СПОСОБ ОЦЕНКИ ПОДАВЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ В МЕМБРАНАХ ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ ОБОСТРЕНИИ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ У БЕРЕМЕННЫХ НА ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ ГЕСТАЦИИ

1. Цель изобретения - разработать метод, позволяющий гистохимическим способом оценить влияние цитомегаловирусной инфекции на активность аденилатциклазы в мембранах эритроцитов, влияющей на фосфорилирование внутриклеточных белков и, в частности, на АТФ, обеспечивающую оксигенацию гемоглобина.

2. Изобретение относится к медицине, а именно разработке метода, позволяющего выявить активность аденилатциклазы в мембранах эритроцитов, влияющей на фосфорилирование белков и по содержанию АТФ в эритроцитах оценивать степень оксигенации гемоглобина.

3. Раскрытие изобретения

Центральной частью аденилатциклазной системы является фермент аденилатциклаза, который катализирует превращение АТФ в цАМФ [1, 3]. Этот фермент может стимулироваться Gs-белком и после этого связываться с цАМФ-зависимой протеинкиназой. Это приводит к ее активации и последующему фосфорилированию белков эффекторов, выполняющих разнообразные физиологические процессы в клетке [5-9]. Если речь идет об аденилатциклазе, встроенной в мембрану эритроцитов, то речь идет о фосфорилировании крайне важных структур, таких как 2,3-ДФГ и АТФ, от которых зависит основная функциональная работа эритроцитов - оксигенация гемоглобина.

4. Новая техническая задача

Уточнить влияет ли цитомегаловирусная инфекция на активность аденилатциклазы в эритроцитах периферической крови и не оказывает ли ее действие на синтез АТФ и если АТФ становится меньше, то процессы оксигенации гемоглобина будут снижаться.

5. Прототипом для оценки влияния вирусных инфекций на активность аденилатциклазы мы избрали работу Kimberg D.V., Field М. и Gershon Е. (1974) [7], которые показали, что холерный вибрион, действуя на аденилатциклазу клеток слизистой оболочки кишечника и активизируя цАМФ, вызывает большой выброс воды в просвет кишечника. Однако наши исследования свидетельствуют, что не все вирусы оказывают одинаковое влияние на аденилатциклазу, встроенную в мембрану клетки. Так, при обострении цитомегаловирусной инфекции в период беременности аденилатциклаза мембран эритроцитов подвергается угнетению и, следовательно, подавляется процесс оксигенации гемоглобина.

5.1. Аденилатциклаза, встроенная в мембрану эритроцитов, в период беременности подавляется цитомегаловирусной инфекцией.

5.2. Снижается процесс фосфорилирования белков в эритроцитах, в результате чего резко уменьшается количество АТФ.

5.3. Уменьшение АТФ в эритроцитах приводит к снижению оксигенации гемоглобина, уменьшению оксигемоглобина в периферической крови, что формирует состояние гемической анемии в период беременности.

6. Осуществление изобретения

6.1. Обследованы 40 беременных 18-25 лет (срок гестации - 35-40 недель). Основную группу составили 25 беременных с ХЦМВИ в стадии обострения, контрольную - 15 беременных без этой патологии. У беременных симптоматически ЦМВИ проявлялась в виде острого респираторного заболевания, сопровождающегося ринофарингитом. Клинический диагноз (обострение ЦМВИ) устанавливался по результатам комплексного исследования периферической крови на наличие ДНК цитомегаловируса (ЦМВ), IgM или увеличение титра антител IgG в парных сыворотках (в 4 раза и более) в динамике через 10 суток, а также индекса авидности (более 65%). Исследования проводили с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с участием человека» с поправками 2008 г. и правилами клинической практики в РФ, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003.

6.2. Верификацию ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекса авидности осуществляли методами ИФА на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест», ДНК ЦМВ выявляли методами ПЦР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология».

6.3. Аденилатциклазу определяли в эритроцитах периферической крови беременных на третьем триместре гестации. Кровь, взятую из вены натощак с коагулянтом в количестве 100 мкл, вносили в пробирку РИНТ, КЗ ЭДТА к 5 мл инкубационного раствора.

6.4. Инкубационный раствор готовился на основе:

6.5. Инкубацию проводили в течение 30 мин при температуре 37°C, после чего эритроциты тщательно промывали в Na-малеатном буфере (рН 7,4) с добавлением до 4,5% глюкозы.

6.6. Эритроциты помещали в 1% раствор Na₂S·9H₂O на 1-3 мин при комнатной температуре, затем несколько раз промывали в малеатном буфере.

6.7. Центрифугировали и из осадка готовили мазки на центрифуге «Diffe Spin-2». Полученные мазки высушивали и изучали с помощью цифрового микроскопа, соединенного с компьютером для цитофотометрического анализа по программе «Scion» (США).

7. Содержание АТФ в эритроцитах определяли по методу Луганова И.С. и Блинова М.Н. [2].

8. Содержание оксигемоглобина в периферической крови определяли по методу Эвлина и Мэллой [4].

9. Статистический анализ и обработка данных проводилась с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0». Характеристика вариационных рядов: средняя арифметическая (М), стандартная ошибка (m), коэффициент вариации 95%, доверительный интервал для средних значений М±m, где t определялось по таблице граничных значений критерия Стьюдента при доверительном уровне 95% и числе степеней свободы F=n₁+n₂-2. Для определения достоверности различий использовался непарный параметрический критерий Стьюдента. Принимались во внимание р<0,05; 0,01; 0,001. Для определения достоверности различий в случае негауссовых распределений непараметрические критерии Колмогорова-Смирнова и Манна-Уитни.

10. Исследования показали, что при обострении цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации до титра 1:1600 к цитомегаловирусу в эритроцитах периферической крови беременной снижается содержание эритроцитов с реакцией на аденилатциклазу - до 10,0±0,2% (контроль - 70,2±1,2%) (фигура 1, 2). В эритроцитах периферической крови снижается содержание АТФ - до 0,52±0,04 мкмоль/мл. В периферической крови содержание оксигемоглобина снижается до 96,3±1,7%.

Полученные данные свидетельствуют, что обострение цитомегаловирусной инфекции через подавление активности аденилатциклазы в мембранах эритроцитов снижает процессы фосфорилирования АТФ, что и приводит к нарушению оксигенации гемоглобина, создавая угрозу формирования гемической анемии у беременной.

На фигуре 1 изображены эритроциты периферической крови беременной после проведения гистохимической реакции на выявление аденилатциклазы в мембранах эритроцитов при обострении цитомегаловирусной инфекции с титром антител к цитомегаловирусу 1:1600. Число эритроцитов, сохраняющих реакцию на аденилатциклазу, 10,0±0,2%. Увеличение 10×100.

На фигуре 2 изображены эритроциты беременной, не болевшей на всем протяжении гестации. В мембранах эритроцитов отмечается высокая активность на реакцию к аденилатциклазе. 70,2±1,2% эритроцитов выявляют активность на аденилатциклазу в мембранах эритроцитов. Увеличение 10×100.

Литература

1. Доман Н.Г., Феденко Е.П. Биологическая роль циклического АМФ // Успехи биол. химии. 1976. Т. 17. С. 63-101.

2. Луганов И.С., Блинов М.Н. Определение дифосфоглицериновой кислоты неэнзиматическим методом и содержание 2,3-ДФГ и АТФ в эритроцитах больных хроническим лимфолейкозом // Лабораторное дело. 1975. №11. С. 625-634.

3. Мелихов В.И. Регуляция Са активности аденилатциклазы, фосфодиэстеразы и содержания цАМФ в слизистой тонкой кишки кролика при действии холерного энтеротоксина. Автореф. дисс. на степень канд. биол. наук. 1984. 140 с.

4. Покровский А.А. Биохимические методы исследования. М.: Медицина. 1969. 337 с.

5. Ткачук В.А., Балденков Г.Н. Выделение, очистка и характеристика регуляторных свойств аденилатциклазы сердца кролика. Биохимия. 1978. Т. 43. 6 С. 1097-1110.

6. Bar Н.Р., Hechter О. Adenyl cyclase and hormone action. Effeck of adenocorticotrophic hormone, glucagons and epinephrine on the plasma membrane of rat fat cells // Proc. Natl. Acad. Sci. Usa. 1969. V. 63. P. 350-356.

7. Kimberg D.V., Field M., Gershon E. Effect of prostaglandins and cholera enterotoxin on intestinal mucosal cyclic AMP accumulation // J. Clin. Invest 1974. V. 53. 5. P. 941-949.

8. Steer M.L., Atlas D., Levitzki A. Interelations between - adrenergic receptor adenilatecyclase and calcium // New Engl. J. Medic. 1975. V. 292. P. 409-414.

9. Thorns P., Capito K. Differential effects, of Ca-calmodulin on adenilatecyclase acticity in mouse and rat pancreatic islets // Biochem. Journ. 1982. V. 206. 1. P. 97-102.