Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОИСКА ТОЧКИ С ДРОБНЫМ ЭФФЕКТОМ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ЭФФЕКТИВНЫХ ДОЗ ВЕЩЕСТВ МЕТОДОМ "ОДНОЙ ТОЧКИ"

Изобретение относится к исследованию или анализу материалов, а именно медицинских препаратов, особыми способами. Конкретно изобретение относится к токсикометрии и может быть использовано для определения доз веществ с произвольно заданной частотой развития эффекта.

Метод «одной точки» используется при определении токсикометрических характеристик по веществу-стандарту. В частности, такой подход имеет место при проверке эффективности разных партий одного и того же вещества при достоверно известной функции наклона линии токсичности S. При использовании указанного метода решаются задачи: а) по нахождению точки с дробным эффектом; б) по определению доз веществ с произвольно заданной частотой развития эффекта.

Обычно зачетная дробная точка, по которой определяются эффективные дозы с заданным дробным токсическим эффектом, «нащупывается» путем последовательного введения животным доз вещества с n-кратным изменением его относительного количества [Саноцкий И.В. Методы определения токсичности и опасности химических веществ (токсикометрия) [текст] / И.В. Саноцкий, И.П. Уланова, Л.А. Тиунов и др.; под общ. ред. И.В. Саноцкого; АМН СССР. - М.: Медицина, - 1970. - 346 с.].

Тактика токсикологического эксперимента в ближайшем из аналогов предлагаемого способа описана в [Сперанский С.В. Тактика эксперимента при определении LD₅₀ [текст] // Гиг. и сан. - №1. - 1986. - С. 66-67]. Предлагается проводить четыре этапа испытаний. I этап - нахождение широкой (8-кратной) вилки с введением гипотетических доз (Г): 1/8 Г, 1 Г, 8 Г. II этап - нахождение узкой (двукратной) вилки с введением: 16 Г, 32 Г, 1/16 Г и 1/32 Г. III этап - проведение испытаний по 6 животных на ближайших дозах с развитием эффекта и без него. IV этап - в зависимости от широты зоны токсического действия проводится полноценный эксперимент с различным шагом между дозами по 5 животных на точку. При указанной тактике некоторые дозы испытываются повторно, что снижает экономичность эксперимента; схема приготовления требуемых разведений растворов веществ не является оптимальной, так как требует предварительного детального расчета каждого разведения и высокой точности при отмеривании требуемых количеств исходных растворов.

Алгоритм определения доз веществ с произвольно заданной частотой развития эффекта по одной экспериментально определенной точке описана в [Ван-дер-Варден Б.Л. Математическая статистика [текст]: [пер. с нем.] / B.L. Van der Warden - М.: Изд. ин. лит. - 1960. - 435 с.]. Сущность метода заключается в нанесении экспериментально определенной дробной точки на график с уже имеющейся линией токсичности, проведении через полученную точку дополнительной линии, параллельной имеющейся, и графическом определении эффективной дозы (фиг. 1).

Недостатками представленного графического способа являются его субъективность и необходимость использования графика. В настоящее время графические методы применяются редко, расчет доз методом одной точки проводится математическим способом - в соответствии с разработками Гэддама (Gaddum), Блисса (Chester I. Bliss), Финни (Finney D.J.) и других авторов [Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта [текст] / М.Л. Беленький. - 2-е изд. - Л.: Государственное издательство медицинской литературы, 1963. - 152 с.; Finney D.J. Statistical method in biological assay [text] / D.J. Finney. - 3-rd edit. - London: Charles Griffin & Company LTD. - 1978. - 508 p.; Litchfield J.T., Wilcoxon F.A. The simplified method of evaluating dose-effect experiments [text] // J.T. Litchfield, F.A Wilcoxon. J. Pharmacol. Exp.Ther., 1949. - №2. - P. 99-113]. Подход к определению средней эффективной дозы веществ описан в [Прозоровский В.Б., Фрумин Г.Т. Аналитический вариант экспрессного «метода одной точки» для определения средних эффективных доз [текст] // Эксп. и клин. фарм. - 1992. - №6. - С. 61-63], где показано применение «метода» для расчета средних эффективных доз веществ. Предлагаемое авторами уравнение для расчета

где Y₂ и D₂ - соответственно пробит и доза для оцениваемого вещества.

Уравнение (1) согласуется с уравнением

выведенным из базового уравнения пробит-анализа

где D_Y - доза, соответствующая некоторому дробному эффекту;

Y - пробит, соответствующий дробному эффекту на дозе D_Y;

b - тангенс угла между линией токсичности и осью абсцисс;

а - расстояние от нуля до точки пересечения линии токсичности с осью ординат.

Для использования уравнения (2) необходим предварительный расчет коэффициентов а и b.

Для расчета коэффициента а используется уравнение:

Для расчета коэффициента b используется уравнение

где S - функция наклона линии токсичности для вещества-стандарта, полученная ранее на веществах того же класса или взятая из литературных данных.

Недостатками применения описанного подхода являются многоступенчатость расчетов и снижение точности за счет накопления погрешности при расчете каждого отдельного элемента.

Задача настоящего изобретения заключается в разработке наиболее экономной стратегии поиска «зачетной» точки с дробным эффектом и удобной схемы разведения растворов веществ, вводимых животным; выборе наиболее универсального алгоритма определения эффективных доз с заданным дробным эффектом.

Решение поставленной задачи предполагает технический результат, заключающийся в наиболее экономном проведении токсикологического эксперимента (предполагается уменьшение количества используемых животных и уменьшение количества вещества, необходимого для исследования); снижении погрешностей при разведениях растворов веществ, вводимых животным; повышении объективности за счет уменьшения погрешностей при определении эффективных доз.

Поставленная задача решается тем, что в способе поиска точки с дробным эффектом и определения эффективных доз веществ методом «одной точки» сначала, согласно предлагаемому техническому решению, при определении интервала доз с альтернативным откликом (ИДАО) при десятикратном различии доз применяют повторное введение растворов веществ одному и тому же животному до исчерпания лимита допустимого объема введения; затем сужают ИДАО последовательным двукратным сокращением путем приготовления растворов для введения смешением одинаковых количеств растворов с краев ИДАО до различия доз, находящихся на краях интервала, менее чем в два раза; определяют реперную дозу на полученном интервале доз с альтернативным откликом как среднюю величину и вводят рассчитанную дозу дополнительной группе из четырех животных; объединяют данные по шести животным в одну точку; рассчитывают частоту эффекта в процентах и переводят ее по стандартным таблицам в вероятностные единицы - пробиты; определяют величину эффективной дозы для заданного дробного эффекта, используя известную функцию наклона линии токсичности, по формуле

где D_T - искомая доза тестируемого вещества с заданной частотой эффекта;

D_S - доза вещества-стандарта;

S - функция наклона линии токсичности для вещества-стандарта;

Y_T - пробит, соответствующий заданному дробному эффекту для тестируемого вещества;

Y_S - пробит, соответствующий дробному эффекту для вещества-стандарта.

Предлагаемое изобретение поясняется чертежами, представленными на фигурах 1 и 2.

На первом этапе исследований по разработке способа проведено обоснование алгоритма экспериментального определения точки с дробным токсическим эффектом.

С целью экономии биологического материала первоначально осуществляют поиск интервала доз с альтернативным откликом с десятикратным различием величины доз на краях интервала с использованием одного-двух животных. Введение животному веществ в организм начинают с минимальной заведомо не вызывающей заданного эффекта дозы (в 10 или 100 раз меньше дозы вещества-стандарта). Следующую дозу вводят тому же животному в количестве, в 9 раз превышающем первоначальную дозу (чтобы суммарная доза превышала предыдущую в 10 раз). Ограничением для использования только одного животного при грубом поиске эффективной дозы является максимально допустимый объем введения растворов, который в два раза превышает рекомендуемый [Каркищенко Н.Н. Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских технологиях [текст] / под ред. Н.Н. Каркищенко и С.В. Грачева. Москва. - 2010. - 344 с.]). При исчерпании лимита допустимого объема введения переходят на второе животное, которому вводят дозу, в десять раз превышающую суммарную дозу для первого животного. Следующее введение осуществляют так же, как у первого животного, чтобы суммарно введенная доза была больше предыдущей в десять раз. Таким образом, с использованием всего двух животных перекрывается интервал с различием доз в тысячу раз (при отсутствии дефицита животных все дозы можно оценивать при однократном введении, но это снизит экономичность способа).

После нескольких «нулевых» точек получают точку с ожидаемым эффектом и обозначают интервал доз с альтернативным откликом (ИДАО) первого приближения - с отсутствием эффекта на одном крае интервала и наличием эффекта на другом крае - при десятикратном различии доз.

Затем ИДАО сужают путем последовательного двукратного сокращения до кратности различия альтернативных доз менее чем в два раза (перекрытие распределений смежных доз наблюдается при их различии менее чем в два раза [Попова Е.Б. Планирование исследований и анализ зависимостей «доза-эффект» токсичных и лекарственных веществ [текст]: дис. докт. мед. наук: 14.03.04, 14.03.06: защищена в 2010 г. / Попова Елена Борисовна. - С-Пб., 2010. - 254 с], поэтому две точки, различающиеся по величине доз менее чем в два раза, теоретически можно объединить в одну). На этом этапе повторные введения веществ одним и тем же животным исключаются. Схема введения доз при этом имеет вид, аналогичный представленному на фиг. 2.

Первое разведение готовят из рабочего раствора, на котором развился целевой эффект, и рабочего раствора, на котором не развился целевой эффект - ближайших на шкале доз и являющихся границами ИДАО. Растворы смешивают в объемном соотношении 1:1, получая раствор с промежуточной («срединной») концентрацией вещества. Введение вещества осуществляется исходя из стандартного отношения количества раствора к массе животного, мл/кг. Так поступают при всех последующих сужениях новообразованных ИДАО - растворы смешивают всегда исходя из равного соотношения объемов и вводят животным количество раствора, одинаковое в относительных единицах (изменять величину вводимой дозы путем изменения относительного объема введения при использовании данного способа недопустимо).

Независимо от исхода каждого введения вещества отдельным животным (отсутствие или наличие эффекта) происходит быстрое сужение границ ИДАО. При сужении ИДАО с десятикратного до двукратного различия альтернативных доз затрачивают от 2 до 5 животных. Схема двукратного сокращения интервала согласуется с двоичной системой счета, поэтому она является самой экономной схемой проведения токсикологического эксперимента. У этой схемы имеется еще один положительный момент - все разведения готовят путем смешения двух одинаковых объемов, что снижает вероятность ошибки разведения¹ (¹Для правильной организации работы и исключения ошибок рекомендуется при разведениях использовать отдельный штатив, на котором следует выстраивать пробирки в соответствии с расположением доз на шкале: слева поочередно ставить пробирки с рабочими растворами «нулевого эффекта», с правой стороны - пробирки с рабочими растворами «целевого эффекта»).

Вводимая доза для животных (мг/кг) определяется стандартно: умножением концентрации раствора вещества (мг/мл) на относительный объем введения (мл/кг).

Далее по границам минимизированного ИДАО (с менее чем двукратным различием доз на границах интервала) определяют среднюю дозу, которую вводят в группе из четырех животных. Путем объединения эффектов, находящихся по краям и внутри минимизированного ИДАО, получают экспериментальную точку из шести животных, в которой - при любом раскладе эффектов в группе из четырех животных - общий эффект составляет от 16 до 84% (т.е. дробный эффект находится в общепринято рекомендуемом интервале пробитов от 4 до 6).

Следующий этап исследований по разработке предлагаемого способа посвящен выбору наиболее универсального алгоритма определения дробных эффективных доз.

Предлагается применять упрощенный алгоритм, в котором нет необходимости вычислять коэффициенты а и b (так как коэффициенты а и b рассчитываются с применением D_Y и S, при вычислениях доз с дробными токсикологическими эффектами можно ограничиться только указанными величинами) [Мокшанов И.В. Оптимизация метода расчета краевых доз токсикантов [текст]. М., 2011 г. - 10 с. Деп. в ЦВНИ Минобороны России. Инв. № В 7263, СРДР, сер. Б, вып. 94].

Рассмотрим детально алгоритм определения доз, соответствующих дробным токсическим эффектам, с использованием эффективной дозы вещества-стандарта D_S и функции наклона линии токсичности S² (²В соответствии с п. 2.2.1 «Правил составления, подачи и рассмотрения заявки на выдачу патента на изобретение», представленный алгоритм расчета дробных эффективных доз не является изобретением и не претендуют на правовую охрану. В то же время данный алгоритм является частью предлагаемого способа).

Выражение в уравнении (2) преобразовано путем подстановки вместо b правой части уравнения (5)

Путем замещения коэффициента а на правую часть уравнения (4) образовано выражение

где Y_S - пробит для исходной дозы D_S вещества-стандарта;

Y_i - произвольно задаваемый пробит, отражающий частоту эффекта на искомой дозе оцениваемого вещества.

Далее в уравнении (2) вместо степени вставлена результирующая часть уравнения (8) и уравнение (2) приведено к виду, в котором отсутствуют коэффициенты а и b

Далее, учитывая, что lga+lgb=lg(a·b) и 10^lgx=х, уравнение (9) упрощено и приведено к логически завершенному виду (6)

Уравнение (6) может быть использовано для расчета доз с любыми частотами эффектов по дозам вещества-стандарта с любыми частотами эффектов. Как частный случай, данный подход позволяет производить вычисление доз с дробными эффектами по литературным данным, в которых дозы представлены в виде ED₅₀ вместе с функцией наклона линии токсичности S. Учитывая, что средние эффективные дозы имеют пробит 5, вычисление основных доз с дробными эффектами сводится к частным уравнениям:

Пример осуществления способа

Предположим, имеется необходимость определить на некотором веществе дозу (³В частности, определение такой дозы необходимо при расчете индексов безопасности. Например, индекс безопасности Брокка - Шнайдера (Brokk - Shneyder) является отношением DL₁₀/DI₉₀ [Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта [текст] / М.Л. Беленький. - 2-е изд. - Л.: Государственное издательство медицинской литературы, 1963. - 152 с.]; индекс гарантированной защиты (ИГЗ) является отношением DL_10опыт/DL_{99контроль} [Прозоровский В.Б. Индекс гарантированной защиты - новый показатель эффективности антидотов [текст] // В.Б. Прозоровский. - Токсикологический вестник. - 1999. - №4. - С. 10-13].). При этом известно, что доза вещеста-стандарта составляет 20 мг/кг, а функция наклона S вещества-стандарта равна 1,59.

Первая вводимая (минимальная) доза составляет 0,2 мг/кг (сотая часть от дозы вещества-стандарта). Следующая доза, вводимая тому же животному, увеличивается в 9 раз - чтобы суммарная доза превышала предыдущую в 10 раз - она составляет 1,8 мг/кг (суммарная доза составит: 0,2+1,8=2,0 мг/кг). Ожидаемый эффект у первого животного не развивается, лимит допустимого объема введения растворов вещества животному исчерпывается. Для продолжения исследования берется новое животное. Допустим, при введении второму животному дозы 20,0 мг/кг развивается ожидаемый эффект. Таким образом, определяются границы интервала доз с альтернативным откликом при десятикратном различии доз: нижняя (без эффекта) - 2,0 мг/кг, верхняя (с эффектом) - 20,0 мг/кг.

Далее производится сужение интервала доз с альтернативным откликом путем последовательного двукратного сокращения - до кратности различия величины доз менее двух. Сначала определяется середина интервала альтернативного отклика для доз 2 и 20 мг/кг: (2+20)/2=11 мг/кг. При введении этой дозы получают отрицательный отклик. Дальнейшего сужения интервала с альтернативным откликом не требуется, так как его границы по величине различаются менее чем в два раза (20,0/11,0≈1,82).

Реперная доза для введения в группе из четырех животных определяется как средняя величина границ последнего интервала доз с альтернативным откликом: (20,0+11,0)/2≈15,5 мг/кг (при указанной близости объединяемых доз средняя арифметическая величина мало отличается от средней геометрической, общепринято рассчитываемой для учета логнормальности распределения токсикологических характеристик веществ).

Если в группе из четырех животных получают стопроцентный эффект, на объединенной точке суммарный эффект составит 5/6 или 83%. Для перевода процентов в пробиты используют таблицу 1, взятую из [Derelanko M.J. The toxicologist′s pocket handbook [text] / M.J. Derelanko - 2-nd edit. - New York: CRC Press. - 2008. - 394 p.], или аналогичную представленной.

Частоте эффекта 83% соответствует пробит 5,95.

В соответствии с поставленной задачей, учитывая величину, S=1,59, рассчитывается ED₁₀ по формуле (6)

ED₁₀=ED₈₃·S^(3,72-5,95)=15,5·1,59^(3,72·5,95)=5,5 мг/кг.

Преимущества способа:

- способ позволяет гибко проводить токсикологический эксперимент и минимизировать количество животных и количество оцениваемого вещества. Экономия животных составляет более 50%;

- при сужении интервала доз с альтернативным откликом рабочие растворы готовятся путем смешения двух одинаковых объемов, что снижает вероятность ошибки разведения;

- предлагаемый способ является удобным и обеспечивает надежность, соответствующую уровню экспресс-методов. Он является универсальным, так как позволяет определять дозу тестируемого вещества с любыми дробными эффектами по дозам вещества-стандарта с любыми дробными эффектами.