СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ОПУХОЛЕВЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ГЛИОБЛАСТОМЫ

Изобретение относится к медицине, а точнее к онкологии, и может быть использовано при лабораторной доклинической молекулярно-биологической оценке терапевтической эффективности противоопухолевого препарата, полученного путем целенаправленной модификации транскриптомного профиля гемопоэтических стволовых и прогенеторных клеток (СК и ПК), используемых для проведения высокотехнологичного комплексного лечения предпочтительно злокачественных глиальных опухолей головного мозга.

Получение персонифицированных клеточных систем из СК и ПК пациента включает сбор СК стандартными методами (мобилизации СК в периферическую кровь с использованием гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), эксфузии СК из костного мозга пациента, забора обонятельной выстилки носа или липосакции и т.д.), ресуспензирование первичного биоматериала, иммуносепарацию СК из клеточной суспензии по маркерам клеточной поверхности, а при необходимости увеличение клеточной массы для анализа и культивирования этих клеток. В дальнейшем клеточные системы отмывают центрифугированием и стандартно криоконсервируются с 10% раствором диметилсульфоксида (ДМСО) в жидком азоте при температуре -196 градусов до клинического использования. Перед применением клеточный препарат размораживают на водяной бане, 2-кратным центрифугированием препарат отмывается от ДМСО 0,9% физиологическим раствором NaCl.

В настоящее время используют различные способы получения опухолевых стволовых клеток. В одном из них линию стволовых клеток получают из внутренней клеточной массы нормального эмбриона на стадии бластоцисты (см. патенты US №№5843780 и 6200806, 1998). Во втором способе для создания плюрипотентных эмбриональных стволовых (ЭС) клеток используют перенос ядра соматической клетки (SCNT). По данной методике ядро удаляют из нормальной яйцеклетки, тем самым удаляя генетический материал. Ядро донорской диплоидной соматической клетки вводят непосредственно в безъядерный ооцит, например, при помощи микроманипуляции либо донорскую диплоидную соматическую клетку помещают рядом с безъядерной яйцеклеткой и проводят слияние двух клеток. Полученная клетка обладает потенциалом развития в ранний эмбрион, из которого можно получать часть, содержащую продуцирующую стволовые клетки внутреннюю клеточную массу.

Известен также способ получения опухолевых стволовых клеток, согласно которому ядро человеческой клетки трансплантируют в безъядерный ооцит животного, относящегося к виду, отличному от вида донорской клетки (см. US №20010012513, 2001). Полученные клетки-химеры используют для продукции плюрипотентных ЭС клеток, особенно плюрипотентных ЭС клеток, подобных человеческим. К недостаткам данного способа относится то, что данные клетки-химеры могут содержать неизвестные вирусы и сохранять митохондрии животных.

Названные способы технически сложны, кроме того, не дают возможность получить клетки, которые генетически соответствуют отдельным пациентам.

Известен также способ культивирования опухолевых стволовых клеток млекопитающего, включающий их отбор, высевание и инкубирование в культуральном сосуде (см. RU №2434636, 2005).

Недостаток этого способа - невозможность получения культуры глиобластомы человека, пригодной для лабораторной доклинической молекулярно-биологической оценки терапевтической эффективности противоопухолевого препарата, полученного целенаправленной модификацией транскриптомного профиля гемопоэтических стволовых и прогенеторных клеток, предназначенного для проведения высокотехнологичного комплексного лечения злокачественных глиальных опухолей головного мозга.

Задача, на решение которой направлено данное изобретение, состоит в обеспечении возможности получения культуры глиобластомы человека, пригодной для лабораторной доклинической молекулярно-биологической оценки терапевтической эффективности противоопухолевого препарата, полученного целенаправленной модификацией транскриптомного профиля гемопоэтических стволовых и прогенеторных клеток.

Технический результат, получаемый при решении поставленной задачи, выражается в обеспечении возможности получения культуры глиобластомы человека, пригодной для лабораторной доклинической молекулярно-биологической оценки терапевтической эффективности противоопухолевого препарата, полученного целенаправленной модификацией транскриптомного профиля гемопоэтических стволовых и прогенеторных клеток, обеспечивающего возможность регуляции пролиферативных свойств и ключевых функций опухолевых, или «раковых», стволовых клеток.

Поставленная задача решается тем, что способ культивирования опухолевых стволовых клеток глиобластомы включает отбор не менее 0,5 г материала глиобластомы, который измельчают до кусочков размером не более 5×5×5 мм, которым не дают подсыхать, выделение из отобранного материала опухолевых стволовых клеток и их осаждение, смешивание со средой для культивирования клеток млекопитающих, ресуспендирование клеток и высаживание в культуральные флаконы, культивирование до образования монослоя, ферментативную диссоциацию в течение 10 мин при 37°C посредством 0,05% трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоты, добавляемой в соотношении 1:4, центрифугирование в течение 3 мин при 1200 об/мин, добавление свежей среды, ресуспендирование, повторное культивирование с использованием клеточных суспензий, содержащих не менее чем 85-95% жизнеспособных клеток, и обработку флуоресцентным маркером, флуоресцирующим при ультрафиолетовом излучении. При этом часть материала опухоли используют для определения ее гистологического типа. Кроме того, в качестве среды для культивирования клеток млекопитающих предпочтительно используют среду DMEM содержащую 10%-ный натрий-фосфатный буфер и антибиотик-антимикотик «100Х», производства Gibco. Кроме того, в качестве флуоресцентного маркера используют флуоресцентный маркер V12883 Vybrant CFDA SE Cell Tracer производства Molecular Probes, флуоресцирующий зеленым цветом в свете ультрафиолетового лазера с длинной волны 488 нм или в свете ультрафиолетовых ламп.

Сопоставительный анализ признаков заявленного решения с признаками прототипа и аналогов свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию "новизна".

Признаки формулы изобретения обеспечивают решение комплекса функциональных задач.

Признаки, указывающие, что способ включает «отбор не менее 0,5 г материала глиобластомы, который измельчают до кусочков размером не более 5×5×5 мм, которым не дают подсыхать», обеспечивают эффективную пропитку отбираемого материала культуральной средой и сохранность культивируемого материала.

Признаки «… выделение из отобранного материала опухолевых стволовых клеток и их осаждение …» обеспечивают концентрирование целевого материала, далее подвергаемого культивированию.

Признаки, указывающие на «смешивание со средой для культивирования клеток млекопитающих, ресуспендирование клеток и высаживание в культуральные флаконы, культивирование до образования монослоя», обеспечивают подготовку материала, пригодного для ферментативной диссоциации.

Признаки «… ферментативную диссоциацию в течение 10 мин при 37°C посредством 0,05% трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоты, добавляемой в соотношении 1:4 …» определяют оптимальные параметры процедуры ферментативной диссоциации опухолевых стволовых клеток.

Признаки, указывающие на «центрифугирование в течение 3 мин при 1200 об/мин, добавление свежей среды, ресуспендирование», определяют оптимальные параметры процедуры центрифугирования, материала ферментативной диссоциации и обеспечивают получение препарата стволовых клеток и возможность его обработки флуоресцентным маркером.

Признаки, указывающие на «повторное культивирование с использованием клеточных суспензий, содержащих не менее чем 85-95% жизнеспособных клеток», повышают эффективность процесса культивирования.

Признаки, указывающие на «обработку флуоресцентным маркером, флуоресцирующим при ультрафиолетовом излучении», обеспечивают возможность автоматизации флуоресцентной оценки эффективности терапевтического воздействия препарата на опухолевые стволовые клетки.

Признаки второго пункта формулы изобретения обеспечивают возможность определения гистологического типа опухоли.

Признаки третьего пункта формулы изобретения определяют параметры среды для культивирования клеток млекопитающих, оптимальной для культивирования опухолевых стволовых клеток.

Признаки четвертого пункта формулы изобретения определяют флуоресцентный маркер оптимальной для автоматизированной реализации флуоресцентной оценки эффективности терапевтического воздействия препарата на опухолевые стволовые клетки.

В соответствии с заявленным способом из культивирования стволовых клеток млекопитающего отбирают материал глиобластомы (ткань глиальной опухоли мозга получают от пациентов и обрабатывают по стандартному культуральному протоколу), из которого выделяют опухолевые стволовые клетки и осаждают центрифугированием, далее их смешивают со средой для культивирования клеток млекопитающих (среда DMEM, предпочтительно содержащая 10%-ный натрий-фосфатный буфер (далее PBS) и антибиотик-антимикотик «100Х» или сбалансированный солевой раствор Хенкса без Са²⁺ и Mg²⁺ (HBSS), содержащий антибиотики и антимикотики (1:100; оба препарата производства Gibco), ресуспендируют и высаживают в культуральные флаконы, после чего культивируют до образования монослоя, который подвергают ферментативной диссоциации, и после его центрифугирования добавляют свежую среду и снова ресуспендируют, после чего клетки обрабатывают флуоресцентным маркером.

Для успешной работы с препаративными образцами желательно избегать попадания РНКаз с кожи рук, рабочей поверхности или с растворами. Для этого необходимо прокалить стеклянную посуду при 160°C в течение 4-6 часов; автоклавировать или прокипятить пластиковую посуду в дистиллированной воде (кипячение не инактивирует РНКазы, но смывает их).

Для наведения растворов или растворения проб следует использовать только воду, свободную от РНКаз.

Все поверхности, с которыми может соприкасаться образец, должны быть обработаны ингибиторами РНКаз (например, RNase ZAP).

Все процедуры, начиная с выделения РНК и заканчивая промывкой чипов, проводить в перчатках.

Все пластиковые материалы (пробирки, наконечники) должны иметь маркировку «RNase free». Никогда не использовать посуду или инструменты, которые были обработаны РНКазами либо ДНКазами. Этапы выделения РНК, наведения смесей для синтеза кДНК, кРНК, фрагментации и гибридизации следует проводить в боксе с классом защиты 1 (BL1).

Начиная с момента введения флуоресцентной метки весьма желательно работать в помещении, свободном от озона.

Пример 1 конкретного исполнения. Забор материала опухоли для получения опухолевых стволовых клеток (далее РСК) включает отбор образцов (не менее 0,5 г, примерно 3-4 кусочка ткани 5×5×5 мм). Его выполняют интраоперационно во время резекции опухоли или паллиативной операции. Кусочки большего размера аккуратно разрезают ножницами, т.к. образец больше чем 5×5×5 мм не пропитается культуральной средой и произойдет гибель клеток. Кусочкам ткани не дают подсыхать, поскольку это также вызовет гибель клеток.

Далее, с соблюдением максимальной стерильности кусочки помещают в одноразовую стерильную 15 мл пробирку со сбалансированным солевым раствором Хенкса (HBSS), и сразу же охлаждают до +4°C.

Обязательно выполняют патоморфологическое исследование образца этой же опухоли для определения ее гистологического типа. Лучше всего забирать кусочки для выделения РСК рядом с местом опухоли, откуда взят образец для патоморфологии. Охлажденная пробирка как можно быстрее доставляется в культуральную лабораторию (время доставки не должно превышать 2 ч). Часть полученной ткани опухоли отправляют на гистологическое и цитологическое исследование, а другую часть ресуспендируют с использованием трипсина (после повторной промывки в том же растворе из ткани опухоли удаляют кровеносные сосуды, после чего ткань измельчают и инкубируют в течение 40 мин. при 36,5°C в растворе трипсина /ЭДТА 025%, приготовленном на 0.01 М фосфатном буфере (PBS, pH 7.4)). Действие ферментов блокируют средой DMEM, содержащей 3% сыворотки, ткань промывают в трех сменах сбалансированного солевого раствора Хенкса (HBSS. Sigma) и диссоциируют повторным пипетированием в питательной среде. Состав среды: минимальная среда Игла (MEM, Sigma) 90%, эмбриональная сыворотка телят (Fetal bovine serum. FBS.Gibco.Ivitrogen), глюкоза 0.8%, глутамин 2 мМ ((Gibco), добавка В27 (Sigma), HEPES 20 мМ, ростовые факторы (только для первичных культур), фактор роста фибробластов (FGF2, 1 ng/ml Sigma), нейроростовой фактор (NGF 2 ng/ml, Sigma).

Полученную суспензию клеток центрифугируют (3 мин при 1200 об/мин), осадок ресуспендируют в питательной среде того же состава.

Количество и жизнеспособность диссоциированных клеток определяют в камере Горяева после окраски 0.1% раствором трипанового синего. Для последующего культивирования используют клеточные суспензии только с 85-95% жизнеспособных клеток.

Диссоциированные клетки (5×10⁵ кл./мл) культивируют в 12-луночных планшетах на полилизин-ламининовом субстрате в течение 14 суток (36.5°C, 5% CO₂). Частичную смену 1/3 питательной среды производят два раза в неделю. Первичную культуру после формирования сливного монослоя снимают с помощью раствора трипсина/ЭДТА. После промывки в HBSS и центрифугирования клетки ресуспезируют в питательной среде.

Клеточную суспензию (10000-12000 кл./см²) переносят в 12-луночные планшеты или флаконы (площадь 25 см²). Таким способом культуры пассируют 4 раза до формирования сливного монослоя. Формирующиеся в клеточном монослоя прикрепленные к субстрату и свободноплавающие нейросферы отбирают с помощью Пастеровских пипеток и диссоциируют описанным выше методом ферментной обработки. Выделение нейросфер позволяет отделить их от прикрепленных к субстрату обкладочных глиальных клеток, фибробластов и стромальных (опорных) клеток. Клеточную суспензию клеток нейросфер после промывки и центрифугирования ресуспендируют в питательной среде и культивируют в 12-луночных планшетах (10000-12000 кл./см²) и на покровных стеклах (18×18 мм) в чашках Петри до формирования сливного монослоя.

Часть клеток последних пассажей замораживают в среде для криоконсервирования (90% сыворотки, 10% диметилсульфоксида) и хранят в жидком азоте.

Клеточный монослой фиксируют в 4% растворе параформальдегида, приготовленном на 0.01 М фосфатном буфере (pH 7.4) в течение 30 мин.

После промывки в PBS (3×10 мин) клетки инкубируют 24 ч при 4°C с первичными антителами к β-тубулину (1:300, Chemicon), нестину (1:100, Chemicon) и нейрональной специфической енолазе (1:100, антитела получены в нашей лаборатории). После промывки в PBS клетки последовательно обрабатывают биотинилированными антителами с авидин-биотиновым комплексом (ABC, Vector Laboratories, Inc), раствором диаминобензидина, приготовленным на фосфатном буфере (DBA 0.5 мг/мл, перекись водорода 0.03%).

Пример 2 конкретного исполнения. Забор материала опухоли для получения РСК и его предварительная подготовка к культивированию соответствуют вышеописанному. В соответствии с заявленным способом из культивирования стволовых клеток млекопитающего отбирают материал глиобластомы (ткань глиальной опухоли мозга получают от пациентов и обрабатывают по стандартному культуральному протоколу), из которого выделяют опухолевые стволовые клетки и осаждают центрифугированием (3 мин при 1200 об/мин), далее их смешивают со средой для культивирования клеток млекопитающих (среда DMEM, предпочтительно содержащая 10%-ный натрий-фосфатный буфер (далее PBS) и антибиотик-антимикотик «100Х», производства Gibco), ресуспендируют и высаживают в культуральные флаконы, после чего культивируют до образования монослоя, который подвергают ферментативной диссоциации (в течение 10 мин при 37°C посредством 0,05% раствора трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоты, добавляемого в соотношении 1:4), и после его центрифугирования (3 мин при 1200 об/мин) добавляют свежую среду и снова ресуспендируют, после чего клетки обрабатывают флуоресцентным маркером (флуоресцентный маркер V12883 Vybrant CFDA SE Cell Tracer производства Molecular Probes, флуоресцирующий зеленым цветом в свете ультрафиолетового лазера с длинной волны 488 нм или в свете ультрафиолетовых ламп).