Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДООПЕРАЦИОННОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ НОВООБРАЗОВАНИЙ КОСТНОЙ ТКАНИ

Изобретение относится к области медицины, а именно онкологии, ортопедии и травматологии. Данное техническое решение направлено на создание способа дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований костной ткани на дооперационном этапе для определения «маршрута» пациента в специализированное лечебное учреждение и выбора адекватного вида хирургического лечения.

Опухоли опорно-двигательной системы, в частности новообразования костей, один из важных и трудных в диагностическом и лечебном плане разделов клинической онкологии. Чаще всего опухоли костей поражают детей и лиц молодого возраста, то есть самый социально значимый контингент населения.

Внедрение новых технологий в медицине позволяет выполнять радикальные органосохраняющие и функционально-щадящие хирургические вмешательства с удалением больших объемов измененных тканей в случае их малигнизация и последующим эндопротезированием, пластикой дефектов тканей и их замещением имплантатами. Успехи активно развивающейся реконструктивно-пластической хирургии стимулируют интерес к точности оценки доброкачественности/злокачественности опухоли на дооперационном этапе.

Диагностика опухолей и опухолеподобных заболеваний костного скелета имеет свои особенности. Следует подчеркнуть, что эти особенности принципиально отличаются от методов диагностики опухолей других локализаций.

В современной онкологии для дифференциальной диагностики опухолей костей применяется широкий спектр лучевых методов исследования. [Епифанова С.В. Роль магнитно-резонансной и компьютерной томографии в предоперационной оценке распространенности опухолей опорно-двигательной системы: автореф. дис. … канд. мед. наук. - М., 2013]. Каждый из диагностических лучевых методов выполняет свою роль в алгоритме обследования, обладая различной степенью информативности, обусловленной преимуществами и недостатками объективного и субъективного характера, и в большинстве случаев констатирует наличие, локализацию, объемы патологии и с низкой точностью ее тип - доброкачественная или злокачественная.

В настоящее время основным способом диагностики типа опухоли на дооперационном этапе остается биопсия новообразования с последующим гистоморфологическим исследованием, при осуществлении которого забранный материал фиксируют в течение суток в 10%-ом нейтральном формалине, затем для обезжиривания проводят через ряд спиртов и хлороформов и заливают в парафин. Из полученных парафиновых блоков изготавливают срезы толщиной 5-7 мк, окрашивают их гематоксилином и эозином по методу Ван-Гизона, Ниссля, Шпильмеера. Окрашенные стекла анализирует опытный патологоанатом.

В свою очередь, биопсия имеет ряд недостатков: во-первых, она является операцией, что достаточно травматично для пациента; во-вторых, обработка одного образца материала проводится в течение 7-10 рабочих дней.

В связи с вышесказанным, на сегодняшний день существует потребность в разработке малоинвазивных способов дифференциальной диагностики новообразований костной ткани. Авторы всех нижеперечисленных способов диагностики новообразований костной системы, основанных на оценке лабораторных параметров, не заявляли их как диагностические методики, проводимые на дооперационном этапе, но по специфике их выполнения, по нашему мнению, могут быть применимы и в этом качестве. В связи с этим и отсутствием в литературе описания способов проведения дооперационной дифференциальной диагностики новообразований костной системы малоинвазивными методами считаем близкими аналогами к заявляемому изобретению указанные ниже методики.

Одним из возможных подходов к дифференциальной диагностике костных опухолевых новообразований могли бы стать серологические маркеры. По данным анализа отечественных и зарубежных литературных источников на роль специфичных маркеров костной резорбции и остеообразования претендуют одна из изоформ тартратрезистентной кислой фосфатазы (TRAP-5b) и костная фракция щелочной фосфатазы (КФЩФ). Показано, что TRAP-5b в процессе резорбции кости секретируется остеокластами в кровь, отражает их активность в реальном времени и, как следствие, скорость разрушения костной ткани. КФЩФ является специфичным маркером остеобластов, за счет которых происходит синтез новой костной ткани [Державин В.А. Диагностический алгоритм использования серологических маркеров остеосинтеза и остеолизиса у больных первичными местнораспространенными и диссеменированными опухолями костей. Автореф. дис. … канд. мед. наук. - М., 2010].

Однако определение сывороточной концентрации маркеров метаболизма костной ткани, таких как тартратрезистентная кислая фосфатаза и костная фракция щелочной фосфатазы, имеет ограниченное значение вследствие своей низкой специфичности у больных с первичными местнораспространенными и диссеминированными опухолями костей вследствие возможности продукции данных маркеров в растущей кости, а также при наличии переломов костей и замедленной их консолидации.

Известно также, что в механизмах роста, апоптоза, пролиферативной активности и ангиогенеза при опухолях костей участвует ряд цитокинов - низкомолекулярных пептидов, секретируемых клетками воспаления, иммунного ответа и самой опухоли. Клетки злокачественных опухолей и их микроокружение могут сами секретировать некоторые цитокины, в том числе IL-6, и экспрессировать соответствующие рецепторы. При этом чрезмерная продукция IL-6 может благоприятствовать росту опухоли и усилению ее васкуляризации, что способствует распространению регионарных и отдаленных метастазов. В связи с этим имеются сведения о том, что в сыворотке крови больных с опухолями костей, в частности остеосаркомой и хондросаркомой, наблюдается повышение уровня IL-6, причем секреция последнего возрастает при диссеминации опухолевого процесса [Тарасова Т.А. Интерлейкин-6 и его рецептор в сыворотке крови больных опухолями и опухолеподобными поражениями костей. Автореф. дис. … канд. мед. наук. - М., 2010].

Однако изолированное определение концентрации IL-6 не позволяет достоверно осуществлять дифференциальную диагностику доброкачественных и злокачественных опухолей, а также степени прогрессии злокачественных опухолей ввиду влияния различных неспецифических факторов на содержание данного интерлейкина в сыворотке крови. Согласно литературным данным повышение концентрации IL-6 может быть связано с неспецифическими и специфическими локальными и генерализованными инфекционно-воспалительными процессами, аутоиммунными заболеваниями, травматической болезнью, аллергическими реакциями.

Известно также, что у больных со злокачественными опухолями костей наблюдается значительное повышение уровня фактора некроза опухоли TNF-α, определенного методом иммуноферментного анализа в периферической крови, чем у группы контроля (значения показателя в норме) [Xiao Т. et al. Determination and significance of patients with malignant bone tumors. Hunan Yi Ke Da Xue Bao. 1998. 23(6): 596-598].

Однако исследования были проведены на клетках крови (моноцитах) больных опухолями, которые были индуцированы липополисахаридом, что позволяет считать полученные доказательства участия TNF-α в патогенезе опухолей костей косвенными. Это связано с тем, что в условиях отсутствия опухолевого процесса липополисахарид сам по себе может стимулировать выброс TNF-α.

Известен также «Способ диагностики опухолей костной системы» [патент RU на изобретение 2454665, основными авторами которого являются авторы заявляемого изобретения]. В сыворотке крови спектрофотометрически определяют количественное значение уровня неоптерина. При значении выше 2,6 нг/мл до 7,0 диагностируют доброкачественный опухолевый процесс, при значении выше 7,1 нг/мл - злокачественный опухолевый процесс.

Однако в данном способе учитывается только один компонент, который отражает лишь частично взгляд на взаимодействие между отдельными цитокинами и иммунокомпетентными клетками, что приводит к понижению объективности и чувствительности способа диагностики.

Наиболее близким аналогом к заявляемому изобретению является «Способ диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований костной системы» [патент RU на изобретение 2522223, основными авторами которого также являются авторы заявляемого изобретения]. Производят взятие венозной крови. Подготавливают образцы проб сыворотки крови. Исследуют полученные образцы методом иммуноферментного анализа ИФА на планшетах с определением количественных значениий уровней неоптерина NP, молекулы адгезии сосудистого эндотелия vCAM, молекулы межклеточной адгезии ICAM, фактора некроза опухоли TNF-α, интерлейкина-6 IL-6. Анализируют полученные данные. Рассчитывают с их учетом коэффициент К по формуле: При значении К≤12,5 диагностируют доброкачественный процесс, при значении К>12,5 - злокачественный процесс.

Однако предлагаемый способ не учитывает степень повреждения внеклеточного матрикса костной ткани, обусловленного локальной прогрессией злокачественной опухоли.

Задачей заявляемого изобретения является повышение специфичности и информативности диагностики новообразований костной ткани с возможностью определения характера опухоли малоинвазивным методом на дооперационном этапе для оптимизации тактики ведения пациента с обеспечением внесения корректировок в технологию проведения хирургического вмешательства и распределения его в специализированное лечебное учреждением с учетом уровня сложности выполнения планируемых манипуляций.

Сущность заявляемого изобретения заключается в том, что в способе дооперационной дифференциальной диагностики новообразований костной ткани, включающем взятие венозной крови, подготовку образцов проб сыворотки крови, исследование полученных образцов методом иммуноферментного анализа ИФА на планшетах с определением количественного значения уровня неоптерина NP, фактора некроза опухоли TNF-α, интерлейкина-6 IL-6, при исследовании образцов сыворотки крови дополнительно определяют количественные значения уровней фактора роста эндотелия сосудов VEGF, матриксных металлопротеиназ ММР-2 и ММР-9, тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы-1 TIMP-1, анализируют полученные данные, рассчитывают с их учетом коэффициент К по формуле:

и при значении К≤15,8 диагностируют доброкачественный процесс, при значении К>15,8 - злокачественный процесс.

Технический результат заявляемого изобретения заключается в решении поставленной ранее задачи.

Использование при дооперационной диагностике комплекса иммунологических маркеров, регулирующих клеточную пролиферацию - NP, TNF-α, IL-6 и неоваскулогенез - VEGF в норме и в процессе канцерогенеза путем совместного влияния на митотическую активность и состояния сосудистого эндотелия, позволяет повысить специфичность и чувствительность заявляемого способа оценки характера новообразований. Данные процессы являются основополагающими при клеточном росте, однако они являются неспецифическими, в связи с чем определение состояния внеклеточного матрикса посредством исследования уровней матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов позволяет сделать предлагаемую методику еще более специфичной и чувствительной в процессе дифференциальной диагностики новообразований костной ткани. Кроме того, исследование состояния маркеров межклеточного матрикса в этом случае свидетельствует не только о наличии злокачественного образования, но и о его прогрессии в пределах той или иной кости, что повышает информативность заявляемой методики.

Данный способ малоинвазивен. Для его выполнения необходимо взятие биоматериала в виде венозной крови, забор которой обязателен в амбулаторно-поликлинических условиях, а значит, не требуется осуществления дополнительных манипуляций, в частности проколов мягких тканей.

С 2005 г. по 2010 г. в рамках реализации Национального проекта «Здоровье» было выделено финансирование на оснащение поликлинических учреждений оборудованием и наборами реагентов для проведения иммуноферментного анализа. В связи с этим реализация данного способа диагностики на дооперационном этапе не вызовет никаких трудностей, а малые затраты по времени на его проведение позволит использовать его в работе с большим количеством больных.

Возможность определения характера новообразования костной ткани на дооперационном этапе в амбулаторно-поликлинических условиях способствует оптимизации процесса распределения пациентов по лечебным учреждениям для последующего проведения хирургического вмешательства с учетом степени сложности проводимой манипуляции. Это позволит снять нагрузку со специализированных диспансеров онкологического профиля, тем самым, повысив качество проводимого лечения сложных случаев. Данный технический результат позволяет также внести корректировки в методику проведения хирургического вмешательства, в частности в объемы резекции костной ткани, повысив эффективность проводимого лечения.

Способ дооперационной дифференциальной диагностики новообразований костной ткани осуществляют следующим образом. Критериями отбора пациентов для осуществления данного способа являются рекомендации по выполнению радикального хирургического лечения по удалению новообразований костной ткани, выявленных при осуществлении лучевых исследований - рентгенографии, магнитно-резонансной и компьютерной томографии. Под новообразованиями костной ткани понимают опухолевые или опухолевидные образования костей различной локализации (первичных, вторичных), либо образования, сопровождающие вторичные изменения костной ткани - зоны деструкции, патологические переломы и др.

В амбулаторно-поликлинических условиях пациентам с подозрением на наличие вышеуказанных новообразований костной ткани осуществляют клиническое обследование с помощью стандартных методов, т.е. с оценкой жалоб и соматического статуса, детальным сбором анамнеза с выявлением факторов, влияющих на иммунный статус, проведением лучевых исследований, в большинстве случаев, обзорной рентгенографии исследуемой части скелета не менее чем в двух взаимоперпендикулярных проекциях, а при необходимости результаты рентгенологического исследования дополняют прицельными снимками и томограммами.

После клинического обследования у больных с подтвержденным наличием новообразований костной ткани производят взятие образца венозной крови в пробирку объемом 5 мл. С помощью центрифугирования готовят образцы проб сыворотки крови. Исследуют полученные образцы сыворотки крови методом твердофазного иммуноферментного анализа ИФА на планшетах. При этом определяют в сыворотке крови количественные значения уровней неоптерина NP, фактора некроза опухоли TNF-α, интерлейкина-6 IL-6, фактора роста эндотелия сосудов VEGF, матриксных металлопротеиназ ММР-2 и ММР-9, тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы-1 TIMP-1. Для этого измеряют с помощью планшетного спектрофотометра оптическую плотность раствора в лунках при длине волны 450 нм и рассчитывают количественные значения уровней вышеперечисленных параметров. Анализируют полученные данные и рассчитывают с их учетом коэффициент К по формуле:

При значении К≤15,8 диагностируют доброкачественный процесс, при значении К>15,8 - злокачественный процесс.

По полученным результатам пациента направляют на хирургическое лечение в специализированное лечебное учреждение с учетом уровня сложности планируемой манипуляции и рекомендациями хирургу по выбору тактики ведения операций, в частности при злокачественном процессе - пересмотр объема резецируемой костной ткани.

Заявляемый способ был предварительно апробирован в ФГБУ «СарНИИТО» Минздрава России, на базе которого работают не только клинические отделения, выполняющие разнообразные хирургические вмешательства по травматолого-ортопедическому и нейрохирургическому профилям, но и поликлиническое отделение, занимающееся отбором пациентов и их распределением с учетом диагноза.

Пример 1

Пациент П., 28 лет, обратился в поликлиническое отделение СарНИИТО с жалобами на боль при ходьбе и припухлость на уровне средней трети голени. Указанные жалобы отмечает в течение последних нескольких месяцев. После проведенного клинико-лучевого обследования выявлено наличие опухолевидного образования диафиза большеберцовой кости. С целью дооперационной дифференциальной диагностики, направленной на определение характера обнаруженного новообразования, на основании комплекса предлагаемых лабораторных параметров был рассчитан коэффициент К, значение которого составило 12,4. Полученное значение свидетельствовало о доброкачественности имеющегося у пациента новообразования. Пациент был направлен на дальнейшее хирургическое лечение в отделение ортопедии СарНИИТО, где было выполнено радикальное удаление опухолевидного новообразования большеберцовой кости в пределах здоровых тканей с замещением костного дефекта остеопластическим материалом. По результатам гистоморфологического исследования операционного материала была диагностирована остеобластокластома без признаков малигнизации.

Пример 2

Пациент Г., 37 лет, обратился в поликлиническое отделение СарНИИТО с жалобами на болезненность при осевой нагрузки в верхней трети правого бедра, усиливающуюся при его отведении, наличие припухлости и незначительной деформации в этой зоне. Указанные жалобы отмечает в течение последних нескольких месяцев. После проведенного клинико-лучевого обследования выявлено наличие опухолевидного образования в верхней трети правой бедренной кости. С целью дооперационной дифференциальной диагностики, направленной на определение характера обнаруженного новообразования, на основании комплекса предлагаемых лабораторных параметров был рассчитан коэффициент К, значение которого составило 17,2. Полученное значение свидетельствовало о злокачественности имеющегося у пациента новообразования. Пациент был направлен на дальнейшее хирургическое лечение в специализированный стационар онкологического профиля, где было выполнено радикальное удаление опухолевидного новообразования бедренной кости с замещением костного дефекта остеопластическим материалом. По результатам гистоморфологического исследования операционного материала была диагностирована остеосаркома.