Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ САПРОФИТНЫХ БАКТЕРИЙ, СТИМУЛИРУЮЩИХ РОСТ LISTERIA MONOCYTOGENES В МОРСКИХ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВАХ

Изобретение относится к микробиологии, а именно к экологическому и санитарно-гигиеническому контролю за инфицированностью Listeria monocytogenes морской воды и морепродуктов.

Известно, что водная среда является одной из экологических ниш обитания Listeria monocytogenes. Начиная с конца 80-х годов и до настоящего времени в ряде стран Европы и Америки были отмечены многочисленные вспышки листериоза у людей, связанные с употреблением в пищу инфицированных морских продуктов [1].

С современных позиций изучение биологической активности, в том числе, и вирулентных свойств отдельно выделенных штаммов листерий из морской среды и морских животных не является достаточным для определения угрозы и возможных масштабов возникновения серьезных эколого-эпидемических ситуаций.

В настоящее время не ясны механизмы регуляции численности листерий в морских экосистемах. Рассматривая морскую воду как экологическую нишу, занимаемую листериями, как правило, основное внимание исследователей уделяется изучению динамики численности патогенных бактерий под влиянием определенных абиотических факторов, используя математическое моделирование данных параметров в морских субстратах [2].

Помимо абиотических, на биологию возбудителя оказывают влияние и биотические факторы среды, так как листерии входят в состав биоценозов с сапрофитными микроорганизмами, обитающими в морской воде. Известно, что метаболиты бактерий усиливают размножение других микроорганизмов или растений [3, 4]. И если в морских микробных сообществах встречаются в большинстве своем сапрофиты, выделяющие в среду вещества, стимулирующие размножение листерий, то последние могут длительно существовать в морской среде. Невозможно оценить эпидемиологическую ситуацию в этом случае, основываясь только на выделении возбудителя из среды.

Одним из возможных способов контроля эколого-эпидемических ситуаций может быть учет сапрофитных морских бактерий, стимулирующих рост и размножение листерий в морских микробных сообществах через выделяемые ими в среду экзометаболиты. Это позволяет более реально оценить эколого-эпидемиологическую ситуацию в отношении длительности выживания листерий в морской воде изучаемой акватории.

Наиболее близким аналогом количественной оценки межмикробных взаимодействий в микробных сообществах к заявляемому способу по совокупности существенных признаков и достигаемому результату является способ определения стимулирующей активности почвенных сапрофитных бактерий (Торотенкова В.Н., Тирранен Л.С., Сысоева О.В. Взаимодействия микроорганизмов через продуцируемые ими летучие вещества, Вестник КрасГАУ, Красноярск, 2009, вып. 12, с. 150-154), предусматривающий засев одной половины чашки Петри с агаризованной средой испытуемыми микроорганизмами, а другую половинку чашки Петри тест-культурами [5]. Воздействие испытуемой культуры оценивают как положительное (стимулирующее) или отрицательное (ингибирующее), когда размер колоний тест-культур в опыте соответственно достоверно увеличен или снижен по сравнению с контролем. Если размер колоний в опыте достоверно не отличается от контроля, действие испытуемой культуры оценивают как нулевое. Способ-прототип позволяет посмотреть в целом «картину взаимоотношений» микроорганизмов в морском микробном сообществе, дать оценку межмикробным взаимодействиям в микробных сообществах, но не позволяет определить, какие из испытуемых стимулирующих культур эффективны в отношении истинной стимуляции роста тест-бактерий.

Недостатки способа-прототипа:

- отсутствует точная количественная оценка эффекта стимуляции испытуемой культуры на тест микроорганизм;

- метод не применяют для изучения влияния метаболитов морских бактерий на рост патогенных бактерий;

- использование репликатора значительно усложняет осуществление метода, т.к. этот прибор требует специального изготовления [6].

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка эффективного способа выявления и учета активных сапрофитных бактерий, стимулирующих размножение и рост Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) в морских микробных сообществах.

Техническими результатами заявляемого изобретения являются повышение возможности выявления из большого массива данных активных сапрофитных морских бактерий, стимулирующих рост патогенных бактерий, и увеличение точности, экономичности и простоты их учета при проведении санитарных и экологических мониторинговых исследований, в том числе и в экспедиционных условиях.

Решение поставленной задачи обеспечивается предлагаемым способом количественного учета биологически активных сапрофитных морских бактерий, стимулирующих рост L. monocytogenes. Способ предполагает использование известной агаризованной среды СММ (среда для морских микроорганизмов) [7], имеющей состав (г/л): СаСО₃ - 1 г, К₂НРО₄ - 0.2 г, MgSO₄ - 1 г, дрожжевой экстракт - 5 г, пептон - 5 г, глюкоза - 1 г, морская вода - 500 мл, дистиллированная - 500 мл, агар - 15 г и включает в себя: смыв испытуемой культуры сапрофитных морских микроорганизмов с косого агара СММ; засев «газоном» полученной суспензией культуры бактерий одной половины чашки Петри с агаровой средой (среда СММ);нанесение на другую половину чашки Петри с ГРМ-агаром бумажных дисков из фильтровальной бумаги (d=0,5 см), смоченных смывом патогенных бактерий (концентрация листерий 10⁹ КОЕ/мл по стандарту мутности), используемых в качестве тест-объектов; дальнейшее состыковывание двух половинок чашки Петри с испытуемой культурой (морские штаммы) и тест-микроорганизмами (патогенные бактерии) и культивирование при температуре 18-20°C в течение 3-4 суток. Стимулирующий эффект определяют по величине зоны роста тест-культуры вокруг бумажного диска относительно контроля.

При этом тест-культуры засевали с помощью станины-репликатора.

На фиг. 1 представлен репликатор, изготовленный по индивидуальному заказу: вверху - ручка со штырьками, внизу - станина с лунками. На фиг.2 представлен рост тест-культур: слева - контроль, справа - опыт.

Основой предлагаемого способа является методика Торотенковой В.Н., Тирранен Л.С., О.В. Сысоева. [5]. На фиг. 3 показан рост тест-организмов листерий в зависимости от действия летучих метаболитов морских сапрофитов, которые продуцирует испытуемая культура, выросшая на противоположной стороне чашки, и представлен метод определения активности летучих метаболитов с помощью бумажных дисков: А) посев сапрофита газоном; Б) пример роста штаммов L. monocytogenes; В) скрепленные чашки. Оценку результата проводят путем замера величины зоны роста культуры вокруг места нанесения тест-микроорганизмов, которую соотносят со значением контроля. Контролем служит чашка Петри, где не используют испытуемую культуру (одну половину чашки Петри не засевают сапрофитами - это просто агаровая среда без культуры бактерий), а другая половина чашки Петри - со свеженанесенными методом дисков тест-культурами листерий. Если по результатам замера величина зоны роста тест-культуры, выраженная в см, достоверно выше контроля, то это положительный результат.

Отличает заявленный способ от известного способа то, что:

- используют агаризованную среду не для почвенных, а для морских микроорганизмов (среда СММ);

- для нанесения тест-культур используют бумажные диски, пропитанные суспензией Listeria monocytogenes в концентрации 10⁹ КОЕ/мл;

- критерием стимулирующей активности штаммов сапрофитных бактерий считают величину зоны роста тест-культур листерий вокруг бумажного диска, равную или большую 0,9 см за вычетом размера диска.

Экспериментальным путем было установлено, что не все испытуемые культуры сапрофитных бактерий, положительно влияющие на увеличение зон роста тест-культур, по сравнению с контролем, действительно стимулируют рост листерий. Это справедливо только в тех случаях, когда зона роста тест-культуры вокруг диска равна 0,9 см и более (с вычетом размера диска), что было доказано при построении кривых роста листерий на среде, содержащей экзометаболиты испытуемых культур (спектрофотометрический метод). Статистический анализ результатов исследований показал, что данные о стимулирующем эффекте сапрофитных бактерий на культуры листерий, полученные при изучении влияния летучих метаболитов (чашечный метод), достоверны и коррелируют с данными, полученными при изучении влияния растворенных в среде экзометаболитов (спектрофотометрический метод), только, когда зона роста тест-культуры вокруг диска равна 0,9 см и более (с вычетом размера диска).

Определение стимулирующего действия испытуемых культур проводят в 2 этапа.

1-й этап скрининговый - выявление сапрофитных бактерий, влияющих на увеличение зоны роста листерий на агаризованной среде за счет синтеза летучих метаболитов;

2-й этап - определение стимулирующего действия экзометаболитов сапрофитных бактерий путем построения кривых роста листерий спектрофотометрическим методом.

Экзометаболиты сапрофитных бактерий получают в жидкой среде. Для построения кривых роста листерий определяют динамику их численности в среде, содержащей экзометаболиты испытуемых культур, с использованием спектрофотометра Т70 UV/VIS Spectrometer PG Instruments Ltd (Англия) при длине волны 590 нм (примеры 1-4, таблица 4).

Из данных, представленных на фиг. 4-7 и в таблице 4, следует, что если зона роста культуры листерий на плотном агаре вокруг диска равна 0,9 см и более за вычетом размера диска, то ее можно считать критерием, характеризующим стимулирующую активность морских сапрофитных штаммов, и именно эти штаммы можно считать биологически активными. Поскольку определение стимулирующей активности метаболитов, безусловно точнее при использовании спектрофотометрического метода, но он очень громоздкий и использовать его для больших выборок изолятов практически невозможно, особенно в полевых условиях. Для этого вполне приемлем метод летучих метаболитов, но он, как показала наша проверка, не точный в том варианте, когда его используют по примеру методики Торотенковой В.Н., Тирранен Л.С., О.В. Сысоева. [5]. Введение критерия 0,9 см и более позволяет использовать удобный для исследования большого количества изолятов метод, но при этом точно отбирать те из них, которые объективно стимулируют рост листерий.

Таким образом, предлагаемый способ учета штаммов активных сапрофитов, стимулирующих рост патогенных бактерий, является более точным за счет введения критерия учета - размера зоны роста листерий вокруг диска, выраженного в см. Применение бумажных дисков для нанесения тест-культуры патогенных бактерий позволяет значительно упростить эту процедуру, при этом не требуется проводить сравнение с контролем, что также делает способ более простым и экономичным.

Преимуществами разработанного способа являются возможность его применения для мониторинга размножения патогенных бактерий в морской среде и прогнозирование ситуаций эпидемиологического риска, в том числе - в экспедиционных условиях или при проведении масштабных санитарно-гигиенических исследований.

Способ прост в осуществлении, не требует использования специального оборудования и химических реактивов, но при этом обеспечивает достаточно высокую точность определения штаммов - стимуляторов роста Listeria monocytogenes в морских микробных сообществах.

Сведений об известности указанного выше критерия, определяющего активность штаммов по их влиянию на величину зон роста тест-культур, выраженную в см, а не в соотношении с контролем, из уровня техники не выявлено.

Существенные отличия заявляемого способа:

- использование агаризованной среды СММ (среда для морских микроорганизмов) [7],

- использование значения ≥0,9 см (с вычетом размера бумажного диска) при определении зоны роста тест-микроорганизмов вокруг диска в качестве критерия для выявления штаммов биологически активных сапрофитов, стимулирующих размножение листерий в морских микробных сообществах;

- использование бумажных дисков из фильтровальной бумаги для нанесения тест-культуры в концентрации листерий 10⁹ КОЕ/мл по стандарту мутности;

- в качестве исследуемого материала используют морские микроорганизмы.

Возможность осуществления изобретения подтверждается следующими примерами.

Бумажные диски из фильтровальной бумаги, предлагаемые для осуществления способа, можно заготовить впрок с помощью дырокола (диски получаются одинаковые по размеру - 0,5 см), простерилизовать их при 0,5 атм в бюксах или любой другой стеклянной посуде и хранить при комнатной температуре.

Пример 1. В качестве объектов исследования были использованы штаммы сапрофитных бактерий, выделенные из поверхностных морских вод залива Петра Великого (Японское море); таблица 1.

Выделение сапрофитной микрофлоры в колонии осуществляли путем высева морской воды на среду СММ (среда для морских микроорганизмов). Посевы помещали в термостат при температуре 22°C на сутки; выросшие колонии откалывали на косой агар. Всего было выделено 26 изолятов морских бактерий, которые использовали как испытуемые культуры и засевали газоном на СММ агар одной из половин чашки Петри. На вторую половину чашки Петри с ГРМ-агаром помещали бумажные диски, пропитанные культурой листерий в концентрации 10⁹ КОЕ/мл по стандарту мутности (из коллекции музея НИИЭМ им. Г.П. Сомова СО РАМН); таблица 2.

Отобранные из полученного массива штаммы сапрофитов, которые способствовали достоверному увеличению зоны роста колоний по отношению к контролю в месте нанесения диска культуры листерий на поверхности агара, были использованы на втором этапе исследований. По данным таблицы 4 видно, что выраженной активностью, стимулирующей рост листерий (5642/6 №313, 12731/8-8097, 9156/2, 12734/13-8097), обладали сапрофитные штаммы 4-1, 9-2, 2-1, 5-3.

Из 11 штаммов Listeria monocytogenes наибольшую стимуляцию роста наблюдали в основном у четырех листерий (№8, 9, 10, 11 - таблица 3). При этом, из всех взятых в эксперимент сапрофитных бактерий положительный (стимулирующий) эффект в большей степени наблюдался у всех штаммов - от 75 до 80%.

Более точный метод, позволяющий определить биологическую активность метаболитов, - это построение кривых роста с помощью спектрофотометрического метода. С этой целью в качестве исходной среды для роста L. monocytogenes, в которой осуществляется оценка роста листерий, использовали экзометаболиты сапрофитных бактерий в жидкой среде. Для этого сапрофиты выращивали в минеральной среде Патерсона-Кука (pH 7,2-7,4) сутки. Затем отделяли от культуральной жидкости (КЖ) центрифугированием при 6000 об/мин и фильтровали с помощью бактериальных фильтров с диаметром пор 0,22 мкм. В фильтрат вносили культуру L. monocytogenes по оптической плотности, равной 0,1, и вели наблюдение в течение 11 суток при температуре 20°C. Численность листерий определяли спектрофотометрически по оптической плотности (ОП) культуральной среды при λ=590 нм на спектрофотометре Т70 UV/VIS Spectrometer PG Instruments Ltd (Англия). Продолжительность фаз роста определяли графическим методом. Биологическую активность экзометаболитов морских бактерий определяли по изменению роста штаммов Listeria monocytogenes, выраженному в процентах по отношению к контролю: ОПо590/ОПк590×100%-100%; контроль принимался за 100%; в качестве контроля использовали среду Патерсона-Кука.

На фиг. 4 показано влияние штаммов сапрофитных морских бактерий 4-1 и 9-2 на размножение штамма L. monocytogenes 12731/8 (n=3), где ОП - оптическая плотность, К3 - контроль, 05, 06 - номер опыта. Из представленных данных видно, что штамм 4-1 стимулировал рост L. monocytogenes 12731/8 на 150%, а штамм 9-2 - на 205% относительно контроля, при этом сапрофитные микроорганизмы имели одинаковые показатели влияния на размеры зон роста L. monocytogenes 12731/8 - 2,5 см соответственно.

Пример 2. Кривую роста L. monocytogenes 9156/2 строили, как указано в примере 1. При этом величина зоны роста штамма листерий при совместном культивировании со штаммом 4-1 составила 1 см, со штаммом 9-2-0,9 см. На фиг. 5 показано влияние штаммов сапрофитных морских бактерий 4-1 и 9-2 на размножение штамма L. monocytogenes 9156/2 (n=3); где ОП - оптическая плотность, К4 - контроль, 07, 08 - номер опыта. Как видно из данных, представленных на фиг. 5, штаммы сапрофитных морских бактерий 4-1 и 9-2 в одинаковой степени стимулировали рост штамма листерий 9156/2 по сравнению с контролем (прирост биомассы ко вторым суткам культивирования в обоих случаях составил 161% по сравнению с контролем).

Пример 3. Кривую роста L. monocytogenes 5642/6 №313 строили, как указано в примере 1. При этом величина зоны роста штамма листерий при совместном культивировании со штаммом 4-1 составила 0,3 см, со штаммом 9-2 - 0,5 см. На фиг. 6 показано влияние штаммов сапрофитных морских бактерий 4-1 и 9-2 на размножение штамма L. monocytogenes 5642/6 №313 (n=3), где ОП - оптическая плотность, К4 - контроль, 07, 08 - номер опыта. Из данных видно, что оба штамма сапрофитных микроорганизмов практически не стимулировали рост L. monocytogenes и активность оставалась в пределах контроля.

Пример 4. Кривую роста для L.monocytogenes 12734/13а строили, как указано в примере 1. При этом величина зоны роста штамма 12734/13а при совместном культивировании со штаммом 4-1 составила 0,8 см, со штаммом 9-2 - 0,5 см. На фиг. 7 показано влияние штаммов сапрофитных морских бактерий 4-1 и 9-2 на размножение штамма L. monocytogenes 12734/13 а (n=3), где ОП - оптическая плотность, К4 - контроль, 07, 08 - номер опыта 7. Из данных видно, что оба штамма сапрофитных микроорганизмов практически не стимулировали рост L. monocytogenes и активность оставалась в пределах контроля.

Данные экспериментальных исследований, подтверждающие возможность осуществления заявляемого способа, приведены в таблице 4.

Сравнительные данные исследований по активности летучих метаболитов, полученных предлагаемым способом и спектрофотометрическим методом, показали (таблица 4), что, в случае если величина зоны роста тест-культуры равна или больше 0,9 см за вычетом размера бумажного диска, то данные, полученные «методом дисков», совпадают с данными активности экзометаболитов, полученными спектрофотометрическим методом (выделены жирным шрифтом). В остальных случаях таких совпадений нет.

Таким образом, предлагается точный и простой в осуществлении метод для мониторинга размножения патогенных бактерий в морской среде, позволяющий прогнозировать ситуации эпидемиологического риска, в том числе - в экспедиционных условиях или при проведении масштабных санитарно-гигиенических исследований.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Мухина Л.Б., Дмитриева Е.Ю. Возбудитель листериоза - показатель биологической опасности рыбной продукции // Технология. 2002. С. 50-51.

2. Schaffher D.W. Mathematical frameworks for modeling Listeria cross-contamination in food-processing plants. J. Food Science. 2004. Vol. 69 (6). P. 155-159.Schaffher, 2004.

3. Сидоренко М.Л. Влияние летучих метаболитов бактерий рода Pseudomonas на размножение патогенных бактерий.//Тихоокеанский медицинский журнал. 2001. №7. С. 131.

4. Тамбиев А.Х., Телитченко М.М. Роль летучих и водорастворимых биологически активных соединений биогенного происхождения. - М.: Изд-во МГУ, 1971. - С. 14-27.

5. Торотенкова В.Н., Тирранен Л.С., О.В. Сысоева. Взаимодействия микроорганизмов через продуцируемые ими летучие вещества. Вестник КрасГАУ, Красноярск, 2009, вып. 12, с. 150-154.

6. 1565882 А1, МКЛ С12М 1/22. Устройство для выращивания микроорганизмов на агаризованных средах - В.И. Безруких Л.С.Тиранен, Г.Д. Кропачев, М.М. Сатаров Изобретения. Официальный патентный бюллетень.1990. - №19.

7. Youchimizu М., Kimura Т. Study of intestinal microflora of Salmonids // Fish Pathol. 1976. V. 10. №2. P. 243-259.