиристатацетата (ФМА), 1 мкг/мл иономицина и 10 мкг/мл монензина в среде RPMI 1640-10% фетальной бычьей сыворотки. Лимфоциты типировали методами прямой иммунофлуоресценции и цитофлуориметрии в потоке с использованием флуоресцентно меченных моноклональных антител к CD4 и ИЛ-10, наборов для фиксации и пермеабилизации клеток.

Иммунологические показатели: содержание ИЛ-10-продуцирующих Т-лимфоцитов с фенотипом CD4+ИЛ-10+ (% от CD4+ лимфоцитов) в периферической венозной крови составило 4,15%, что указывает на отсутствие предрасположенности у данного больного к прогрессированию атеросклероза.

При коронарографии выявлены незначимые стенозы ПНА и OA (максимальная степень стеноза 50%), ПКА (максимальная степень стеноза 40%).

В стационаре и на протяжении периода наблюдения пациенту проводилась стандартная для больных хронической ИБС терапия согласно Национальным рекомендациям по диагностике и лечению стабильной стенокардии (2008), из гиполипидемической терапии пациент получал розувастатин 10 мг/сут.

Повторно пациент Б. поступил в апреле 2014 года спустя 27 месяцев после предыдущей госпитализации для контрольного обследования. Отсутствие прогрессирования атеросклероза подтверждено после проведения клинико-инструментального обследования. Выполнено МСКТ коронарных артерий, выявлены 50% стенозы ПНА, OA и ПКА. Показаний к проведению эндоваскулярных видов лечения не выявлено.

По заявляемому способу содержание ИЛ-10-продуцирующих Т-лимфоцитов с регуляторными свойствами (в процентном отношении к количеству CD4+ лимфоцитов) было определено в пробах периферической венозной крови 23 пациентов. У 12 пациентов наблюдалось прогрессирование заболевания в течение последующих 12-24 мес. В отличие от пациентов без прогрессирования атеросклероза у этих больных исходно отмечалось более низкое содержание ИЛ-10-продуцирующих Т-лимфоцитов.

Таким образом, заявляемый способ позволяет выявлять высокий риск прогрессирования атеросклеротического поражения артерий у больных хронической ИБС в ранние сроки (1-2 года), что делает возможным

своевременное усиление контроля и терапии у данной категории пациентов с целью уменьшения количества повторных госпитализаций и сокращения затрат на оперативное лечение таких пациентов.