Результат интеллектуальной деятельности: ПРИМЕНЕНИЕ ШТАММА БАКТЕРИЙ BACILLUS CEREUS ГИСК №279 В КАЧЕСТВЕ ПРОДУЦЕНТА ИНГИБИТОРА ЦИТОКИНА ФНО - α

Изобретение относится к микробиологии. Штамм бактерий Bacillus cereus ГИСК №279 может быть использован для получения ингибитора цитокина ФНО-α.

Аналогов изобретения в патентной и научно-технической литературе не обнаружено.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в получении средства для продуцирования ингибитора цитокина ФНО-α.

Указанный технический результат решается применением штамма бактерий Bacillus cereus ГИСК №279 в качестве продуцента ингибитора цитокина ФНО-α.

Штамм Bacillus cereus ГИСК №279 выделен из испражнений пациента с дисбактериозом кишечника при обследовании микробиоценоза дистального отдела толстого кишечника в 2004 году в лаборатории биомониторинга и молекулярно-генетических исследований Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук г. Оренбурга.

Полученный штамм Bacillus cereus ГИСК №279 депонирован в Коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича и имеет регистрационный номер 279.

Штамм Bacillus cereus ГИСК №279 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки представляют собой грамположительные, неподвижные палочки, образующие капсулу размером (0,3…1,0)×(0,6…6,0) мкм.

Мясопептонный агар (37°C, 48 часов). Образуют изолированные шероховатые колонии белого или серо-белого цвета.

Мясо-пептонный бульон (37°C, 48 часов). Без встряхивания вызывает равномерное помутнение и выпадение осадка при культивировании в течение 18-24 часов. При встряхивании на качалке среда приобретает равномерную мутность без осадка.

Физиолого-биохимические признаки.

Факультативный анаэроб.

Температурный диапазон роста 25-42°C. Оптимальная температура роста 28-39°C. Максимальная скорость роста при 37-39°C.

Оптимум pH 7,2-7,6.

Реакция Фогес - Проскауера - положительная, каталаза - положительный, маннит - отрицательный, ксилоза - отрицательный, арабиноза - отрицательный, глюкоза - положительный, желатина - положительный, крахмал - положительный, утилизация цитратов - положительный, уреаза - отрицательный, казеин - положительный, тирозин - положительный, редукция нитратов - положительная, лецитиназа - положительный, гемолиз - положительный.

Условия хранения культуры: при температуре 4°C после лиофильной сушки - срок хранения 12 месяцев; или выращенная в 0,3% МПА (pH 7,2-7,6) и залитая стерильным вазелиновым маслом - 3-5 месяцев.

Условия и состав среды для размножения - МПБ при Т 32-33°C (pH 7,2-7,6), 1,5% МПА при Т 37°C в течение 18-24 часов.

Штамм Bacillus cereus ГИСК №279 идентифицирован по «Определителю бактерий Берджи» (1997 г.) как штамм вида Bacillus cereus.

Известно использование штамма бактерий Bacillus cereus ГИСК №279 для исследования влияния алкилоксибензолов на ростовые и персистентные характеристики микроорганизмов (Гордеева С.В. Влияние алкилоксибензолов на ростовые и персистентные характеристики микроорганизмов. Автореферат. дисс., Оренбург, 2011, стр. 8-12).

Новое применение штамма бактерий Bacillus cereus ГИСК №279 стало возможным благодаря обнаруженному у него свойству продуцировать ингибитор цитокина ФНО-α. Новое свойство штамма бактерий Bacillus cereus ГИСК №279 было обнаружено авторами путем ряда экспериментов и его нельзя было предсказать заранее.

Уровень активности продуцируемого Bacillus cereus ГИСК №279 ингибитора цитокина ФНО-α определяли согласно известному способу определения антицитокиновой активности микроорганизмов (Бухарин О.В. и др. Антицитокиновая активность микроорганизмов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2011 - №4, с. 56-61).

Уровень активности ингибитора ФНО-α, продуцируемого штаммом Bacillus cereus ГИСК №279 выражают в процентах (%) инактивации цитокинов в опыте по сравнению с контролем.

Примеры осуществления изобретения

Пример 1

Бульонную культуру Bacillus cereus ГИСК №279 получают выращиванием данного штамма в пробирках в жидкой питательной среде следующего состава: пептон - 10,0 г.; NaCl - 5,0 г.; вода мясная - 1000,0 мл, pH 7,2-7,4. Температура 37°C, время инкубации 18-24 часа. Полученную бульонную культуру Bacillus cereus ГИСК №279 центрифугируют при 3000 оборотах в минуту в течение 20 минут.

Культуральную жидкость отделяют от бактериальных клеток стеклянной стерильной пипеткой в отдельную емкость. Данная культуральная жидкость представляет собой неочищенный препарат ингибитора цитокина ФНО-α.

Наличие и уровень активности полученного неочищенного препарата ингибитора цитокина ФНО-α определяют следующим образом: супернатант Bacillus cereus ГИСК №279 соинкубируют с раствором рекомбинантного цитокина («Sigma», ФНО-α - T6674-10UG) в соотношении 1:1 (опытные пробы).

В качестве контроля используют раствор цитокинов, внесенный в Schaedler-бульон (BBL, США).

Конечная концентрация цитокинов в опытных и контрольных пробах составляла для ФНО-α: 5, 50, 100, 200, 500 пг/мл.

Опытные и контрольные пробы инкубируют в течение 2 часов (37°C), реакцию останавливают, снижая температуру пробирок до +4С°, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин (+4°C) и отбирают супернатант.

Определение концентрации цитокинов в опытных и контрольных пробах проводят общепринятым иммуноферментным анализом с использованием реагентов «Цитокин» (СП-б, Россия).

Учет результатов проводят на фотометре Multiskan Labsystems (Финляндия) при длине волны 492 нм.

О наличии продуцируемого штаммом Bacillus cereus ГИСК №279 ингибитора цитокина ФНО-α судили по способности его супернатанта снижать концентрацию рекомбинантного цитокина в опыте по сравнению с контролем.

Уровень активности продуцируемого Bacillus cereus ГИСК №279 ингибитора цитокина ФНО-α определяли согласно известному способу определения антицитокиновой активности микроорганизмов (Бухарин О.В. и др. Антицитокиновая активность микроорганизмов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2011 - №4, с. 56-61).

Уровень активности ингибитора ФНО-α, продуцируемого штаммом Bacillus cereus ГИСК №279, составил при концентрации цитокина в среде от 5 пг/мл до 100 пг/мл - 100%, при 200 пг/мл - 80% и 500 пг/мл - 55%.

Пример 2

Аналогично примеру 1 проводили эксперименты по определению наличия и уровня активности ингибитора цитокина ФНО-α, продуцируемого штаммом Bacillus cereus ГИСК №279 (В. cereus ГИСК №279) и клиническими изолятами Bacillus sp.(В. cereus 1-11), выделенных из кишечного биотопа.

Результаты исследований приведены в таблице.

Как видно из таблицы, штамм бактерий Bacillus cereus ГИСК №279 имеет 100% уровень активности ингибитора цитокина ФНО-α при концентрации цитокина в среде от 5 пг/мл до 100 пг/мл, а у клинических изолятов бацилл (В. cereus 1-11) уровень активности ингибитора цитокина ФНО-α в среднем составлял: при концентрации цитокина в среде 5 пг/мл - 65±5,6%, при 50 пг/мл - 40,8±6,6%, при 100 пг/мл -34,8±5,6%. При создании концентрации цитокина в среде 200 пг/мл среди клинических изолятов бацилл только 1 штамм ингибировал 24% цитокина, при 500 пг/мл активность отсутствовала у всех клинических культур.

Уровень активности ингибитора ФНО-α у штамма Bacillus cereus ГИСК №279 сохранялся и при более высокой концентрации цитокинов: при 200 пг/мл его активность составляла 80%, а при 500 пг/мл уровень активности был равен 55%. Проведенные исследования свидетельствуют о большей продуктивности ингибитора ФНО-α штаммом Bacillus cereus ГИСК №279 по сравнению с клиническими изолятами Bacillus spp.

Таким образом, заявляемое изобретение позволяет применять штамм бактерий Bacillus cereus ГИСК №279 в качестве продуцента ингибитора цитокина ФНО-α.