Результат интеллектуальной деятельности: АНТИБИОТИК ИНА 5812, ШТАММ-ПРОДУЦЕНТ Streptomyces roseoflavus ИНА-Ас-5812 И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА

Изобретение относится к биологически активным соединениям, проявляющим антибактериальную активность, а именно антибиотику ИНА 5812, который может быть применен в качестве лекарственного препарата в медицинской практике.

Предлагаемое соединение, штамм-продуцент и способ получения антибиотика в патентной и научно-технической литературе не описан.

Предлагаемее природное соединение, антибиотик ИНА 5812, относится к группе гликопептидных соединений, характеризующихся пептидной структурой из аминокислотных цепей и присутствием сахарного остатка.

Антибиотики этой группы обладают активностью в отношении грамположительных бактерий и микобактерий, в том числе и Mycobacterium tuberculosis. Преимуществом гликопептидных антибиотиков перед рядом антибиотиков других групп является бактерицидный тип действия и высокая активность в отношении микроорганизмов, устойчивых ко многим препаратам, включая β-лактамные антибиотики и фторхинолоны. Поиск новых лекарственных средств гликопептидного строения, менее токсичных и более активных, перспективен среди продуктов биосинтеза культур актиномицетов. Из числа таких природных гликопептидных соединений в настоящее время в медицинской практике применяются противобактериальные антибиотики ванкомицин, тейкопланин и рамапланин, эффективные при тяжелых гнойно-септических заболеваниях, вызываемых грамположительными микроорганизмами, особенно стафилококками, в том числе метициллинрезистентными штаммами (MRSA), энтерококками, пневмококками, стафилококковом сепсисе, а также мембранном колите в связи с их высокой активностью в отношении анаэробного возбудителя Clostridium difficile.

Целью изобретения является создание природного гликопептидного антибиотика, обладающего противобактериальной активностью и расширяющего арсенал средств воздействия на грамположительные бактерии.

Цель достигается выделением почвенного штамма Streptomyces roseoflavus ИНА-Ас-5812-продуцента нового гликопептидного антибиотика ИНА 5812, обладающего высокой антибактериальной активностью. Антибиотик ИНА 5812, образующийся при культивировании нового штамма ИНА-Ас-5812, имеет мол. массу (метод MALDI-TOF-MS) 1917,8 Да.

Антибиотик дает положительные реакции на свободные аминогруппы (с нингидрином), на углеводы (реакции Молиша и Фелинга), на фенольные гидроксилы (с FeCl₃ и реакция Паули). Обладает сильной голубой флуоресценцией в УФ-свете и характерным УФ-спектром с λ_max (метанол) при 237, 262 и 360 нм. В ИК-спектре имеются сильные полосы поглощения в области: ν_max, см^-1: 3301; 3062; 2927; 1645; 1538; 1382; 1231; 1072; 1003; 702.

Характерным отличительным признаком антибиотика ИНА 5812 как гликопептидного соединения является аминокислотный состав. В кислотном гидролизате антибиотика обнаружены следующие аминокислоты: β-аланин, глицин, орнитин, тирозин, α,β-диаминомасляная кислота, аланин, пролин, лейцин, аспарагиновая кислота, серии и три небелковые аминокислоты. Антибиотик содержит нейтральный сахар арабинозу.

Сущность изобретения состоит в том, что получен новый штамм-продуцент Streptomyces roseoflavus в результате систематического скрининга почвенных культур стрептомицетов, образующих противобактериальные гликопептидные антибиотики.

Полученный новый штамм депонирован в коллекции культур ФГБУ НИИНА им. Г.Ф. Гаузе РАМН под номером ИНА-Ас-5812.

Штамм ИНА-Ас-5812 накапливает антибиотик в культуральной жидкости (2-5 мкг/мл) и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.

Культурально-морфологические и физиологические признаки штамма ИНА-Ас-5812

Температура (28-37)°C; длительность выращивания (7-21) сутки. Споровый посевной материал десятидневной культуры штамма, выращенной на глицериннитратной агаровой среде Линденбайна. Цвет определен по таблице Бондарцева и Праузера (Таблица 1).

Морфологические признаки. Цепочки спор прямые, извитые, поверхность спор гладкая.

Физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Растет при (24-37)°C, оптимум роста 28°C и в диапазонах значений pH (5,0-10,0) с оптимумом роста при pH 7,0; желатину разжижает. Молоко пептонизирует. Сахарозу инвертирует. Крахмал гидролизует. На клетчатке не растет. Восстанавливает нитраты до нитритов. Меланоидные пигменты не образует при росте на среде Треснера с пептоном и лимоннокислым железом. Отношение к углеводам: хорошо использует фруктозу, мальтозу, рамнозу; умеренно глюкозу, арабинозу, лактозу; слабо использует сахарозу, сорбит, маннит; не использует рафинозу и целлюлозу при росте на средах с неорганическим источником азота.

Хранение. Штамм хранится в виде спор на стерильной почве с кварцевым песком или на зернах пшена, а также в виде зрелой культуры на агаровых средах под вазелиновым маслом.

Антагонистические свойства. При испытании методом штриха на глюкозо-нитратном агаре №2 Гаузе штамм подавляет рост грамположительных бактерий и дрожжеподобных грибов. Штамм фагоустойчив. Фаг в культуре отсутствует.

Изобретение поясняется следующим примером.

Пример. Для получения спорового материала культуру Streptomyces roseoflavus штамм ИНА-Ас-5812 выращивают в течение (7-10) суток при 37°C на агаровой среде №2 Гаузе следующего состава, %:

Среду стерилизуют в течение 30 мин при давлении в 1,0 атм и температуре 120°C.

Для получения посевного мицелия споры культуры засевают на питательную среду следующего состава, %:

Посевной материал выращивают при 28°C в течение 48 час в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл, количество среды в колбах 150 мл. Скорость вращения качалки (200-240) об/мин. Количество посевного материала для инокуляции - (5-7)%.

Ферментация проводится на качалке при 28°C на среде (100 мл в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл) следующего состава, %:

Антибиотик накапливается в культуральной жидкости продуцента.

Антибиотическую активность культуральной жидкости после 120 ч ферментации определяют методом диффузии в агар с использованием тест-микроорганизма Bacillus subtilis 6633 АТСС.

Для выделения антибиотика нативный раствор (отфильтрованная от мицелия культуральная жидкость) объемом 5 л, рН которого (6,8-7,3), пропускают через колонку с 500 мл смолы Амберлит XAD-2 (Serva, Германия) при скорости 120 мл/см²·ч. По окончании сорбции колонку промывают дистиллированной водой (1 л). Антибиотик ИНА 5812 элюируют со смолы смесью ацетон-н.-бутанол-вода (1:1:1) при pH 3,0. Органические растворители элюата упаривают в вакууме и из водного остатка антибиотик экстрагируют н.-бутанолом, сорбируют для дальнейшей очистки на колонке с DEAE-Сефадексом (в OH^--форме). Активные фракции объединяют, удаляют растворитель в вакууме, и антибиотик осаждают из 50% водно-спиртового раствора ацетоном. Полученные сырцы антибиотика хроматографируют на колонке с обращенной фазой С-18 с использованием градиента ацетонитрила в воде и получают чистый антибиотик в виде белого порошка, хорошо растворимого в воде, метаноле, ограниченно - в этаноле и нерастворим в других органических растворителях. Из 5 л нативного раствора получают 10 мг вещества. Активность препарата в отношении Bacillus subtilis 6633 АТСС составляет 3000 ед. разведения/мг.

Таким образом, получен новый штамм Streptomyces roseoflavus ИНА-Ас-5812 - продуцент нового гликопептидного антибиотика ИНА 5812 и предложен способ биосинтеза, выделения и химической очистки, позволяющий получить биологически активное соединение - антибактериальный антибиотик ИНА 5812.

Новый препарат - антибиотик ИНА 5812 - имеет высокие показатели антибактериальной и химиотерапевтической активности и низкое значение острой токсичности

Значения МПК (минимальная подавляющая концентрация), определенные in vitro в отношении двух стандартных штаммов стафилококка, представлены в Таблице 2.

Показатели химиотерапевтической активности in vivo, полученные на модели стафилококкового сепсиса белых мышей, представлены в Таблице 3.

Результаты показывают высокую эффективность антибиотика ИНА 5812 как лекарственного препарата: доза 2,5 мкг/кг обеспечивает 100%-е излечивание стафилококкового сепсиса.

Острая токсичность антибиотика определена на белых мышах и результаты даны в Таблице 4. Максимально переносимая доза антибиотика ИНА 5812 в десять раз превосходит дозу 100%-го излечения опытных мышей от стафилококкового сепсиса.