Результат интеллектуальной деятельности: СРЕДНЕ-РЕГИОНАЛЬНЫЙ ПРЕДШЕСТВЕННИК ПРЕДСЕРДНОГО НАТРИЙУРЕТИЧЕСКОГО ПЕПТИДА (pro-ANP) ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПАЦИЕНТОВ С ФИБРИЛЛЯЦИЕЙ ПРЕДСЕРДИЙ, НАЧАВШЕЙСЯ МЕНЬШЕ ЧЕМ 48 ЧАСОВ ТОМУ НАЗАД

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

[0001] Настоящее изобретение относится к области клинической диагностики. В частности, настоящее изобретение относится к определению уровня предшественника среднерегионального предсердного натрийуретического пептида (MR-proANP) в образце, полученном из биологической жидкости пациента с фибрилляцией предсердий.

Уровень техники

[0002] Фибрилляция предсердий (AF) является наиболее часто встречающейся формой сердечной аритмии, которая требует лечения, и вовлекает в патологический процесс две верхние камеры (предсердия) сердца. Приблизительно 2,2 миллиона индивидов в США и 4,5 миллиона в Европейском Союзе страдают AF (Camm et al. 2010. Eur Heart J. 31:2369-2429; Co et al. 2001. JAMA 285:2370-2375). AF также является причиной 1/3 случаев госпитализации по поводу нарушений сердечного ритма (Fuster et al. 2006. Circulation 114:e257-354), и частота госпитализации по поводу AF в последние годы возросла (Friberg et al. 2004. Epidemiology 14: 666-672). Распространенность AF с возрастом повышается с 0,5% в возрасте 40-50 лет до 5-15% в возрасте 80 лет (Camm et al. 2010. Eur Heart J. 31: 2369-2429). Частота AF также возрастает с возрастом. В развитых странах в течение следующих 50 лет вероятно увеличение количества пациентов с AF вследствие увеличения доли пожилых лиц (Co et al. 2001. JAMA 285: 2370-2375).

[0003] Название AF происходит от фибрилляции (т.е. хаотичного сокращения) сердечных мышечных волокон предсердий вместо координированного их сокращения. AF зачастую может быть идентифицирована исследованием пульса и выявлением того, что сердечные сокращения происходят не через равномерные интервалы. Однако более веским показателем AF является отсутствие зубцов Р на электрокардиограмме (ЭКГ), которые в норме присутствуют при скоординированном сокращении предсердий в начале каждого сердечного сокращения.

[0004] AF связана с измененной толерантностью и повышенным риском смерти, независимо от других факторов риска сердечной патологии (Benjamin et al. 1998. Circulation 98: 946-952). Наиболее частым и губительным последствием AF является инсульт. Случаи инсульта, вызванные AF, ответственны за 6-24% всех эпизодов ишемического инсульта (Narumiya et al. 2003. Circulation journal 67 (1): 68-72). Электрическая и фармакологическая кардиоверсия при AF может осложняться инсультом после восстановления механической активности предсердий (Camm et al. 2010. Eur Heart J. 31: 2369-2429; Halperin et al. 1988. Stroke 19:937-941).

[0005] Американский Колледж Кардиологии (ACC), Американская Сердечная Ассоциация (AHA) и Европейское Кардиологическое Общество (ESC) в своих руководствах рекомендуют следующую систему классификации, основанную на простоте и клинической релевантности (Fuster et al. 2006. Circulation 114:e257-354). Всех пациентов с AF сначала относят к категории, называемой впервые выявленная AF. У этих пациентов могут быть или не быть ранее не выявленные приступы AF. Если первый выявленный приступ самопроизвольно прекращается менее чем за 7 дней и затем позднее начинается другой приступ, то этот случай переходит в категорию пароксизмальной AF. Хотя у пациентов в этой категории наблюдаются приступы, длящиеся до 7 дней, в большинстве случаев пароксизмальной AF эти приступы самопроизвольно прекращаются менее чем через 24 часа. Однако если приступ продолжается более 7 дней, то навряд ли он прекратится самопроизвольно (Levy 2000. Curr Opin Cardiol 15: 54-57), и в этом случае его называют стойкой (персистирующей) AF. В этом случае приступ может быть прекращен кардиоверсией. Если кардиоверсия безуспешна или ей попытка не предпринимается и приступ продолжается в течение продолжительного времени (например, год или более), то AF у пациента называют постоянной.

[0006] Кроме описанных выше четырех категорий AF, которые в основном определяются по продолжительности и прекращению приступа, в инструкциях ACC/AHA/ESC описаны дополнительные категории AF с точки зрения других характеристик пациента (Fuster et al. 2006. Circulation 114:e257-354): одиночная AF (LAF) - отсутствие клинических и эхокардиографических признаков другого сердечно-сосудистого заболевания (в том числе гипертонии), связанного с ним легочного заболевания, или сердечной патологии, такой как увеличение левого предсердия, и возраст до 60 лет; Неклапанная AF - отсутствие ревматического поражения митрального клапана, протез сердечного клапана, или пластика митрального клапана; Вторичная AF - происходит на фоне первичного состояния, которое может вызывать AF, такого как острый инфаркт миокарда, хирургическое вмешательство на сердце, перикардит, миокардит, гипертиреоз, эмболия легочной артерии, пневмония или другое острое легочное заболевание.

[0007] Фибрилляция предсердий обычно сопровождается симптомами, связанными с быстрой частотой сердечных сокращений. Быстрые и нерегулярные частоты сердечных сокращений могут восприниматься как учащенные сердцебиения, непереносимость физических нагрузок и иногда вызывают стенокардию (если частота сердечных сокращений повышается и создает нагрузку для сердца) и симптомы застоя в виде одышки или отеков. Иногда аритмия идентифицируется только при развитии инсульта или транзиторной ишемической атаки (TIA). Нередко пациент впервые узнает о наличии у него AF при обычном физикальном обследовании или регистрации ЭКГ, так как во многих случаях AF может быть бессимптомной (Fuster et al. 2006. Circulation 114:e257-354).

[0008] Поскольку большинство случаев AF являются вторичными относительно других медицинских проблем, то наличие боли в грудной клетке или стенокардии, симптомов гипертиреоза (повышенной активности щитовидной железы), таких как потеря массы тела и диарея, и симптомов, свидетельствующих о наличии легочного заболевания, может указывать на причину, лежащую в основе AF. Наличие в анамнезе инсульта или TIA, а также гипертонии (высокого артериального давления), сахарного диабета, сердечной недостаточности и ревматизма может указывать на то, имеется ли у пациента с AF высокий риск осложнений (Fuster et al. 2006. Circulation 114:e257-354).

[0009] AF можно лечить лекарственными препаратами, которые либо замедляют скорость сердечных сокращений, либо восстанавливают нормальный сердечный ритм. Кардиоверсия представляет собой неинвазивную конверсию нерегулярного ритма сердечных сокращений в нормальный ритм сердечных сокращений с использованием электрических или химических средств (Fuster et al. 2006. Circulation 114:e257-354). У определенных индивидов для предотвращения рецидива AF могут также использоваться способы лечения, основанные на хирургическом вмешательстве и катетерных манипуляциях. Людям, страдающим AF, часто назначают антикоагулянты, такие как аспирин, гепарин, варфарин или дабигатран для их защиты от инсульта.

[0010] Продолжительность AF становится важным фактором, когда рассматривается вопрос о применении кардиоверсии, и в целом общепринято считать, что пациентов, имеющих приступ AF длительностью менее 48 часов, можно безопасно подвергать неотложной кардиоверсии, тогда как пациентов с AF длительностью >48 часов следует лечить антикоагулянтами в течение более чем 3 недель или проводить трансэзофагеальную эхокардиографию (TEE) перед кардиоверсией (Camm et al. 2010. Eur Heart J. 31: 2369-2429; Fuster et al. 2006. Circulation 114:e257-354; Page et al. 2004. NEJM 351:2408-2416; Klein et al. 2001. NEIM 344:1411-1420; Jessup et al. 2009. Circulation 119:1977-2016). Продолжительность AF можно определить у пациентов, которые сообщают об острых приступах сердцебиения, одышки или обмороках. Однако часто встречаются случаи бессимптомной или «молчаливой» AF (Savelieva et al. 2000. Pacing clin Electrophysiol 23: 145-148): в Канадском реестре AF у 21% пациентов с первично диагностированной AF заболевание протекало бессимптомно (Kerr et al. 1996. Eur Heart J 17 Suppl C:48-51). В другом исследовании у 17% пациентов были бессимптомные эпизоды AF перед тем, как они отметили симптомы, связанные с AF (Page et al. 2003. Circulation 107: 1141-5). В целом, клиническое определение продолжительности AF, составляющее больше или меньше 48 часов, часто может быть на практике связано с риском, что указывает на потребность в новых инструментах для помощи практикующим врачам в точном определении продолжительности AF перед поступлением пациентов в клинику.

[0011] Предыдущие исследования свидетельствовали о возможном преимуществе некоторых биомаркеров, в основном натрийуретических пептидов В-типа, при распределении пациентов, страдающих AF, по категориям риска или прогнозу возникновения AF (Defteros et al. 2010. Heart 96: 1033-1036; Jourdain et al. 2002. Eur J Heart Fail 4:263-267; Maisel et al. 2002. NEJM 347: 161-167; Thejus et al. 2009. Indian Pacing Electrophysiol J 9: 1-4). Deftereos et al. сообщали, что пациенты с AF продолжительностью менее 24 часов и без сердечной недостаточности имеют определенный тип колебаний уровня NT-proBNP, который характеризуется его прогрессирующим увеличением в пределах первых 24 часов с последующим быстрым снижением (Defteros et al. 2010. Heart 96: 1033-1036). Они сделали вывод, что получение двух-трех значений уровня NT-proBNP в плазме в пределах 24 часов проявления AF у пациентов с AF без сердечной недостаточности, которые не могут с удовлетворительной точностью указать время начала эпизода AF, может содействовать определению того, произошло ли возникновение AF недавно, и что такую информацию можно было бы использовать для принятия решений относительно назначения антикоагулянтов и применения кардиоверсии. Однако классификация пациентов на основе таких колебаний уровня NT-proBNP может быть в клинической практике связана с риском и требовать продолжительного мониторинга пациентов перед принятием решения. В отличие от этого Tsuchida и Tanabe продемонстрировали, что уровень BNP сразу повышался в пределах 4 часов после начала AF и что не было значимой корреляцией между уровнем BNP и временем, прошедшим от начала AF (Tsuchida and Tanabe 2004, J Cardiol 44: 1-11).

Краткое описание сущности изобретения

[0012] Предметом настоящего изобретения является способ определения времени, прошедшего от начала AF до поступления в клинику пациента, включающий стадии:

i) получения образца биологической жидкости указанного пациента,

ii) определения уровня proANP или его фрагментов в указанном образце,

iii) определения корреляции между уровнем proANP или его фрагментов и временем, прошедшим от начала AF до поступления пациента в клинику,

причем указанные фрагменты имеют длину по меньшей мере 6 аминокислотных остатков.

Предпочтительные варианты способа описаны в зависимых пунктах формулы изобретения.

Подробное описание изобретения

[0013] AF определяется как патологический нерегулярный сердечный ритм с нерегулярным генерированием электрических сигналов в предсердиях сердца, что может быть идентифицировано определением пульса и наблюдением того, что сердечные сокращения не происходят через равномерные интервалы, и/или регистрацией электрокардиограммы (ЭКГ), где отсутствие зубцов P, которые в норме присутствуют при наличии скоординированного сокращения предсердий в начале каждого сердечного сокращения, является показателем AF.

[0014] Кардиоверсия является медицинской процедурой, при помощи которой патологически быстрая частота сердечных сокращений или сердечная аритмия превращается в нормальный ритм с использованием электричества или лекарственных средств. (Shea et al. 2002. Ciculation 106:e176-778). При синхронизированной электрической кардиоверсии используют подачу на сердце терапевтической дозы электрического тока в определенный момент в сердечном цикле. При фармакологической кардиоверсии, также называемой химической кардиоверсией, вместо электрического разряда используют антиаритмические медикаментозные средства.

[0015] Для выполнения синхронизированной электрической кардиоверсии используют две электродные накладки (или, альтернативно, традиционные удерживаемые руками «лопатки»), каждая из которых содержит металлическую пластину, покрытую электропроводным гелем на основе солевого раствора. Эти накладки помещают на грудную клетку пациента или одну помещают на грудную клетку, а другую на спину. Они соединены кабелями с аппаратом, который выполняет комбинированные функции экрана дисплея ЭКГ и электрическую функцию дефибриллятора. Синхронизирующая функция (управляемая вручную или автоматически) обеспечивает возможность подачи дефибриллятором с помощью накладок реверсионного разряда с выбранным количеством электрического тока в течение заданного числа миллисекунд в оптимальный момент в сердечном цикле, который соответствует зубцу R комплекса QRS на ЭКГ. Время подачи разряда на зубец R предотвращает подачу разряда в течение уязвимого периода (или относительного рефрактерного периода) сердечного цикла, что могло бы вызвать фибрилляцию желудочков. Если пациент находится в сознании, то часто используют различные седативные лекарственные средства для содействия лучшей переносимости процедуры пациентом. Однако если у пациента имеется нестабильность гемодинамики или он находится в бессознательном состоянии, то разряд подают немедленно после подтверждения наличия аритмии. При выполнении синхронизированной электрической кардиоверсии в качестве плановой процедуры подачу разрядов можно выполнять в сочетании с лекарственной терапией до тех пор, пока не будет достигнуто восстановление синусового ритма. После этой процедуры пациента наблюдают для обеспечения стабильности синусового ритма. Синхронизированную электрическую кардиоверсию используют для лечения гемодинамически значимых суправентрикулярных (или узкокомплексных) форм тахикардии, включая фибрилляцию предсердий и трепетание предсердий. Ее также используют при неотложном лечении ширококомплексных тахикардий, включая желудочковую тахикардию, когда пульс присутствует. Желудочковую тахикардия с отсутствием пульса и фибрилляцию желудочков лечат несинхронизированными разрядами, именуемыми дефибрилляцией. Электрическая терапия нецелесообразна по поводу синусовой тахикардии, которая должна всегда быть частью дифференциальной диагностики.

[0016] Различные антиаритмические средства могут применяться для возврата сердца к нормальному синусовому ритму. Фармакологическая кардиоверсия является оптимальным вариантом у пациентов с недавно начавшейся аритмией. Лекарственные средства, которые эффективны при поддержании нормального ритма после электрической кардиоверсии, можно также применять для фармакологической кардиоверсии. Лекарственные средства, подобные амиодарону, дилтиазему, верапамилу и метопрололу, часто назначают перед кардиоверсией для уменьшения частоты сердечных сокращений, стабилизации состояния пациента и повышения вероятности успешной кардиоверсии. Имеются два класса средств, которые наиболее эффективны для фармакологической кардиоверсии. Средства 1 класса являются блокаторами натриевых (Na) каналов (которые замедляют проведение импульсов блокированием Na⁺-каналов) и делятся на 3 подкласса, a, b и c: 1a класс замедляет фазу 0 деполяризации в желудочках и увеличивает абсолютный рефрактерный период. Прокаинамид, хинидин и дизопирамид являются средствами 1а класса. Лекарственные средства 1b класса укорачивают 3-ю фазу реполяризации. Они включают лидокаин, мексилетин и фенитоин, и, наконец, лекарственные средства 1c класса в значительной степени замедляют фазу 0 деполяризации в желудочках (однако в отличие от средств 1a класса они не действуют на рефрактерный период). Флекаинид, морицизин и пропафенон являются средствами 1c класса. Средства II класса представляют собой бета-блокаторы, которые ингибируют деполяризацию сино-атриального и атрио-вентрикулярного узлов и уменьшают частоту сердечных сокращений. Они также уменьшают потребность сердца в кислороде и могут предотвратить ремоделирование сердца. Не все бета-блокаторы одинаковы, некоторые из них являются кардио-селективными (влияющими только на рецепторы бета-1), другие являются неселективными (влияющими на рецепторы бета-1 и бета-2). Бета-блокаторы, которые нацелены на рецептор бета-1, называются кардио-селективными, так как рецептор бета-1 является ответственным за увеличение частоты сердечных сокращений; таким образом, бета-блокатор замедляет частоту сердечных сокращений. Средства III класса удлиняют реполяризацию блокированием выходящего тока К^т. Амиодарон и соталол являются эффективными средствами III класса. Ибутилид представляет собой другое средство III класса, но имеет другой механизм действия (действует, способствуя входящему току натрия через медленные натриевые каналы). Было показано, что он эффективен при неотложной кардиоверсии в случаях AF недавнего начала и трепетания предсердий. Лекарственными средствами IV класса являются блокаторы кальциевых (Ca) каналов. Они оказывают эффект ингибированием потенциала действия сино-атриального и атрио-вентрикулярного узлов.

[0017] Стратегия управляемой трансэзофагеальной эхокардиографией (TEE) кардиоверсии рекомендуется в качестве альтернативы 3-недельной терапии антикоагулянтами перед кардиоверсией, если имеется опытный персонал и соответствующее оборудование, и в случаях, когда требуется ранняя кардиоверсия, пероральный прием антикоагулянтов перед кардиоверсией не показан вследствие выбора пациента или потенциальных рисков кровотечения, или, когда имеется высокий риск тромбоза левого предсердия/ушка левого предсердия (Klein et al. 2001, NEJM 344: 1411-1420). TEE является альтернативным путем выполнения эхокардиографии. Специализированный зонд, содержащий ультразвуковой преобразователь на его кончике, проводят в пищевод пациента. Это обеспечивает возможность получения изображения и допплеровской оценки, которые могут быть зарегистрированы.

[0018] Возросший риск тромбоэмболии после кардиоверсии общепризнан. Поэтому, антикоагулянтная терапия считается обязательной перед плановой кардиоверсией по поводу AF длительностью >48 ч или AF неизвестной продолжительности. Тромбопрофилактика рекомендуется для электрической и фармакологической кардиоверсии при AF длительностью >48 ч. У пациентов с определенным началом AF в пределах <48 ч целесообразно выполнение кардиоверсии под прикрытием внутривенно вводимого нефракционированного гепарина с последующей инфузией или подкожным введением гепарина с низкой молекулярной массой. У пациентов с факторами риска инсульта (например, сердечной недостаточностью, гипертензией, пожилым возрастом, диабетом, инсультом в анамнезе или TIA), пероральную антикоагулянтную терапию следует начинать после кардиоверсии и продолжать в течение всей жизни. Пациентам без тромбоэмболических факторов риска не требуется назначение пероральных антикоагулянтов.

[0019] Антикоагулянт является веществом, которое предотвращает коагуляцию; то есть, он останавливает свертывание крови. Группа фармацевтических средств, называемых антикоагулянтами, может применяться in vivo в качестве лекарственной терапии по поводу тромботических расстройств. Пероральные антикоагулянты включают кумарины (антагонисты витамина К), например, варфарин, аценокумарол и фенопрокумон или фениндион. Антикоагулянт гепарин может применяться путем инъекции. Гепарин и его низкомолекулярные производные (например, эноксапарин, дальтепарин, тинзапарин) являются эффективными в предотвращении тромбозов глубоких вен и эмболии легочной артерии у пациентов с риском их развития, предотвращая образование сгустков и распространение существующих сгустков в крови. Другим типом антикоагулянтов является прямой ингибитор тромбина. Современные члены этого класса включают аргатробан, лепирудин, бивалирудин и дабигатран.

[0020] В одном варианте осуществления изобретения определено, что время от начала AF до поступления пациента в клинику составляет период больше или меньше определенного интервала времени. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения определено, что время от начала AF до поступления пациента в клинику равно 48 часам или составляет больше или меньше 48 часов. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения определено, что время от начала AF до поступления пациента в клинику равно 24 часам или составляет больше или меньше 24 часов.

[0021] В предпочтительном варианте осуществления изобретения, когда определено, что время от начала AF до поступления пациента в клинику составляет меньше указанного временного предела, это принимается в качестве показателя того, что у пациента следует неотложно применить кардиоверсию.

[0022] В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, когда определено, что время от начала AF до поступления в клинику указанного пациента составляет больше указанного временного предела, это расценивается в качестве показателя того, что пациента перед кардиоверсией следует лечить антикоагулянтами и/или подвергнуть трансэзофагеальной эхокардиографии (TEE).

[0023] Еще в одном предпочтительном варианте осуществления изобретения кардиоверсия предпочтительно представляет собой электрическую и/или фармакологическую кардиоверсию.

[0024] Предсердный натрийуретический пептид (ANP), член семейства натрийуретических пептидов, регулирует несколько физиологических параметров, включая диурез и натрийурез, и нижнее артериальное давление (диастолическое АД). Он образуется преимущественно в предсердии сердца и составляет 98% натрийуретических пептидов в циркуляции (Vesely DL Life 2002;53: 153-159). ANP образуется в результате расщепления его про-гормона-предшественника, который является значительно более устойчивым в циркуляции, чем зрелый пептид. Среднерегиональный фрагмент гормона-предшественника (аминокислоты 53-90 NT-proANP), называемый среднерегиональным-proANP (MR-proANP), может быть относительно устойчивым к разрушению экзопротеазами, в отличие от эпитопов в N- или C-концах proANP, используемых в предшествующих иммуноанализах (Morgenthaler NG et al. Clin Chem 2004;50: 234-236; Gerszten RE et al. 2008. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol).

[0025] В предпочтительном варианте осуществления изобретения уровень proANP или его фрагментов определяют с использованием по меньшей мере одного антитела, направленного против аминокислотной последовательности, соответствующей proANP-фрагменту MR-proANP (SEQ ID NO: 4).

[0026] В конкретном варианте осуществления изобретения дополнительно определяют по меньшей мере один клинический параметр, который может влиять на уровень proANP или его фрагментов у указанного пациента. Этот клинический параметр предпочтительно выбран из группы, состоящей из возраста, пола, сопутствующих заболеваний и индекса массы тела (BMI), наиболее предпочтительно из возраста и BMI. Например, известно, что уровень proANP увеличивается с увеличением возраста. Этот более высокий уровень должен учитываться при установлении предельных величин для более пожилых пациентов. В связи с этими клиническими параметрами, можно сослаться на публикации Morgenthaler et al., Clin Chem. 2004, 234; Cegenhuber et al., Clin Chem. 2006, 827; Cegenhuber et al., J Card Fail. 2007, 42; von Haehling et al., J Am Coll Cardiol. 2007, 1973; Khaleghi et al., Am J Cardiol. 2009, 1257; Krueger et al., Intensive Care Med. 2007, 2069; и Mueller et al., J Intern Med. 2006, 568, которые все включены в настоящее описание путем ссылки.

[0027] Также возможно и способно улучшать достоверность результатов определения одного или нескольких биомаркеров, в дополнение к proANP или его фрагментам, в частности биомаркеров, связанных с AF или сердечно-сосудистыми заболеваниями в целом. Предпочтительными примерами таких дополнительных биомаркеров являются proBNP и его фрагменты, в частности NT-proBNP и/или BNP. В этом отношении можно сослаться на документы WO 2008/077396 A1 и WO 2008/106938 A2, которые включены в настоящее описание путем ссылки.

[0028] Как указано в настоящем описании, термин "фрагмент" относится к меньшим белкам или пептидам, получаемым из бόльших белков или пептидов, которые, следовательно, содержат частичную последовательность большего белка или пептида. Указанные фрагменты могут быть получены из бόльших белков или пептидов сапонификацией одной или нескольких их пептидных связей. Указанные фрагменты представляют собой любые фрагменты, происходящими из прогормона ANP (proANP; SEQ ID NO: 1). Эти фрагменты proANP предпочтительно относятся к фрагментам с длиной по меньшей мере 6 аминокислот, наиболее предпочтительно, с длиной по меньшей мере 12 аминокислотных остатков. Известные фрагменты proANP включают ANP (SEQ ID NO: 2), NT-proANP (SEQ ID NO: 3) и MR-proANP (SEQ ID NO: 4). Такие фрагменты предпочтительно могут выявляться с использованием иммунологических анализов, описанных здесь.

[0029] Как указано в настоящем описании, "анализ” или "диагностический анализ" может представлять собой анализ любого типа, применяемый в области диагностики. Такой анализ может основываться на связывании с определенным аффинитетом подлежащего выявлению анализируемого вещества с одним или несколькими захватывающими зондами. Что касается взаимодействия между захватывающими молекулами и представляющими интерес молекулами-мишенями, то константа аффинитета составляет предпочтительно больше чем 10⁸ M^-1.

[0030] В контексте данного изобретения "захватывающими молекулами" являются молекулы, которые могут быть использованы для связывания молекул-мишеней или представляющих интерес молекул, т.е. анализируемых веществ (т.е. в контексте данного изобретения сердечно-сосудистых пептидов) из образца. Таким образом, захватывающие молекулы должны быть адекватно спрофилированы, как пространственно, так и в отношении признаков поверхности, таких как заряд поверхности, гидрофобность, гидрофильность, присутствие или отсутствие доноров и/или акцепторов Льюиса, для специфического связывания молекул-мишеней или представляющих интерес молекул. Таким образом, связывание может быть, например, опосредовано ионными, ван-дер-Ваальсовыми, пи-пи, сигма-пи, гидрофобными или обусловленными водородными связями взаимодействиями или комбинацией двух или более из вышеупомянутых взаимодействий между захватывающими молекулами и молекулами-мишенями или представляющими интерес молекулами. В контексте настоящего изобретения захватывающие молекулы, например, могут быть выбраны из группы, состоящей из молекулы нуклеиновой кислоты, молекулы углеводорода, молекулы PNA (пептидной нуклеиновой кислоты), белка, антитела, пептида или гликопротеина. Предпочтительно, этими захватывающими молекулами являются антитела, включая их фрагменты, с достаточным аффинитетом к молекуле-мишени или представляющей интерес молекуле, и включая рекомбинантные антитела или фрагменты рекомбинантных антител, а также химически и/или биохимически модифицированные производные указанных антител или фрагментов, полученных из вариантной цепи, с длиной по меньшей мере из их 12 аминокислотных остатков.

[0031] Предпочтительные способы выявления включают иммуноанализы в различных форматах, такие как, например, радиоиммуноанализы (RIA), хемилюминесцентные и флуоресцентные иммуноанализы, иммуноферментные анализы (ELISA), чипы гранул на основе Luminex, анализы с использованием белковых микрочипов и форматы быстрые тестов, такие как, например, иммунохроматографические тест-полоски.

[0032] Эти анализы могут представлять собой гомогенные или гетерогенные анализы, конкурентные или неконкурентные анализы. В особенно предпочтительном варианте осуществления анализ представлен в форме сэндвич-анализа, который является неконкурентным иммуноанализом, где подлежащая выявлению и/или количественному определению молекула связана с первым антителом и со вторым антителом. Первое антитело может быть связано с твердой фазой, например, с гранулой, поверхностью лунки или другого контейнера, чипа или полоски, а второе антитело представляет собой антитело, которое является меченым, например, красителем, радиоизотопом или реактивным или каталитически активной составляющей. Затем количество меченого антитела, связанного с анализируемым веществом, измеряют соответствующим способом. Общая композиция и процедуры, используемые в "сэндвич-анализах", общепризнаны и известны специалисту в данной области техники (см. документы The Immunoassay Handbook, Ed. David Wild, Elsevier LTD, Oxford; 3rd ed. (May 2005), ISBN-13: 978-0080445267; Hultschig C et al., Curr Opin Chem Biol. 2006 Feb; 10(l):4-10. PMID: 16376734, включенные в настоящее описание путем ссылки).

[0033] В одном особенно предпочтительном варианте осуществления анализ включает две захватывающие молекулы, предпочтительно антитела, которые оба присутствуют в виде дисперсий в жидкой реакционной смеси, причем первый компонент мечения присоединен к первой захватываюшей молекуле, причем указанный первый компонент мечения является частью системы мечения, основанной на гашении или амплификации или флуоресценции, или хемилюминесценции, а второй компонент мечения указанной системы маркировки присоединен ко второй захватывающей молекуле, с тем, чтобы после связывания обеих захватывающих молекул с анализируемым веществом генерировался измеряемый сигнал, который обеспечивает возможность выявления образованных сэндвич-комплексов в растворе, содержащем образец.

[0034] Еще более предпочтительно, указанная система мечения содержит редкоземельные криптаты или редкоземельные хелаты в комбинации с флуоресцентным красителем или хемилюминесцентным красителем, в частности, красителем цианинового типа. В контексте данного изобретения анализы на основе флуоресценции включают применение красителей, которые могут быть выбраны, например, из группы, содержащей FAM (5- или 6-карбоксифлуорецеин), VIC, NED, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат (FITC), IRD-700/800, цианиновые красители, такие как CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, Cy7, ксантен, 6-карбокси-2′,4′,7′,4,7-гексахлорфлуоресцеин (HEX), TET, 6-карбокси-4′,5′-дихлор-2′,7′-диметоксифлуоресцеин (JOE), N,N,N′,N′-тетраметил-6-карбоксиродамин (TAMRA), 6-карбокси-X-родамин (ROX), 5-карбоксиродамин-6G (R6G5), 6-карбоксиродамин-6G (RG6), родамин, родамин зеленый, родамин красный, родамин 110, BODIPY-красители, такие как BODIPY TMR, Oregon зеленый, кумарины, такие как умбеллиферон, бензимиды, такие как Hoechst 33258; фенантридины, такие как Техасский Красный, Yakima Желтый, Alexa Fluor, PET, этидийбромид, акридиновые красители, карбазоловые красители, феноксазиновые красители, порфириновые красители, полиметиновые красители и тому подобные.

[0035] В контексте данного изобретения анализы на основе люминесценции включают применение красителей, основанное на физических принципах, описанных для хемилюминесцентных материалов в документе Kirk-Othmer, Encyclopedia of chemical technology, 4^th ed., executive editor, J. I. Kroschwitz; editor, M. Howe-Crant, John Wiley & Sons, 1993, vol. 15, p. 518-562, включенном в настоящее описание путем ссылки, в том числе цитаты на страницах 551-562. Предпочтительными хемилюминесцентными красителями являются сложные эфиры акридиния.

[0036] Еще более предпочтительно, указанная система мечения содержит криптаты редкоземельных металлов или хелаты редкоземельных металлов в комбинации с флуоресцентным красителем.

[0037] Используемый в настоящем описании термин "пациент" относится к организму живого человека или животного, получающего медицинский уход, или которому следует получать медицинский уход ввиду заболевания. Этот термин включает лиц с не определенной болезнью, которые проходят обследование с целью выявления признаков патологии.

[0038] Используемый в настоящем описании термин “образец” относится к образцу биологической жидкости, полученному с целью диагностики, прогноза или оценки состояния представляющего интерес индивида, такого как пациент. Предпочтительные образцы для исследования включают кровь, сыворотку, цереброспинальную жидкость, мочу, слюну и плевральные выпоты. Кроме того, специалисту в данной области техники понятно, что анализ некоторых образцов для исследования мог бы облегчаться после процедуры фракционирования или очистки, например, разделения цельной крови на сыворотку или компоненты плазмы.

[0039] Таким образом, в одном предпочтительном варианте осуществления изобретения образец выбран из группы, включающей образец крови, образец сыворотки, образец цереброспинальной жидкости, образец слюны и образец мочи или экстракта любой из указанных выше образцов.

[0040] При целесообразности, может потребоваться гомогенизация или экстрагирование растворителем образца перед использованием в настоящем изобретении для получения жидкого образца. Таким образом, жидкий образец может представлять собой раствор или суспензию. Жидкие образцы могут быть подвергнуты одной или нескольким предварительным обработкам перед использованием в данном изобретении. Такие предварительные обработки включают без ограничения разбавление, фильтрацию, центрифугирование, концентрирование, осаждение, диализ. Предварительные обработки могут также включать добавление к раствору химических или биохимических веществ, таких как кислоты, основания, буферы, соли, растворители, реактивные красители, детергенты, эмульгаторы, хелатообразующие агенты.

[0041] Чувствительность и специфичность диагностического и/или прогностического теста зависит не только от аналитического "качества" теста, но они также зависят от определения того, что составляет отклоняющийся от нормы результат. На практике, зависимость чувствительности определения от частоты ложноположительных заключений (ROC-кривые) рассчитывают обычно построением графика зависимости величины параметра от его относительной частоты у "нормальной" (т.е. практически здоровой) и "имеющей заболевание" популяции (т.е. пациентов, страдающих AF). Для любого конкретного маркера, распределение уровней маркеров для индивидов с заболеванием и без заболевания, вероятно, будет перекрываться. В таких условиях, тест не обеспечивает абсолютную дифференцировку здоровых пациентов от больных со 100% точностью, и эта зона перекрывания указывает, где тест не способен отличать норму от заболевания. Выбирается порог, выше которого (или ниже которого, в зависимости от того, как изменяется маркер при наличии заболевания) результат теста считается отклоняющимся от нормы, и ниже которого результат теста считается нормальным. Площадь под ROC-кривой является показателем вероятности того, что полученное измерение обеспечит возможность правильной идентификации состояния. Кривые ROC могут использоваться, даже когда результаты теста необязательно дают точное число. Пока возможно ранжирование результатов, возможно построение ROC-кривой. Например, результаты теста по образцам "заболевания" могут ранжироваться в соответствии со степенью (например, 1=низкая, 2=нормальная и 3=высокая). Это ранжирование может коррелироваться с результатами в "нормальной" популяции, и возможно построение ROC-кривой. Эти способы хорошо известны в данной области техники (см. например, Hartley et al. 1982. Radiology 143: 29-36). Предпочтительно ROC-кривая приводит к получению площади под кривой (AUC), большей чем примерно 0,5, предпочтительно большей чем примерно 0,7, еще предпочтительно большей чем примерно 0,8, еще предпочтительно большей чем примерно 0,85 и наиболее предпочтительно большей чем примерно 0,9. Термин "примерно" в настоящем контексте относится к ±5% данной измеренной величины.

[0042] Горизонтальная ось ROC-кривой представляет величину (1-специфичности), которая увеличивается по мере увеличения частоты ложноположительных результатов измерения. Вертикальная ось кривой представляет чувствительность, которая увеличивается с увеличением частоты истинных положительных результатов измерения. Таким образом, для конкретной выбранной пороговой величины может быть определена величина (1-специфичности) и может быть получена соответствующая чувствительность. Площадь под ROC-кривой является показателем вероятности того, что измеренный уровень маркера обеспечит возможность правильной идентификации заболевания или состояния. Таким образом, площадь под ROC-кривой можно использовать для определения эффективности теста.

[0043] В определенных вариантах осуществления маркер или комбинация маркеров проявляет чувствительность по меньшей мере примерно 70%, предпочтительно чувствительность по меньшей мере примерно 80%, более предпочтительно чувствительность по меньшей мере примерно 85%, более предпочтительно чувствительность по меньшей мере примерно 90% и наиболее предпочтительно чувствительность по меньшей мере примерно 95%, объединенную по меньшей мере с 70%-ной специфичностью, приблизительно 80%-ной специфичностью, даже более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 85%-ной специфичностью, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90%-ной специфичностью и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95%-ной специфичностью. В особенно предпочтительных вариантах осуществления, и чувствительность, и специфичность составляют по меньшей мере примерно 75%, предпочтительно по меньшей мере примерно 80%, еще предпочтительно по меньшей мере примерно 85%, еще предпочтительно по меньшей мере примерно 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 95%. Термин "примерно" в настоящем контексте относится к ±5% конкретной величины измерения.

[0044] Пороговые уровни можно получить, например, по анализу Каплана-Майера, где наличие заболевания коррелирует с квартилями маркеров в популяции. Согласно этому анализу у индивидов с уровнями маркеров выше 75-го процентиля имеется значимо возросшая вероятность их принадлежности к группе, в которой время от начала AF до поступления пациента в клинику составляет меньше определенной пороговой величины времени. Этот результат дополнительно подтверждается анализом регрессии Кокса с полной коррекцией на классические факторы риска. Наивысший квартиль относительно всех других индивидов характеризуется высоко значимой связью с интервалом времени ниже определенной пороговой величины времени.

[0045] Другими предпочтительными величинами пороговой величины являются, например, 90-й, 95-й или 99-й процентиль здоровой популяции. При использовании более высокого процентиля, чем 75-й процентиль, уменьшается количество ложноположительных идентифицированных индивидов, но может быть пропущена идентификация индивидов, которые имеют умеренный, но все же повышенный риск. Таким образом, может быть принята величина пороговой величины в зависимости от того, считается ли она более подходящей для идентификации большинства индивидов с риском за счет идентификации также "ложноположительных" индивидов, или от того, считается ли она более подходящей для идентификации главным образом индивидов с высоким риском за счет пропущенных нескольких индивидов с умеренным риском.

[0046] Другими математическими возможностями для расчета риска у индивида с использованием величины уровня маркеров у индивида и других прогностических лабораторных и клинических параметров являются, например, NRI (точный индекс переклассификации) или IDI (интегрированный индекс различения). Эти индексы могут быть рассчитаны в соответствии с данными Pencina (Pencina MJ, et al.: Evaluating the added predictive ability of a new marker: from area under the ROC curve to reclassification and beyond. Stat Med. 2008; 27:157-172).

[0047] Согласно этому способу, у пациента диагностируют наличие времени, прошедшего от начала AF до поступления в клинику, составляющего <48 ч, когда указанный определенный уровень proANP или его фрагментов, в частности уровень MR-proANP, выше, чем заданный пороговый уровень. Предпочтительно, заданный пороговый уровень составляет от 100 до 350 пмоль/л, предпочтительно от 100 пмоль/л до 250 пмоль/л, более предпочтительно от 100 пмоль/л до 190 пмоль/л, наиболее предпочтительно от 100 пмоль/л до 160 пмоль/л.

[0048] Указанные выше величины могут отличаться в других анализах, выявляющих proANP или его фрагменты, если их калибровали иным образом. Соответственно, указанные выше величины применяются для таких различным образом калиброванных анализов proANP, с учетом различий в калибровке. Одной возможностью количественного определения различия в калибровке является способ сравнительного анализа (корреляции) рассматриваемого анализа с анализом MR-proANP, используемым в настоящем изобретении, измерением proANP или его фрагментов с применением обоих способов. Другой возможностью является определение рассматриваемым анализом proANP, при условии, что этот тест имеет достаточную аналитическую чувствительность, медианное значение уровня proANP репрезентативной здоровой популяции, сравнение полученных результатов с медианными значениями уровня анализируемого вещества, как описано здесь, и перерасчет калибровки на основании различия, полученного этим сравнением.

Описание чертежей

[0049] Изобретение будет теперь описано более подробно со ссылкой на прилагаемые чертежи и следующие примеры.

На фиг. 1 показана кривая операционной характеристики для MR-proANP и NT-proBNP, связанная со временем от начала AF до поступления в клинику, меньшим чем 48 часов, и

на фиг. 1 показана кривая операционной характеристики для MR-proANP и NT-proBNP, связанная со временем от начала AF до поступления в клинику, меньшим чем 24 часа.

ПРИМЕРЫ

Структура исследования и популяция

[0050] С июня 2010 г до сентября 2010 г неотобранных пациентов, которые обращались в отдел кардиологии Кочинского госпиталя для лечения AF, рассматривали в отношении возможности включения в исследование. AF определяли на основании ЭКГ в виде сердечной аритмии с нерегулярным интервалом RR (временем между двумя последовательными зубцами R на электрокардиограмме), отсутствия отчетливого зубца P и параметра в виде длительности предсердного цикла (при возможности его визуальной оценки) <200 мс. Критериями исключения были 1) AF как осложнение острого состояния (т.е. острого инфаркта миокарда, после хирургического вмешательства, сепсиса, острой респираторной недостаточности), 2) пациенты с тяжелой почечной недостаточностью (клиренсом креатинина <30 мл/мин) и 3) пациенты, которые поступали с AF и с клиническим подозрением на сопутствующую острую декомпенсированную сердечную недостаточность на основании одышки (вновь появившейся или усугубляющейся), и обязательно подтвержденную в соответствии с существующими инструкциями (Jessup et al. 2009. Circulation 119:1977-2016). Пациенты давали письменное информированное согласие, и местный комитет по этике утверждал протокол исследования.

Стандартная клиническая оценка состояния и лечение

[0051] В дополнение к клиническому анамнезу, физикальному обследованию и ЭКГ в 12 отведениях, всех пациентов подвергали 1) рентгенографии грудной клетки, 2) стандартным анализам крови, которые включали серологические тесты функции щитовидной железы и измерение уровня печеночных ферментов, и 3) трансторакальную эхокардиографию (TTE), выполняемую опытным кардиологом, с использованием системы ATL HDI 5000 (ультразвукового аппарата ATL и Bothell, Washington, DC) в соответствии с рекомендациями Американского эхокардиографического общества.

[0052] Решение о выполнении TEE и выбор между стратегией контроля ритма кардиоверсией или стратегией контроля частоты сердечных сокращений оставляли на усмотрение врача. Пациенты, у которых рассматривали применение кардиоверсии, должны были получать пероральную антикоагулянтную терапию в течение по меньшей мере 3 недель или подвергаться ТЕЕ с соблюдением существующих рекомендаций (Camm et al. 2010. Eur Heart J. 31: 2369-2429; Fuster et al. 2006. Circulation 114:e257-354).

Оценка времени от начала AF до поступления пациента в клинику

[0053] AF классифицировали как пароксизмальную, стойкую и длительную, и время начала независимо определяли 2 кардиолога по следующим показателям: 1) появление симптомов, отмеченное пациентом (в основном учащенного сердцебиения), 2) возможные результаты предыдущих регистраций ЭКГ и 24-часового холтеровского мониторинга в стационарных и амбулаторных условиях и 3) последний результат определения сердечного ритма, отмеченный ответственным за пациента врачом, вне стационара (в том числе врачом общей практики). Разногласия разрешал третий кардиолог.

Биохимический анализ

[0054] Образцы крови брали в пластиковые пробирки, содержащие гепаринат Li⁺, и плазму хранили при -80°C перед анализом. Образцы крови брали у пациента при поступлении после нахождения в положении лежа на спине в течение по меньшей мере 30 минут, из вены локтевого сгиба. Уровень MR-proANP измеряли с использованием анализатора Kryptor (B.R.A.H.M.S GmbH, Hennigsdorf, Germany). При этом иммунофлуоресцентном анализе используется технология амплифицированной эмиссии крипата с временным разрешением (TRACE), которая основана на переносе нерадиоактивной энергии от донорской молекулы (криптата) к акцепторной молекуле (XL665) в результате завершенной иммунной реакции. Оценка и описание аналитических характеристик способа можно найти в других источниках. В лаборатории заявителей было обнаружено, что коэффициенты вариации составляли <5%: 3,4% при 419,0 пмоль/л и 3,7% при 89,2 пмоль/л (Chenever-Cobeaux et al. 2010, Clin Chem 56: 1708-1717).

[0055] Уровни NT-proBNP в плазме измеряли с использованием имеющегося в продаже набора для иммунофлуоресцентного анализа (Elecsys proBNP, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). Этот анализ имеет функциональную чувствительность 30 пг/мл с верхним пределом измерения 35000 пг/мл и коэффициентом вариации в диапазоне 1,0-6,0%.

Статистический анализ

[0056] Величины выражали в виде средних величин ± стандартное отклонение, медиан с межквартильным [IQR] диапазоном или при целесообразности в виде импульсов и процентных долей. Наличие любой корреляции между натрийуретическими пептидами и другой переменной величиной исследовали с использованием корреляции Спирмэна. Способность натрийуретических пептидов и других клинических и лабораторных параметров выявлять различие между пациентами с недавним началом (<48 часов) и пациентами с более продолжительной AF исследовали сначала в одномерном анализе с использованием t-критерия Стьюдента или U-критерия Манна-Уитни в отношении непрерывных переменных величин и теста хи-квадрата или точного критерия Фишера для определения различия в частотах, в соответствии с целесообразностью. Затем выполняли многомерный анализ логистической регрессии, включающий все переменные величины, которые были получены в одномерном анализе, для тестирования возможной независимой диагностической информации, предоставляемой натрийуретическими пептидами. Кривые зависимости чувствительности определения от частоты ложноположительных заключений (ROC) строили для оценки чувствительности и специфичности по всем величинам концентрации натрийуретических пептидов; идеальную пороговую величину определяли по ROC-кривой, и представляли чувствительность и специфичность. Все статистические анализы выполняли с использованием программного обеспечения STATA в версии 10.1 (StataCorp LP, College Station, TX), и величину р, меньшую, чем 0,05, считали статистически значимой.

Результаты

[0057] С июня по сентябрь 2010 г 57 пациентов были направлены для лечения AF. Из них 9 пациентов не могли быть включены в исследование (4 пациента перенесли острый инфаркт миокарда, 3 - кардиогенный или не кардиогенный шок, у одного была тяжелая почечная недостаточность и один страдал острой декомпенсированной сердечной недостаточностью). Еще у одного пациента не определяли содержание натрийуретических пептидов. Поэтому в исследование были включены 47 пациентов. Характеристики пациентов на время начала AF до поступления пациента в клинику </≥48 ч перечислены в Таблице 1. Медианный возраст при включении составил 72 года [61-81] и соотношение полов составило 1,9. AF была пароксизмальной у 22 пациентов, стойкой - у 6 и длительной - у 19. У 19 пациентов (40,4%) начало AF отмечено в пределах 48 часов; во всей когорте медианная продолжительность AF составила 5 дней [1-120].

[0058] Уровни MR-proANP находились в диапазоне от 78,8 до 903,3 пмоль/л. Отмечали частичную, но значимую корреляцию между уровнем MR-proANP и временем от начала AF до поступления пациента в клинику, фракцией изгнания левого желудочка (LVEF), содержанием гемоглобина, но не частотой сердечных сокращений или концентрацией креатинина (Таблица 2). Кроме того, отмечали значимую корреляцию между уровнем MR-proANP и NT-proBNP (коэффициент Спирмена r=0,71, p<0,001). Величины концентрации MR-proANP у различных подгрупп (с параксизмальной, стойкой и длительной AF, соответственно) представлены в Таблице 3.

Анализ времени от начала AF до поступления пациента в клинику (</≥48 ч)

[0059] Пациенты с началом AF <48 ч имели уровни MR-proANP, существенно сниженные в сравнении с пациентами с началом AF≥48 ч (144,0 [129,2-213,7] пмоль/л в сравнении с 321,7 [236,4-425,6] пмоль/л, соответственно, p<0,001) (Таблица 3). Другие показатели, связанные с AF <48 ч, представляли собой более молодой возраст, увеличенную частоту сердечных сокращений, сохранную LVEF, сохранный гемоглобин (Таблица 1). В мультвариантном анализе, уровень MR-proANP был единственным параметром, который оставался связанным с AF, начинавшейся менее чем за 48 часов до поступления пациента в клинику (p=0,021).

[0060] Площадь под ROC-кривой для идентификации пациентов с началом AF, меньшим чем 48 часов перед госпитализацией, составляла 0,90 для MR-proANP и 0,82 для NT-proBNP, соответственно (p<0,05; Фиг. 1). Исключение пациентов с LVEF<50% (12 пациентов) не изменяло эти результаты; в этом случае уровень MR-proANP составил 140,8 [129,2-191,6] пмоль/л у пациентов с AF при начале <48 часов в сравнении с 321,7 [213,5-422,0] пмоль/л у пациентов с AF при начале ≥48 ч (p<0,001).

[0061] На основании анализа кривых ROC заявители идентифицировали две возможные пороговые величины MR-proANP для выявления пациентов с AF, начавшейся менее чем за 48 часов до госпитализации. Пороговая величина 191,6 пмоль/л могла приводить к чувствительности и специфичности 85,7% и 73,8%, соответственно; предельная величина 161,9 пмоль/л могла приводить к чувствительности 92,9% и специфичности 63,2%. Величины чувствительности и специфичности примерных предельных величин MR-proANP для дифференцировки пациентов со временем от начала AF до поступления в клинику <48 ч от пациентов со временем от начала AF до поступления в клинику ≥48 ч приведены в таблице 4.

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

SEQ ID NO: 1 (аминокислотная последовательность proANP):

1 NPMYNAVSNA DLMDFKNLLD HLEEKMPLED EVVPPQVLSE PNEEAGAALS

51 PLPEVPPWTG EVSPAQRDGG ALGRGPWDSS DRSALLKSKL RALLTAPRSL

101 RRSSCFGGRM DRIGAQSGLG CNSFRY

SEQ ID NO: 2 (аминокислотная последовательность ANP):

1 SLRRSSCFGG RMDRIGAQSG LGCNSFRY

SEQ ID NO: 3 (аминокислотная последовательность NT-proANP):

1 NPMYNAVSNA DLMDFKNLLD HLEEKMPLED EVVPPQVLSE PNEEAGAALS

51 PLPEVPPWTG EVSPAQRDGG ALGRGPWDSS DRSALLKSKL RALLTAPR

SEQ ID NO: 4 (аминокислотная последовательность-proANP):

1 PEVPPWTGEV SPAQRDGGAL GRGPWDSSDR SALLKSKL

SEQ ID NO: 5 (аминокислотная последовательность pro-BNP):

1 HPLGSPGSAS DLETSGLQEQ RNHLQGKLSE LQVEQTSLEP LQESPRPTCV

51 WKSREVATEG IRGHRKMVLY TLRAPRSPKM VQGSGCFGRK MDRISSSSGL

101 GCKVLRRH

SEQ ID NO: 6 (аминокислотная последовательность BNP):

1 SPKMVQGSGC FGRKMDRISS SSGLGCKVLR RH

SEQ ID NO: 7 (аминокислотная последовательность NT-pro-BNP):

1 HPLGSPGSAS DLETSGLQEQ RNHLQGKLSE LQVEQTSLEP LQESPRPTCV

51 WKSREVATEG IRGHRKMVLY TLRAPR

Значимое поражение клапанов определяется как клапанный стеноз и/или незначительная регургитация при клапанной недостаточности.