Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЭНТЕРОКОККОВ КИШЕЧНОЙ МИКРОФЛОРЫ ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в практической работе бактериологических лабораторий для дифференциации энтерококков кишечной микрофлоры человека на нормальную и патогенную микрофлору с целью проведения своевременных и эффективных профилактических и терапевтических мероприятий.

Энтерококки, входящие в состав нормальной микрофлоры тела человека, в частности, пищеварительного тракта, играют важную роль в обеспечении колонизационной резистентности слизистой оболочки. В то же время энтерококки являются представителями группы условно-патогенных бактерий и штаммы микроорганизмов рода Enterococcus кишечной микробиоты человека могут стать причиной эндогенной инфекции [Валышева И.В. Генетическая характеристика вирулентного потенциала энтерококков кишечной микробиоты человека. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2012. №4. С. 45]. Энтерококки кишечной микрофлоры с экспрессией двух и более факторов патогенности могут иметь существенное значение в развитии эндогенных инфекций, особенно у иммунокомпрометированных пациентов [Валышев А.В., Герцен Н.В. Факторы патогенности энтерококков кишечной микрофлоры человека. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2012. №4. С. 42].

Рост инфекций, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, диктует необходимость поиска новых способов дифференциации нормальной микрофлоры от этиологических агентов, способных вызывать развитие патологических процессов [Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. М.: «Медицина», 1999. С. 185].

Известна дифференциация резидентной и транзиторной стафилококковой микрофлоры, основанная на оценке способности микроорганизмов к инактивации лизоцима [Чернова О.Л. Антилизоцимная активность стафилококков, выделенных при бактерионосительстве. Автореф. дис. … канд. биол. наук. Челябинск, 1998. С. 8.] или их устойчивости к коммерческому препарату лейкоцитарного интерферона [патент РФ №2092562, МПК C12Q 1/04, C12N 1/20, C12Q 1/14, 1997].

Указанные способы предназначены лишь для дифференциации резидентной и транзиторной стафилококковой микрофлоры у бактерионосителей в носовой полости и не могут быть использованы для других видов микроорганизмов и иных экологических ниш.

Известен способ дифференциации нормальной микрофлоры урогенитального тракта человека от возбудителей инфекционно-воспалительного процесса по способности выделенных микроорганизмов к инактивации антимикробного белка тромбоцитов [патент РФ №2260054, C12Q 1/04, 2005].

Вышеуказанный способ предназначен для дифференциации нормальной микрофлоры от возбудителей инфекционно-воспалительного процесса урогенитального тракта человека и не может быть использован для других видов микроорганизмов и иных экологических ниш.

Известен способ дифференциации энтерококков, полезных для человека, от энтерококков патогенных путем разграничения потенциально опасных штаммов по их генетическому профилю с применением полимеразной цепной реакции. При обнаружении генов, кодирующих факторы вирулентности энтерококков, делают заключение о патогенности штамма энтерококка [Вершинин А.Е., Колоджиева В.В., Ермоленко Е.И., Грабовская К.Б., Климович Б.В. и др. Генетическая идентификация как способ выявления патогенных и симбиотических штаммов энтерококков. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2008. №5. С. 82].

Известен способ дифференциации патогенных и непатогенных энтерококков разной локализации у новорожденных детей (кишечник, пупочная культя, нижние дыхательные пути, мочевыводящие пути) с помощью математической формулы с использованием линейной дискриминантной функции, характеризующей тип штамма энтерококка.

Данный способ основан на выделении энтерококков, определении их вида и изучении у выделенных штаммов энтерококков маркеров патогенности и персистенции (гемолитической, протеолитической, фибринолитической активности, полиантибиотикорезистентности, адгезивной способности, лизоцимной и антилизоцимной активностей) [Черданцева Г.Α., Билимова С.И. Характеристика биологических свойств энтерококков различного происхождения. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2000. №4. С. 103].

Однако данный способ является очень трудоемким, поскольку предполагает определение шести биологических свойств (маркеры вирулентности и персистенции) у выделенных штаммов, а также определение у них антибиотикорезистентности. Применение способа в клинической практике затруднено из-за сложности математических расчетов.

Наиболее близким к заявляемому способу по назначению и совокупности существенных признаков является способ дифференциации энтерококков на представителей нормальной микрофлоры кишечника и возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний, основанный на способности энтерококков к инактивации факторов естественной резистентности макроорганизма (антилизоцимной, антикомплементарной, «антиинтерфероновой», антитромбоцитарной катионно-белковой активности) [Билимова С.И. Характеристика факторов персистенции энтерококков. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2000. №4. С. 104].

Указанный способ имеет ряд существенных недостатков:

1. Трудоемок для применения в условиях клинической лаборатории и больше подходит для научно-исследовательских целей из-за необходимости определения у выделенных микроорганизмов нескольких факторов персистенции (антилизоцимной, антикомплементарной, «антиинтерфероновой», антитромбоцитарной катионно-белковой активности).

2. Требует использования тест-культур для определения величины указанных активностей и, как следствие, дополнительных манипуляций и реактивов для их подготовки.

3. Способ предназначен для дифференциации энтерококков - представителей симбиотической микрофлоры кишечника от возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний.

Технический результат, на достижение которого направлено заявляемое изобретение, заключается в возможности дифференцировать энтерококки кишечной микрофлоры человека на нормальную и патогенную микрофлору.

Для достижения указанного технического результата в заявляемом способе дифференциации энтерококков кишечной микрофлоры человека проводят забор исследуемого материала, его посев на селективные питательные среды, выделение и идентификацию чистых культур энтерококков, определение способности выделенных микроорганизмов к инактивации бактерицидных факторов, отличающийся тем, что в качестве бактерицидного фактора используют гемоглобин и к нормальной микрофлоре кишечника человека относят штаммы микроорганизмов видов E. faecalis и E. faecium, не обладающие способностью к инактивации гемоглобина (антигемоглобиновой активностью - AHbA), и Е. faecalis, обладающие AHbA при уровне выраженности данного признака, равном или меньше 12,0 г/л, а Е. faecium при уровне выраженности данного признака, равном или меньше 13,7 г/л.

Новым в заявляемом способе является то, что у выделенной культуры микроорганизма определяют антигемоглобиновую активность, при этом к нормальной микрофлоре кишечника человека относят штаммы микроорганизмов видов E. faecalis, и E. faecium, не обладающие способностью к инактивации гемоглобина (антигемоглобиновой активностью - AHbA) и Е. faecalis, обладающие AHbA при уровне выраженности данного признака, равном или меньше 12,0 г/л, а Е. faecium при уровне выраженности данного признака, равном или меньше 13,7 г/л.

Достигаемый при осуществлении изобретения технический результат состоит в том, что заявляемый способ путем определения у энтерококков антигемоглобиновой активности позволяет дифференцировать энтерококки кишечной микрофлоры человека на нормальную и патогенную микрофлору, что способствует проведению своевременных и эффективных профилактических и терапевтических мероприятий.

Известно, что гемоглобин обладает бактерицидными свойствами [Froidevaux R., Krier F., Nedjar-Arroume N. et al. Antibacterial activity of pepsin-derived bovine hemoglobin fragment. FEBS Letters. 2001. Vol. 491. P. 159-163. Thulin K.E. Agglutination of bacteria by haemoglobin. Acta Rheumatol. Scand. 1957. № 3. Р. 154-168].

Известна способность микроорганизмов утилизировать железо из гемоглобина - антигемоглобиновая активность [патент РФ №2262705, МПК G01N 33/72, 2005].

Из научно-технических и патентных источников известно применение антигемоглобиновой активности микроорганизмов для прогнозирования анемии гнойно-воспалительных заболеваниях [патент РФ №2296336, МПК G12Q 33/72, C12Q 1/02, 2007].

Известно использование феномена способности микроорганизмов к инактивации бактерицидных факторов в клинике для прогнозирования течения заболеваний, вызываемых патогенными и условно-патогенными микроорганизмами [патент РФ №2132558, МПК G01N 33/569, 1999], а также для выбора рациональной терапии и оценки ее эффективности [патент РФ №2192880, МПК A61K 38/11, A61P 31/04, 2002].

Авторами экспериментально установлены различия в распространенности и выраженности антигемоглобиновой активности у энтерококков кишечной микрофлоры человека, выделенных из кишечника здоровых лиц и лиц с дисбиозом кишечника.

Исследование проведено на 95 штаммах энтерококков, выделенных из кишечника здоровых детей при обследовании на дисбиоз, 52 штаммах, выделенных от детей с дисбиозом кишечника.

Исследуемый материал (кал) засевали на чашки со средой Enterococcosel agar (BD, США). Посевы инкубировали в термостате при температуре 37°C в течение 24-48 часов. Выросшие колонии пересевали на скошенный агар Шэдлера и изучали морфологию при окраске мазков по Граму. Чистую культуру идентифицировали до вида с помощью мультиплексной ПЦР с использованием известных праймеров (синтез праймеров осуществлен компанией «СИНТОЛ», Москва) по видоспецифическим генам, кодирующим синтез супероксиддисмутазы [Jackson C.R., Fedorka-Cray P.J., Barrett J.B. Use of a genus- and species-specific multiplex PCR for identification of enterococci. J. Clin. Microbiol. 2004. Vol. 42(8). P. 3558-3565].

E. faecalis регистрировали в 46,2% случаев, Ε. faecium в 37% случаев, редкие виды энтерококков (E. durans, Ε. casseliflavus, Ε. gallinarum, E. hirae) были изолированы в 16,8% случаев.

Наиболее распространенными видами энтерококков кишечной микрофлоры человека являются E. faecalis и E. faecium [Бухарин О.В., Валышев А.В. Биология и экология энтерококков. Екатеринбург: Уро РАН, 2012. С. 7].

Поэтому у этих двух видов выделенных энтерококков определяли антигемоглобиновую активность известным способом [патент РФ №2262705, МПК G01N 33/72, 2005].

Результаты исследований представлены в таблице.

Как видно из таблицы, у штаммов Е. faecalis, выделенных из кишечника здоровых лиц, антигемоглобиновая активность присутствует в 70% случаев с уровнем выраженности признака от 0,96 г/л до 12,0 г/л.

В то же время энтерококки, выделенные из кишечника детей с дисбиозом, характеризовались наличием антигемоглобиновой активности в 100% случаев с уровнем выраженности признака от 12,1 г/л до 16,7 г/л.

Штаммы Ε. faecium, выделенные из кишечника здоровых детей, обладали антигемоглобиновой активностью в 62,5% случаев с уровнем выраженности признака от 1,1 г/л до 13,7 г/л; Е. faecium, выделенные от детей с дисбиозом кишечника, в 100% случаев обладали антигемоглобиновой активностью с уровнем выраженности признака от 13,8 г/л до 15,9 г/л.

Таким образом, проведенные исследования показали, что и штаммы Е. faecalis и штаммы Е. faecium, выделенные при дисбиозе кишечника, в 100% случаев обладали антигемоглобиновой активностью, при этом уровень выраженности данного признака у всех штаммов Е. faecalis был более 12,1 г/л, а у культур Е. faecium - более 13,8 г/л.

Тогда как у энтерококков, выделенных из кишечника здоровых детей, антигемоглобиновая активность определялась в 62,5-70% случаев с уровнем выраженности признака у Е. faecalis от 0,96 г/л до 12,0 г/л, а у Е. faecium - от 1,1 г/л до 13,7 г/л.

Таким образом авторами при изучении штаммов энтерококков, выделенных из кишечника здоровых людей и лиц с дисбиозом, установлены пороговые значения антигемоглобиновой активности штаммов Е. faecalis и штаммов Е. faecium, позволяющие отнести их к нормальной микрофлоре кишечника: к нормальной микрофлоре кишечника человека относят штаммы микроорганизмов видов E. faecalis и E. faecium, не обладающие способностью к инактивации гемоглобина (антигемоглобиновой активностью - AHbA), и Е. faecalis, обладающие AHbA при уровне выраженности данного признака, равном или меньше 12,0 г/л, а Е. faecium при уровне выраженности данного признака, равном или меньше 13,7 г/л.

Предложенный способ дифференциации энтерококков кишечной микрофлоры человека был испытан в Оренбургском клиническом перинатальном центре и ГБУЗ «Оренбургская районная больница». Эффективность дифференциации, проведенной в соответствии с заявляемым способом, составила 95%.

Способ осуществляется следующим способом:

1. Исследуемый материал (кал) засевают на чашки со средой Enterococcosel agar (BD, США).

2. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37°C в течение 24-48 часов.

3. Выросшие колонии пересевают на скошенный агар Шэдлера и изучают морфологию при окраске мазков по Граму.

4. Чистую культуру идентифицируют до вида с помощью мультиплексной ПЦР с использованием известных праймеров по видоспецифическим генам, кодирующим синтез супероксиддисмутазы [Jackson C.R., Fedorka-Cray P.J., Barrett J.B. Use of a genus- and species-specific multiplex PCR for identification of enterococci. J. Clin. Microbiol. 2004. 42(8):3558-3565]. Синтез праймеров осуществлен компанией «Синтол» (Москва).

5. У выделенных штаммов энтерококков видов E. faecalis и E. faecium определяют антигемоглобиновую активность известным способом [патент РФ №2262705, МПК G01N 33/72, 2005].

6. К нормальной микрофлоре кишечника человека относят штаммы микроорганизмов видов E. faecalis и E. faecium, не обладающие способностью к инактивации гемоглобина (антигемоглобиновой активностью - AHbA), и Е. faecalis, обладающие AHbA при уровне выраженности данного признака, равном или меньше 12,0 г/л, а Е. faecium при уровне выраженности данного признака, равном или меньше 13,7 г/л.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1.

В родильном доме у новорожденных детей (4 ребенка) были взяты фекалии и засеяны на чашки со средой Enterococcosel agar. Посевы инкубировали в термостате при температуре 37°C в течение 24-48 часов. Выросшие колонии пересевали на скошенный агар Шэдлера и изучали морфологию при окраске мазков по Граму.

По совокупности морфологических (овоидные (яйцевидные) неподвижные клетки несколько вытянутые в длину, расположены попарно) и тинкториальных свойств (положительные при окраске по Граму) свойств отнесли данный штамм к представителям рода Enterococcus.

Затем чистую культуру идентифицировали до вида с помощью мультиплексной ПЦР с использованием известных праймеров по видоспецифическим генам, кодирующим синтез супероксиддисмутазы.

У выделенных энтерококков определяли антигемоглобиновую активность известным способом [патент РФ №2262705, МПК G01N 33/72, 2005].

У двоих детей были выделены Е. faecalis, обладающие AHbA 10,3 г/л и 9,5 г/л, соответственно. От третьего ребенка был высеян Е. faecium с уровнем выраженности данного признака, равным 13,7 г/л. Был сделан вывод о том, что данные штаммы энтерококков относятся к нормальной микрофлоре кишечника. Дальнейшее наблюдение за пациентами подтвердило правильность проведенной дифференциации штаммов энтерококков.

У четвертого ребенка обнаружен Е. faecalis с AHbA, равной 15,2 г/л. Был сделан вывод о том, что выделенный энтерококк является патогенным. Ребенок отнесен к группе риска по развитию инфекционно-воспалительного заболевания, и ему назначена терапия цефураксимом.

Пример 2.

Из мочи у новорожденного с инфекцией мочевыводящих путей выделен Е. faecium. В поисках источника инфицирования мочевого тракта проведено исследование фекалий согласно примеру 1.

У обследуемого был выделен Е. faecium с антигемоглобиновой активностью 12,8 г/л. Согласно предлагаемому способу был сделан вывод о том, что данный энтерококк не является патогенным и не мог вызвать инфекцию мочевыводящих путей. Проведенное санитарно-микробиологическое исследование показало, что возбудитель заболевания является внутрибольничным штаммом, а источником инфицирования мочевых путей новорожденного явилась медицинская сестра.

Пример 3. При обследовании на дисбиоз у больной пиелонефритом З. 10 лет, выделен Е. faecalis с уровнем выраженности антигемоглобиновой активности 14,8 г/л. Согласно предлагаемому способу был сделан вывод о том, что выделенный энтерококк является патогенным и вызвал развитие пиелонефрита. Применен бактериофаг энтерококковый жидкий, несколько раз в день натощак. Дальнейшее наблюдение за пациенткой подтвердило правильность проведенных терапевтических мероприятий.

Таким образом, использование заявляемого способа позволяет дифференцировать энтерококки кишечной микрофлоры человека на нормальную и патогенную микрофлору, что способствует проведению своевременных и эффективных профилактических и терапевтических мероприятий.