ПРОБИОТИЧЕСКИЕ БАКТЕРИИ, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к композиции, обладающей антиоксидантной активностью. Кроме того, настоящее изобретение относится к пробиотическим бактериям, обладающим антиоксидантной активностью, и их применению.

Хорошо известно, что все формы жизни сохраняют восстановительную среду внутри своих клеток. Любое изменение окислительно-восстановительного состояния может вызвать токсические воздействия из-за выработки и последующего накопления пероксидов и свободных радикалов. Именно их избыток влечет за собой оксидативный стресс, который, по-видимому, ассоциирован со многими патологиями человека, такими как: атеросклероз, артериальная гипертензия, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, диабет, колит, ревматоидный артрит.

В физиологических условиях существует равновесие между уровнями свободных радикалов, вырабатываемых во время нормального клеточного метаболизма, и уровнями эндогенных антиоксидантов, которые способны защищать ткани от окислительного повреждения. Нарушение этого равновесия вследствие как повышения выработки радикалов, так и снижения уровней антиоксидантов, в результате приводит к возникновению изменений в структуре и функции клеток. Физиологически клетка обладает способностью производить антиоксидант и, следовательно, защитное действие против свободных радикалов благодаря присутствию особых защитных механизмов как ферментативной, так и неферментативной природы.

Даже несмотря на то, что клетки обладают защитной способностью, многие факторы повседневной жизни вносят вклад в снижение этой защитной способности.

Хорошо известно, например, что табачный дым и потребление алкоголя и лекарств, а также чрезмерное неконтролируемое воздействие ионизирующего излучения может способствовать снижению защитной способности клеток.

Более того, темп повседневной жизни в сочетании с несбалансированным питанием, содержащим недостаточно фруктов, овощей и рыбы, конечно, не дает возможности организму получить достаточную добавку в виде витаминов, минералов и микроэлементов, обладающих антиоксидантной активностью.

Поэтому, необходимо обогащать пищу большим количеством специфических антиоксидантных веществ, которые действительно способны проявлять антиоксидантную активность внутри организма человека.

В частности, необходимо получить композицию, которая после введения в организм способна пополнять количество антиоксидантных веществ, обычно присутствующих в организме, таким образом способствуя уменьшению оксидативного стресса.

Наконец, необходимо получить композицию, которая способна эффективно поддерживать антиоксидантную защиту на высоком уровне, после того как оксидативный стресс был спровоцирован внешними факторами, например после приема лекарств.

Таким образом, объектом настоящего изобретения является композиция, обладающая свойствами, изложенными в прилагаемой формуле изобретения.

Объект настоящего изобретения дополнительно относится к применению указанной композиции, как изложено в прилагаемой формуле изобретения.

Другие предпочтительные воплощения настоящего изобретения описаны ниже в описании и заявлены в прилагаемых зависимых пунктах формулы изобретения.

Краткое описание графических материалов

Фиг.1 относится к гистограмме, которая показывает значения общей антиоксидантной активности (ОАА) в отношении:

- C (контрольный образец в исходных условиях),

- T2 (контрольный образец, обработанный пробиотическими бактериями по настоящему изобретению в дозе 10⁸/сутки в исходных условиях),

- C+DOX (контрольный образец, обработанный доксорубицином),

- T1+DOX (образец, обработанный пробиотическими бактериями по настоящему изобретению в дозе 10⁹/сутки и доксорубицином),

- T2+DOX (образец, обработанный пробиотическими бактериями по настоящему изобретению в дозе 10⁸/сутки и доксорубицином), и

- T3+DOX (образец, обработанный пробиотическими бактериями по настоящему изобретению в дозе 10⁷/сутки и доксорубицином).

Фиг.2 относится к гистограмме, которая показывает значения концентрации глутатиона в плазме (антиоксидантную форму глутатиона называют восстановленный глутатион, GSH) в качестве оценки антиоксидантной способности, в отношении:

- C (контрольный образец в исходных условиях),

- T2 (контрольный образец, обработанный пробиотическими бактериями по настоящему изобретению в дозе 10⁸/сутки в исходных условиях),

- C+DOX (образец, обработанный доксорубицином),

- T1+DOX (образец, обработанный пробиотическими бактериями по настоящему изобретению в дозе 10⁹/сутки и доксорубицином),

- T2+DOX (образец, обработанный пробиотическими бактериями по настоящему изобретению в дозе 10⁸/сутки и доксорубицином), и

- T3+DOX (образец, обработанный пробиотическими бактериями по настоящему изобретению в дозе 10⁷/сутки и доксорубицином).

В таблице 1 ниже показана в качестве примера группа микроорганизмов, имеющих обоснованную применимость в контексте настоящего изобретения.

Заявитель провел развернутое исследование активности, после которого было установлено, что бактериальные штаммы, принадлежащие к виду, выбранному из группы, содержащей Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis и Bifidobacterium lactis, демонстрируют значительную антиоксидантную активность, благодаря которой возможно использование выбранных штаммов в композиции для применения в качестве лекарственного средства для уменьшения оксидативного стресса.

Преимущественно композицию по настоящему изобретению применяют в случаях, когда оксидативный стресс вызван в результате приема лекарств субъектом, которого подвергают лечению.

В предпочтительном воплощении композиция по настоящему изобретению может содержать смесь штаммов, которая содержит один или более чем один бактериальный штамм, принадлежащий к виду Lactobacillus acidophilus, например два или три штамма; один или более чем один бактериальный штамм, принадлежащий к виду Lactobacillus brevis, например два или три штамма; и один или более чем один бактериальный штамм, принадлежащий к виду Bifidobacterium lactis, например два или три штамма.

В предпочтительном воплощении композиция по настоящему изобретению содержит смесь, содержащую по меньшей мере один штамм, выбранный из группы, содержащей:

- Bifidobacterium lactis BS 05 (ID 1666), депонированный Probiotical SpA, Novara (Италия) в DSMZ (Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур) в Германии 13.10.2009 и имеющий депозитный номер DSM 23032, и/или

- Lactobacillus acidophilus LA 06 (ID 1683), депонированный Probiotical SpA, Novara (Италия) в DSMZ в Германии 13.10.2009 и имеющий депозитный номер DSM 23033, и/или

- Lactobacillus brevis LBR01 (ID 1685), депонированный Probiotical SpA, Novara (Италия) в DSMZ в Германии 13.10.2009 и имеющий депозитный номер DSM 23034.

Преимущественно смесь бактериальных штаммов состоит из Bifidobacterium lactis BS 05 (ID 1666) DSM 23032, Lactobacillus acidophilus LA 06 (ID 1683) DSM 23033 и Lactobacillus brevis LBR01 (ID 1685) DSM 23034.

В контексте настоящего изобретения бактериальные штаммы могут находиться в виде живых бактерий или убитых бактерий или их клеточных компонентов, клеточных экстрактов и/или инактивированных, лизированных или пермеабилизированных бактерий.

Композиция по настоящему изобретению может представлять собой пищевую композицию, например симбиотическую композицию или же добавку или фармацевтическую композицию.

В предпочтительном воплощении композиция может дополнительно содержать один или более чем один бактериальный штамм, из числа штаммов, перечисленных ниже в таблице 2.

Предпочтительно композиция может более того содержать от одного до шести штаммов, даже более предпочтительно от одного до трех штаммов, выбранных из числа штаммов, перечисленных ниже в таблице 2.

В частности, предпочтительные штаммы выбраны из числа штаммов, перечисленных ниже в таблице 2, идентифицируемых по номеру, находящемуся в колонке слева: №5, №20, №42, №49, №80, №81, №92, №93, №99, №100 и №101.

Штаммы №99, №100 и №101 являются особенно предпочтительными, поскольку они обладают выраженной антиоксидантной активностью.

Штаммы №5 и №20 также обладают, помимо всего прочего, противовоспалительными свойствами.

Штаммы №42, №80 и №81 также способны бороться с инфекциями, например кишечными дрожжевыми инфекциями, включая инфекции, вызываемые дрожжевыми грибами рода Candida.

Штамм №49 также способен продуцировать фолаты в кишечнике.

Штаммы №5, №92 и №93 также способны проявлять антагонизм в отношении кишечной палочки Е. coli.

Таблица 2

Все штаммы, описанные и/или заявленные в настоящей заявке на патент, депонированы в соответствии с Будапештским договором и по требованию предоставляются общественности компетентным органом по депонированию.

Преимущественно композиция по настоящему изобретению может содержать элементы или вещества с антиоксидантной активностью, такие как, например, селен, цинк, магний, марганец, глутатион, супероксиддисмутаза (СОД), витамин C, витамин E, бета-каротин, каротиноиды, рибофлавин, таурин, L-карнозин, астаксантин, ликопин, масло семян томата, кверцетин, тирозол, ресвератрол, гидрокситирозол, олеуропеин, лютеин, спирулин, капсаицин, прополис, женьшень, гинкго билоба, коэнзим Q₁₀, альфа-липоевая кислота, омега-3 ненасыщенные жирные кислоты, например докозагексаеновая кислота (ДГК) и эйкозапентаеновая кислота (ЭПК), экстракты ягод, такие как экстракты черники, клюквы, смородины и виноградных косточек, экстракт зеленого чая, экстракты кактуса, артишока, папайи, дыни, яблока, хмеля, камелии, красного клевера, бузины, розмарина, какао, листьев оливкового дерева, коры сосны и овсяного корня и другие растительные экстракты, содержащие полифенолы в количестве более 1% по массе.

Преимущественно указанные экстракты могут предварительно быть подвергнуты по меньшей мере одной стадии ферментации. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения используют ферментированную папайю. Ферментированную папайю получают и экстрагируют из плодов папайи и из некоторых тропических растений после ферментации с помощью дрожжей (предпочтительно рода Saccharomyces) и бактерий. Ферментированная папайя усиливает активность штаммов по настоящему изобретению не только с точки зрения антиоксидантной активности, но также с точки зрения уменьшения количества свободных радикалов, ингибирования перекисного окисления липидов, укрепления иммунной системы, подщелачивающих свойств и хелатирования переходных металлов как в in vitro, так и в in vivo экспериментальных системах с последующим антисептическим действием в отношении микроорганизмов, ответственных за кишечные инфекции.

Указанные элементы или вещества с антиоксидантной активностью, как описано выше, добавляют в количестве, по массе составляющем от 0,0001% до 30% от массы конечной композиции, в зависимости от концентрации веществ с антиоксидантной активностью и/или рекомендуемой суточной нормы (РСН), когда она определена.

Селен может присутствовать в виде селената натрия, селенита натрия и кислого селенита натрия, а также в виде микроорганизмов, например обогащенных селеном дрожжей, в количестве, по массе составляющем от 0,0005% до 0,005% от массы конечной композиции, в любом случае достаточном для внесения количества селена, предпочтительно составляющего от 10 мкг до 150 мкг.

В предпочтительном воплощении композиция по настоящему изобретению дополнительно содержит один или более чем один бактериальный штамм, способный интернализировать селен.

Используемыми штаммами, в частности, являются штаммы, депонированные компанией BIOMAN S.r.I., Via Alfieri 18, 10100 Turin, а именно: Lactobacillus buchneri LB26BM, депонированный в DSMZ 05/04/2004 и имеющий депозитный номер DSM 16341; Lactobacillus ferintoshensis LB6BM, депонированный в DSMZ 17/01/2004 и имеющий депозитный номер DSM 16144; Lactobacillus reuteri LB2BM, депонированный в DSMZ 17/01/2004 и имеющий депозитный номер DSM 16143, в сочетании со штаммами по настоящему изобретению, обладающими антиоксидантной активностью.

Фактически, указанные штаммы способны накапливать внутри клеток большие количества селена, особенно в органической форме, если они растут в присутствии подходящего источника селена в культуральной среде.

Глутатион является сильным антиоксидантом, несомненно одним из наиболее важных среди тех, которые способен продуцировать организм. Он имеет значительное воздействие как на свободные радикалы, так и на молекулы, такие как пероксид водорода, нитриты, нитраты, бензоаты и другие. Он оказывает важное действие на эритроциты, защищая указанные клетки от опасного оксидативного стресса, который может вызвать гемолиз. В частности, антиоксидантную форму глутатиона называют восстановленный глутатион (или GSH).

В предпочтительном воплощении композиция содержит глутатион в восстановленной форме и селен в количестве, по массе составляющем от 0,5% до 10% от массы конечной композиции.

Преимущественно, поскольку глутатион может частично инактивироваться при пероральном приеме, композиция может содержать сульфоаминокислоту цистеин и/или N-ацетилцистеин и/или их смеси.

В предпочтительном воплощении применение находит масло семян томата, так как в нем чрезвычайно высокое содержание ликопина, каротиноида с выраженной антиоксидантной активностью, в сочетании с антиоксидантными штаммами по настоящему изобретению.

В композиции по настоящему изобретению смесь бактериальных штаммов находится в количестве, по массе составляющем от 0,5 до 20% от общей массы композиции, предпочтительно от 2,5 до 8%.

В предпочтительном воплощении композиция может дополнительно содержать по меньшей мере одно пребиотическое волокно и/или углеводы, обладающие бифидогенным действием, такие как, например, инулин, фруктоолигосахариды (ФОС), галакто- и трансгалактоолигосахариды (ГОС и ТОС), глюкоолигосахариды (ГОСα), ксилоолигосахариды (КОС), олигосахариды хитозана (ХОС), соевые олигосахариды (СОС), изомальтоолигосахариды (ИМОС), резистентный крахмал, пектин, псиллиум (оболочка семян подорожника), арабиногалактаны, глюкоманнаны, галактоманнаны, ксиланы, лактосахароза, лактулоза, лактит и различные другие типы камедей, камедь акации, камедь рожкового дерева, овса или бамбука, цитрусовые волокна и, в основном, волокна, содержащие растворимую и нерастворимую часть в переменных соотношениях.

В предпочтительном воплощении изобретения композиция содержит по меньшей мере одно пребиотическое волокно, выбранное из вышеупомянутых волокон и/или подходящих их смесей в любом относительном процентном отношении.

Количество пребиотических волокон и/или углеводов, обладающих бифидогенным действием, если они присутствуют в композиции, составляет по массе от 0 до 60%, предпочтительно от 5 до 45% и даже более предпочтительно от 10 до 30% от общей массы композиции. В этом случае композиция или добавка обладает симбиотической активностью и функциональными свойствами.

Более того, в составе пищевого продукта или добавки могут также содержаться другие активные ингредиенты и/или компоненты, такие как витамины, минералы, биологически активные пептиды, вещества, обладающие антиоксидантной, гипохолестеринемической, гипогликемической, противовоспалительной активностью, маскирующие сладкий вкус агенты, в количестве, по массе обычно составляющем от 0,001% до 20%, предпочтительно от 0,01% до 5%, в каждом случае в зависимости от вида активного компонента и его рекомендуемой суточной дозы, если она определена, от общей массы композиции.

Пищевую композицию по настоящему изобретению, например симбиотическую композицию, или же добавку, или фармацевтическую композицию, готовят с использованием методов и аппаратуры, известных специалисту в данной области техники.

В предпочтительном воплощении композиция содержит бактерии в концентрации, составляющей от 1×10⁶ до 1×10¹¹ КОЕ (колониеобразующих единиц)/г смеси, предпочтительно от 1×10⁸ до 1×10¹⁰ КОЕ/г смеси.

В предпочтительном воплощении композиция содержит бактерии в концентрации, составляющей от 1×10⁶ до 1×10¹¹ КОЕ/доза, предпочтительно от 1×10⁸ до 1×10¹⁰ КОЕ/доза.

Доза может составлять от 0,2 до 10 г, например она составляет 0,25 г, 1 г, 3 г, 5 г или 7 г.

Пробиотические бактерии, используемые в настоящем изобретении, могут находиться в твердой форме, в частности в форме порошка, дегидратированного порошка или в лиофилизированной форме.

В предпочтительном воплощении смесь бактериальных штаммов содержит по меньшей мере один штамм, выбранный из Bifidobacterium lactis BS 05 (ID 1666) DSM 23032, Lactobacillus acidophilus LA 06 (ID 1683) DSM 23033 и Lactobacillus brevis LBR01 (ID 1685) DSM 23034 в микроинкапсулированной форме, то есть указанный по меньшей мере один штамм (или все три указанных бактериальных штамма) покрыт композицией, содержащей по меньшей мере один липид, предпочтительно растительного происхождения. Затем микроинкапсулированные бактерии добавляют, используя способы обработки, известные специалисту в данной области техники, в жидкую композицию на масляной основе, так чтобы получить масляную суспензию.

Вышеуказанные бактерии, которые добавляют в жидкую композицию на масляной основе, могут находиться в форме микроинкапсулированных бактерий и/или "непокрытых" немикроинкапсулированных бактерий или их смесей.

Бактерии, выбранные из Bifidobacterium lactis BS 05 (ID 1666) DSM 23032, Lactobacillus acidophilus LA 06 (ID 1683) DSM 23033 и Lactobacillus brevis LBR01 (ID 1685) DSM 23034, предпочтительно в микроинкапсулированной форме, могут быть микроинкапсулированы посредством обычных технологий, известных специалисту в данной области техники. Например, может быть использована технология псевдоожиженного слоя (например распыление сверху или распыление снизу), при которой могут быть использованы материалы покрытия липидной природы.

В предпочтительном воплощении используют насыщенные растительные жиры, имеющие температуру плавления ниже 75°C, предпочтительно составляющую от 45 до 65°C.

В предпочтительном воплощении могут быть использованы насыщенные растительные жиры, имеющие определенную степень гидрофильности; они могут быть выбраны из моно- и диглицеридов насыщенных жирных кислот, полиглицеринов, этерифицированных насыщенными жирными кислотами, и свободных насыщенных жирных кислот.

Например, могут быть использованы полиглицерилдистеарат (торговое наименование Plurol Stearique WL 1009), глицерилпальмитостеарат (торговое наименование Precirol Ato 5), насыщенные жирные кислоты (торговое наименование Revel C) или гидрогенизированные растительные жиры нелауринового происхождения.

В предпочтительном воплощении массовое соотношение лиофилизированного микроорганизма и липидного материала покрытия, которое его покрывает, составляет 50:50 или 40:60.

В первом воплощении два липида, выбранные между гидрогенизированным пальмовым жиром (Т.пл. составляет 60°C) и дипальмитостеаратом глицерина (Т.пл. составляет 57-60°C), последовательно распыляют на лиофилизат, то есть применяют двойное покрытие лиофилизата: первое покрытие гидрогенизированным пальмовым жиром и второе покрытие дипальмитостеаратом глицерина в соотношении 3:1. Двойное покрытие клеток обеспечивает лучшую изоляцию бактерий от окружающей среды, создавая непрерывную пленку без пор, сообщающихся с внешней средой. Однако, эта оболочка должна раскрываться на уровне желудочно-кишечного тракта, чтобы высвободить бактерии и дать им возможность колонизировать пространство. Выбранные липиды фактически устойчивы к кислому pH, так что в желудке покрытие остается неповрежденным, но чувствительны даже к слегка щелочному pH, что делает возможным образование пор в покрытии во время его прохождения через кишечник.

В предпочтительном воплощении композиция по настоящему изобретению представляет собой композицию на масляной основе, содержащую лактобактерии с покрытием, как упомянуто выше.

Указанную композицию готовят согласно методам, известным специалисту в данной области техники.

На практике, данное количество масла вводят в сосуд, снабженный перемешивающим и нагревающим устройствами. Затем постепенно добавляют покрытые пробиотические бактерии в твердой форме при перемешивании, так чтобы избежать образования комков и агломератов. После того как добавление бактерий заканчивают, масляную суспензию выдерживают при перемешивании в течение периода времени, составляющего от 1 до 30 минут, если необходимо при незначительном нагревании до температуры, составляющей от 25 до 40°C, предпочтительно от 30 до 35°C.

Композиция, которую получают, имеет сходство с масляной суспензией. Композиция содержит бактерии в количестве, меньшем или равном 30% по массе, составляющем по массе от 0,05 до 20% от общей массы композиции; предпочтительно в количестве, составляющем от 0,5 до 10%; даже более предпочтительно в количестве, составляющем от 1,5 до 5% по массе от общей массы композиции.

Композиция содержит по меньшей мере одно пищевое масло, подходящее для введения субъектам детского возраста, выбранное из группы, содержащей: оливковое масло, кукурузное масло, соевое масло, льняное масло, арахисовое масло, кунжутное масло, рыбий жир и рисовое масло и другие растительные масла, из которых, в частности, может быть использовано масло семян томата.

Указанные масла могут быть использованы по отдельности или совместно в подходящих смесях в соответствующих массовых соотношениях.

Преимущественно указанные масла имеют биологическую чистоту, и их получение может включать стадию рафинирования и/или стадию холодного отжима.

Композиция содержит по меньшей мере одно масло в количестве, по массе превышающем или равном 70% относительно общей массы суспензии, предпочтительно в количестве, составляющем по массе от 75 до 95%, преимущественно по меньшей мере 90% по массе.

Преимущественно композиция содержит только оливковое масло или же оливковое масло в смеси с кукурузным маслом и/или соевым маслом и/или льняным маслом и/или маслом семян томата. Преимущественно оливковое масло является маслом экстра-класса и биочистоты.

В предпочтительном воплощении композиция дополнительно содержит по меньшей мере одно тонкоизмельченное пищевое соединение, выбранное из группы, содержащей кремнезем, диоксид кремния, силикагель, коллоидный диоксид кремния, осажденный диоксид кремния, Syloid® 244, тальк, силикат магния, оксид магния, карбонат магния, силикат кальция, лецитин, моно- или диглицериды, такие как глицерилмоностеарат, глицерилмоноолеат, полиглицеринолеат, крахмал, модифицированные крахмалы, конжаковую камедь, ксантановую камедь, геллановую камедь и каррагинан.

Указанное вещество присутствует в количестве, по массе составляющем от 0,1 до 15% от общей массы композиции, предпочтительно от 1 до 5% по массе от общей массы композиции.

В этом случае методика получения предусматривает, что к данному количеству масла добавляют тонкоизмельченное пищевое вещество, например диоксид кремния, при перемешивании. Затем масло, содержащее указанное вещество, нагревают при перемешивании примерно при 60°C до полного растворения.

Альтернативно, диоксид кремния также может быть добавлен холодным; однако для растворения требуется больше времени.

Затем композицию оставляют для охлаждения от 60°C до комнатной температуры. Затем лиофилизат взвешивают и добавляют в суспензию при перемешивании до полного и гомогенного диспергирования. Композиция, которую получают, имеет сходство с масляной суспензией.

Примеры предпочтительных композиций согласно настоящему изобретению показаны в таблице 3 ниже (примеры 1-4).

Примеры 1-4 даны исключительно в качестве неограничивающего примера настоящего изобретения, и в них рассматривают объем масляной суспензии, подходящий для периода лечения, равного 30 суткам. Указанное количество жизнеспособных микроорганизмов, выраженное в миллиардах живых клеток, таким образом соответствует 30 дозам. Однократная доза составляет, на момент приготовления, 1,5 миллиарда/штамм в примерах 1 и 2 и 2,5 миллиарда/штамм в примерах 3 и 4.

Заявитель обнаружил, что возможно использование различных объемов масляной суспензии, например 5 мл, подходящих для более коротких периодов лечения.

В предпочтительном воплощении масляная суспензия может дополнительно содержать в количестве, по массе составляющем от 0,5 до 25% от общей массы суспензии, по меньшей мере одно пребиотическое волокно и/или по меньшей мере один бифидогенный углевод, выбранный из инулина, фруктоолигосахаридов (ФОС), галакто- и трансгалактоолигосахаридов (ГОС и ТОС), глюкоолигосахаридов (ГОСα), ксилоолигосахаридов (КОС), олигосахаридов хитозана (ХОС), соевых олигосахаридов (СОС), изомальтоолигосахаридов (ИМОС), мальтодекстрина, резистентного крахмала, пектина, псиллиума, арабиногалактанов, глюкоманнанов, галактоманнанов, ксиланов, лактосахарозы, лактулозы, лактита, волокна акации, волокна рожкового дерева, волокна овса, бамбукового волокна и цитрусового волокна.

Пребиотические волокна и углеводы обладают двойной функцией. Первая функция состоит в оказании пребиотического действия. Вторая функция состоит в оказании технологического действия в качестве загустителя и стабилизатора.

Преимущественно указанное по меньшей мере одно волокно и указанный по меньшей мере один углевод выбраны из глюкоолигосахаридов (ГОСα), фруктоолигосахаридов (ФОС), инулина и/или мальтодекстрина. Суспензия содержит штаммы микроинкапсулированных микроорганизмов с по меньшей мере одним липидом, имеющим температуру плавления ниже 75°C, которая предпочтительно составляет от 45 до 65°C.

Суспензия показана для применения в качестве лекарственного средства для лечения расстройств кишечника, таких как, например, колика у детей.

В другом предпочтительном воплощении композицию по настоящему изобретению готовят в виде саше. В таблице 4 ниже показаны примеры 5-8.

В примере 6 штамм Lactobacillus buchneri LB26BM (DSM 16341) содержит 50 мкг/г селена, аккумулированного внутри клетки преимущественно в форме селен-метионина и селен-цистеина; таким образом, 1 грамм обеспечивает 90% РСН указанного элемента.

В примере 7 композиция содержит 3 грамма ферментированной папайи, обладающей синергическим действием со штаммом В. lactis BS05 (DSM 23032).

Ниже дано описание технологических условий культивирования штаммов Bifidobacterium lactis BS 05 (ID 1666) DSM 23032, Lactobacillus acidophilus LA 06 (ID 1683) DSM 23033 и Lactobacillus brevis LBR01 (ID 1685) DSM 23034. Эти условия применимы для всех штаммов, если не оговорено особо.

1) Используемая среда: TPY (трипсинизированный) бульон плюс Cys HCl (гидрохлорид цистеина) 0,5 г/л для DSM 23032, и MRS (бульон Мана, Рогоза и Шарпа) фирмы Difco номер по каталогу 288130 для DSM 23033 и DSM 23034.

2) pH среды перед стерилизацией: 7,10 для DSM 23032 и 7,00 для DSM 23033 и DSM 23034.

3) Стерилизация: 15 минут при 121°C.

4) pH среды после стерилизации: 6,60 для DSM 23032 и 6,50 для DSM 23033 и DSM 23034.

5) Отношение к содержанию кислорода: облигатно-анаэробный тип дыхания для DSM 23032 и факультативно-анаэробный или микроаэрофильный тип дыхания для DSM 23033 и DSM 23034.

6) Температура инкубирования: 37°C.

7) Время инкубирования: 17 часов для DSM 23032 и 15 часов для DSM 23033 и DSM 23034.

8) Температура кратковременного хранения: 5°C.

9) Время переноса: 2 суток.

10) Температура долговременного хранения: -25°C.

11) Условия проведения теста на жизнеспособность: выращивание в TPY бульоне при 37°C в течение ночи или до достижения соответствующего помутнения для DSM 23032 и выращивание в MRS-бульоне при 37°C в течение ночи для DSM 23033 и DSM 23034.

12) Описание: палочки различной формы, грамположительные, кислотность среды создают медленно, неспорообразующие, анаэробные, расщепляют исключительно глюкозу и характерным образом посредством фруктозо-6-фосфатного фосфокетолазного пути в случае DSM 23032; палочки с закругленными концами, расположены одиночно или цепочками, хороший рост при 37°C и облигатно-гомоферментативный тип брожения для DSM 23033, облигатно-гетероферментативный тип брожения для DSM 23034.

Экспериментальная часть

Заявитель провел крупномасштабный скрининг большого числа пробиотических бактерий с целью идентификации одного или более чем одного микроорганизма, обладающего антиоксидантной активностью.

Первый скрининг активности проводили с помощью ряда in vitro тестов. В частности, оценивали общую антиоксидантную активность (ОАА) как целых клеток, так и клеточных экстрактов.

В случае целых клеток потенциальную антиоксидантную активность исследовали посредством проведения двух тестов:

- самоокисление аскорбиновой кислоты AA%,

- окисление линоленовой кислоты LA%.

В обоих тестах определяли способность бактериального штамма, используемого в виде целых клеток, предохранять аскорбиновую кислоту или линоленовую кислоту от окисления.

Более подробно, кинетику реакции самоокисления аскорбиновой кислоты можно определить посредством спектрофотометрического метода регистрации при 265 нм присутствия дегидроаскорбиновой кислоты, тем самым предлагая меру антиоксидантной силы, оцениваемой как способность ингибировать указанную реакцию самоокисления.

В качестве альтернативы, использовали анализ тиобарбитуровой кислоты для контроля способности бактериальных штаммов ингибировать перекисное окисление линоленовой кислоты. Фактически, окисление линоленовой кислоты является причиной возникновения автокаталитической цепи, которая ведет к образованию различных радикалов. Одним из продуктов деструкции под действием радикалов является малональдегид, который может быть использован в качестве индикатора оксидативного стресса в анализе тиобарбитуровой кислоты, поскольку он способен взаимодействовать с указанной кислотой с образованием красного хромогенного комплекса, который можно определить спектрофотометрически при 534 нм.

Исследовательская работа, проведенная в качестве альтернативы на клеточных экстрактах, включала следующие тесты:

- Trolox^®-эквивалент антиоксидантной способности (ТЕАС) %,

- Глутатион (GSH) нмоль/мг,

- Супероксиддисмутаза (СОД) Ед/мг.

Первый тест основан на взаимодействии молекул антиоксиданта с катион-радикалом ABTS·+(2,2′-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат)).

Этот радикал может быть восстановлен, с вытекающим из этого уменьшением поглощающей способности, антиоксидантом, способность которого служить в качестве ловушки может быть измерена спектрофотометрически при 734 нм. Тест проводят при 37°C, и результаты получают путем сравнения с Trolox^® (синтетический антиоксидант, гидрофильный аналог витамина E), чтобы определить миллимолярную концентрацию раствора Trolox^®, обладающего антиоксидантной способностью, эквивалентную способности 1 мМ раствора анализируемого субстрата (ТЕАС).

Во втором и третьем тесте измеряют концентрацию восстановленного глутатиона (GSH) и фермента супероксиддисмутазы (СОД), которые способен продуцировать отдельный бактериальный штамм. Обе молекулы, как известно, обладают антиоксидантной активностью.

Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяют посредством спектрофотометрического метода, применяя принцип ингибирования ферментом окисления эпинефрина (4-[1-гидрокси-2-(метиламино)-этил]-1,2-бензолдиол). Окисление с помощью O2 происходит при щелочном pH с получением супероксид-анионов (O2-), которые при накоплении в растворе способствуют превращению эпинефрина в адренохром (3-гидрокси-1-метил-5,6-индолиндион), окрашенное соединение, которое дает возможность контролировать ход реакции на основании измерения поглощающей способности.

Присутствие супероксиддисмутазы (СОД) устраняет ионы O2- и восстанавливает скорость образования и количество адренохрома. Процент ингибирования окисления является гиперболической функцией концентрации СОД.

Количественный анализ глутатиона может быть проведен с использованием спектрофотометрического метода, который основан на ферментативной реакции Элмана: сульфгидрильная группа глутатиона (GSH) взаимодействует с 5,5′-дитиобис-2-нитробензойной кислотой (DTNB), образуя соединение желтого цвета: 5-тио-2-нитробензойную кислоту (TNB). Одновременно, окисленный глутатион снова восстанавливается глутатионредуктазой, приводя к дополнительному образованию TNB. Скорость образования TNB прямо пропорциональна общей концентрации GSH, выраженной в наномолях на мг белка, присутствующего в клеточном экстракте.

Результаты показаны ниже в таблице 1a.

Из данных, представленных в таблице 1, можно сделать вывод, что эти штаммы обладают значительной антиоксидантной активностью, наблюдаемой как для целых клеток, так и для клеточных экстрактов.

Впоследствии, чтобы подтвердить антиоксидантную активность штаммов по настоящему изобретению также и в in vivo модели, заявитель провел исследование на животных.

В частности, исследование проводили на отобранной популяции из 48 здоровых взрослых крыс линии Wistar (Harlan, Милан, Италия), которых кормили стандартным кормом в течение 7 суток.

Затем 48 крыс делили на следующие группы:

- Группа C: контрольная группа, содержащая 20 крыс, получающих только стандартный корм без пробиотиков в течение 18 суток.

- Группа T1: исследуемая группа, содержащая 7 крыс, получающих корм, в течение 18 суток, с добавлением смеси бактерий, содержащей штаммы Bifidobacterium lactis BS 05 (ID 1666) DSM 23032, Lactobacillus acidophilus LA 06 (ID 1683) DSM 23033 и Lactobacillus brevis LBR01 (ID 1685) DSM 23034 в массовом соотношении 1:1:1 (далее для краткости обозначаемой М) в концентрации 1×10⁹ КОЕ/сутки. Более конкретно, вышеупомянутые пробиотические штаммы смешивали с кормом для крыс в такой концентрации, при которой общее количество 1×10⁹ КОЕ находилось в среднем количестве корма, потребляемом в сутки отдельным животным.

- Группа T2: исследуемая группа, содержащая 14 крыс, получающих корм с добавлением смеси M, как описано выше, в концентрации 1×10⁸ КОЕ/сутки в течение 18 суток.

- Группа T3: исследуемая группа, содержащая 7 крыс, получающих корм с добавлением смеси M, как описано выше, в концентрации 1×10⁷ КОЕ/сутки в течение 18 суток.

В конце этого 18-суточного периода крыс в группе C и группе T2 делили на две подгруппы, соответственно по 10 и 7 крыс в каждой: одной подгруппе (Cf и T2f) вводили физиологический раствор, а другой раствор доксорубицина (сокращенно DOX), противоопухолевого лекарственного препарата с прооксидантной активностью, который способен вызывать сильный оксидативный стресс, в дозе 20 мкг/г массы тела (CDOX и T2DOX). Всем крысам групп T1 и T3 вводили такую же дозу доксорубицина (T1DOX и T3DOX).

Крыс затем умерщвляли в пределах 24 часов после инъекции физиологического раствора или DOX. Затем брали образцы плазмы, чтобы измерить общую антиоксидантную активность (ОАА) in vitro и уровни глутатиона в восстановленной форме (GSH) (Фиг.1 и 2).

Сравнение CDOX и T1DOX, T2DOX и T3DOX позволяет оценить возможную защиту части смеси пробиотиков от оксидативного стресса, вызванного доксорубицином, также выявляя возможную зависимость доза-эффект в соответствии с числом введенных жизнеспособных клеток.

Сравнение между Cf и T2f служит для выявления возможного повышения антиоксидантной активности, вызванного пробиотическими штаммами в физиологических условиях, в отсутствии, следовательно, оксидативного стресса, вызванного доксорубицином.

На Фиг.1 и 2 (общая антиоксидантная активность, ОАА и концентрация глутатиона в плазме, соответственно) эффект обработки пробиотиками в случае оксидативного стресса (различия между контрольной группой CDOX и группами T1DOX, T2DOX и T3DOX) оценивали посредством статистического анализа ANOVA (дисперсионный анализ) при сравнении всех крыс, которые получили DOX. Эффекты при введении доксорубицина оценивали посредством дисперсионного анализа (при использовании апостериорного критерия Тьюки) и путем сравнения всех групп, обработанных DOX, с исходным контролем (Cf). Отличия между контролем (Cf) и группой, получавшей пробиотики в исходных условиях (T2f), оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.

Из Фиг.1 можно видеть, что в исходных условиях (C и T2) обработка пробиотиками не изменяет ОАА (статистически незначимое сравнение, n.s.). У крыс, не получавших пробиотики, введение DOX вызывает значительный спад ОАА по сравнению с исходными значениями (t-критерий p<0,001). Также, у крыс, получавших пробиотики, введение DOX вызывает снижение ОАА по сравнению с исходными значениями (Cf), но при обработке более высокими концентрациями пробиотиков (T1 и T2) снижение является меньшим (t-критерий p<0,02). У крыс, получавших более низкие концентрации пробиотиков (T3), после введения DOX снижение ОАА является большим (t-критерий p<0,001). Различие среди групп, обработанных DOX, является значительным (ANOVA p<0,05).

На Фиг.2 концентрацию GSH используют в качестве меры антиоксидантной активности. При оксидативном стрессе уровни GSH снижены.

C в сравнении с T2: t-критерий p>0,05 (статистически незначимо, n.s.). Дисперсионный анализ сравнения С со всеми группами, обработанными DOX: p<0,001.

Апостериорный критерий (Тьюки):

C в сравнении с C+DOX p<0,001

C в сравнении с T1+DOX n.s.

C в сравнении с T2+DOX p<0,05

C в сравнении с T3+DOX p<0,01.

На Фиг.2 показано, что в исходных условиях не существует различий между контролем и крысами, получавшими смесь M. У контрольных крыс оксидативный стресс вызывает сильное снижение концентрации GSH (p<0,001). У крыс, получавших смесь M в самой высокой концентрации (T1), инъекция DOX не вызывает значительного уменьшения уровней GSH (n.s.). У крыс, получавших промежуточную дозу смеси М, наблюдают снижение, сравнимое с исходным контролем, но статистический уровень значимости ниже (p<0,05). У крыс, получавших пробиотики в самой низкой дозе, снижение уровней GSH является даже более явным (p<0,01). Отличие между различными группами, обработанными DOX, является значительным (ANOVA p<0,05).

Все данные, приведенные выше, показывают, что введение смеси трех пробиотических штаммов (смесь M) способно уменьшать оксидативный стресс, вызванный инъекцией доксорубицина, противоопухолевого лекарственного препарата с прооксидантной активностью (см. Фиг.1, сравнение между C+DOX и T1+DOX).

Оксидативный стресс оценивали на основании как снижения уровня общей антиоксидантной активности в плазме, так и уровня глутатиона в восстановленной форме (GSH) в плазме. Глутатион является важной молекулой, способной бороться с оксидативным стрессом и нейтрализовать свободные радикалы, присутствующие в плазме.

Наиболее интересными сравнениями являются сравнения между группой C+DOX (контрольная группа, не получавшая пробиотики, но получившая инъекцию доксорубицина через 18 суток) и группами T1+DOX/T2+DOX (группы, получавшие пробиотики, соответственно в количестве 10⁹ и 10⁸ КОЕ/сутки, которым вводили доксорубицин через 18 суток). Показано, что наиболее низкая концентрация пробиотиков, то есть 10⁷ КОЕ/сутки (группа T3), является менее полезной для уменьшения оксидативного стресса, вызванного доксорубицином.

В любом случае, авторы полагают, что концентрация 10⁸ КОЕ/сутки для крыс может соответствовать количествам, обычно используемым для людей (10¹⁰-10¹¹ КОЕ/сутки).