Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ СНИЖЕНИЯ СЕРОПОЗИТИВНОСТИ ЖИВЫХ ПРОТИВОБРУЦЕЛЛЕЗНЫХ ВАКЦИН ДЛЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к ветеринарной микробиологии, и может быть использовано для профилактики бруцеллезной инфекции у сельскохозяйственных животных.

Бруцеллез - инфекционное заболевание, поражающее различные виды животных и человека. Заболевание передается только от животного к человеку или от животного к животному. Заболевание бруцеллезом наносит существенный экономический ущерб животноводству, так как вызывает уменьшение продуктивности, снижение жизнеспособности приплода, а проводимые ветеринарно-санитарные мероприятия требуют значительных материальных затрат.

Ущерб, причиняемый бруцеллезом, усугубляется заболеванием людей, которое ведет к потере трудоспособности и часто к пожизненной инвалидности.

Для профилактики бруцеллеза в настоящее время широко используют живые вакцины из штаммов, находящихся в стабильной S-форме, - В.abortus 19, B.melitensis Rev-1, которые служат эталоном при разработке других бруцеллезных вакцин.

Все применяемые вакцины из штаммов, находящихся в S-форме, имеют выраженные антигенные свойства и стимулируют продолжительный иммунитет (8-24 месяца). Однако их иммуногенность находится в прямой зависимости от остаточной вирулентности и приживаемости. Данные вакцины имеют выраженную серопозитивность, т.е. способность индуцировать специфические бруцеллезные антитела, которые длительно присутствуют в крови вакцинированных животных. Выявление больных животных основано на выявлении бруцеллезных антител в крови. В результате вакцинации в течение длительного времени затрудняется дифференциация вакцинированных животных от инфицированных.

Несмотря на целый ряд предложений, в настоящее время в ранние сроки после вакцинации невозможно отличать привитых животных от больных бруцеллезом.

Известны также способы снижения уровня серопозитивности за счет применения убитых вакцин (KB 17/100), живых вакцин из RS-штаммов бруцелл (из штамма 82, 75/79-АВ), вакцин на основе антигенов, выделенных из клеток бруцелл (бруцеллезная химическая вакцина). Данные вакцины наряду со сниженной серопозитивностью обладают слабой иммуногенностью (вакцины из убитых штаммов бруцелл и из антигенов), живые вакцины, полученные из RS-штаммов, обладают нестабильными свойствами и часто переходят в S-форму, что еще сильнее мешает дифференциальной диагностике (1, 2).

Наиболее близким способом, который можно принять за прототип, является использование вакцины из штамма 19 в малых дозах - 3 млрд. микробных клеток (3).

Использование вакцины из штамма 19 в малой дозе 3 млрд. микробных клеток также вызывает образование и длительную персистенцию специфических бруцеллезных антител, затрудняющих дифференцировку больных и вакцинированных животных, а дальнейшее уменьшение вакцинирующей дозы снижает ее иммуногенную активность.

Таким образом, применение уменьшенных доз вакцины полностью не решает проблему профилактической вакцинации и дифференциации вакцинированных животных от больных.

Задачей наших исследований является снижение негативных последствий (длительной серопозитивности) вакцинации домашних животных живыми противобруцеллезными вакцинами, мешающих дифференциации инфицированных и вакцинированных животных существующими коммерческими диагностикумами при проведении оздоровления хозяйств от бруцеллезной инфекции.

Техническим результатом является снижение титров специфических антител вплоть до недиагностического уровня и сокращение длительности серопозитивности у животных после проведения профилактической вакцинации.

Это достигается тем, что при введении живых вакцин из штамма В.abortus 19 в дозе от 100 млн. до 80 тыс. микробных клеток, из штамма B.melitensis Rev-1 в дозе 1 млн. до 10 тыс. микробных клеток совместно с бруцеллезным антигеном в дозе 0,005-2,0 мг/мл снижается индукция специфических бруцеллезных антител у крупного и мелкого рогатого скота, что позволяет проводить диагностические исследования и выявлять инфицированных животных в более ранние сроки по сравнению с другими вакцинами, созданными на основе живых штаммов бруцелл.

Возможность осуществления изобретения с реализацией указанного назначения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Коммерческую вакцину из штамма 19, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 25 млн. м.к. в мл. В 1 мл вакцины растворяем 0,05 мг антигена (антиген-ПА), полученного по А.С. СССР «Способ получения бруцеллезного антигена» №1256258, 1984 г.

Пример 2. Коммерческую вакцину из штамма 19, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 2,5 млн. м.к. в мл. В 1 мл вакцины растворяем 0,01 мг антигена-ПА.

Пример 3. Коммерческую вакцину из штамма 19, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 2,5 млн. м.к. в мл. В 1 мл вакцины растворяем 0,05 мг антигена-ПА.

Пример 4. Коммерческую вакцину из штамма 19, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 20 тыс. м.к. в мл. В 1 мл вакцины растворяем 0,05 мг антигена-ПА.

Пример 5. Коммерческую вакцину из штамма 19, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 2 тыс. м.к. в мл. В 1 мл вакцины растворяем 0,05 мг антигена-ПА.

Пример 6. Коммерческую вакцину из штамма 19, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 1 тыс. м.к. в мл. В одном мл вакцины растворяем 0,05 мг антигена-ПА.

Пример 7. Аналогичен примеру №5, но антиген-ПА добавляем из расчета 0,01 мг на мл вакцины.

Пример 8. Аналогичен примеру №5, но антиген-ПА добавляем из расчета 1 мг на мл вакцины.

Пример 9. Аналогичен примеру №6, но антиген-ПА добавляем из расчета 0,01 мг на мл вакцины.

Пример 10. Аналогичен примеру №6, но антиген-ПА добавляем из расчета 0,005 мг на мл вакцины.

Пример 11. Аналогичен примеру №6, но антиген добавляем из расчета 0,2 мг на мл вакцины.

Пример 12. Аналогичен примеру №6, но антиген-ПА добавляем из расчета 1 мг на мл вакцины.

Пример 13. Аналогичен примеру №6, но антиген-ПА добавляем из расчета 2 мг на мл вакцины.

Пример 14. Коммерческую вакцину из штамма 19, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 20 тыс. м.к. в мл. В 1 мл вакцины растворяем 0,05 мг глюкопротеидного антигена (антиген-ГА), полученного по методике, описанной в А.С. СССР «Способ получения бруцеллезного антигена» №691056.

Пример 15. Коммерческую вакцину из штамма 19, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 2 тыс. м.к. в мл. В 1 мл вакцины растворяем 1 мг антигена-ГА.

Пример 16. Коммерческую вакцину из штамма 19, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 1 тыс. м.к. в мл. В одном мл вакцины растворяем 0,5 мг белково-полисахаридного комплекса (антиген-БПК), полученного по А.С. СССР «Способ получения антигена» №467933.

Пример 17. Коммерческую вакцину из штамма РЕВ-1, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 500 тыс. м.к. в мл. В одном мл вакцины растворяем 0,05 мг антигена-ПА.

Пример 18. Коммерческую вакцину из штамма РЕВ-1, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 50 тыс. м.к. в мл. В одном мл вакцины растворяем 0,05 мг антигена-ПА.

Пример 19. Коммерческую вакцину из штамма РЕВ-1, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 5 тыс. м.к. в мл. В мл вакцины растворяем 0,05 мг антигена-ПА.

Пример 20. Коммерческую вакцину из штамма РЕВ-1, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 1 тыс. м.к. в мл. В одном мл вакцины растворяем 0,05 мг антигена-ПА.

Пример 21. Коммерческую вакцину из штамма РЕВ-1, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 500 м.к. в мл. В одном мл вакцины растворяем 0,05 мг антигена-ПА.

Пример 22. Аналогичен примеру №18, но антиген добавляем из расчета 0,01 мг на мл вакцины.

Пример 23. Аналогичен примеру №18, но антиген-ПА добавляем из расчета 1 мг на мл вакцины.

Пример 24. Аналогичен примеру №19, но антиген-ПА добавляем из расчета 2 мг на мл вакцины.

Пример 25. Аналогичен примеру №19, но антиген-ПА добавляем из расчета 0,01 мг на мл вакцины.

Пример 26. Аналогичен примеру №19, но антиген-ПА добавляем из расчета 0,2 мг на мл вакцины.

Пример 27. Аналогичен примеру №20, но антиген-ПА добавляем из расчета 0,1 мг на мл вакцины.

Пример 28. Аналогичен примеру №21, но антиген-ПА добавляем из расчета 0,5 мг на мл вакцины.

Пример 29. Коммерческую вакцину из штамма РЕВ-1, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 50 тыс. м.к. в мл. В одном мл вакцины растворяем 0,1 мг антигена-ГА.

Пример 30. Коммерческую вакцину из штамма РЕВ-1, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 5 тыс. м.к. в мл. В одном мл вакцины растворяем 0,2 мг антигена-БПК.

Пример 31. Коммерческую вакцину из штамма РЕВ-1, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 500 м.к. в мл. В одном мл вакцины растворяем 2 мг антигена-БПК.

Пример 32. Морские свинки весом 300-350 грамм, самки, по принципу аналогов были разделены на группы. Опытных морских свинок иммунизировали вакциной, полученной из штамма 19 в примерах 4-13, вакциной из штамма РЕВ-1, полученной по примерам 15-26. Через 30 дней по 5 морских свинок из каждой группы убивали и проводили бактериологическое исследование паренхиматозных органов и лимфатических узлов (всего 10 объектов) с целью определения расселяемости и приживаемости вакцинного штамма. Через 90 дней после иммунизации животных заражали вирулентным штаммом В.abortus 54 в дозе 10 ИД₁₀₀ и через 40 дней убивали и проводили бактериологическое исследование паренхиматозных органов и лимфатических узлов (всего 10 объектов) с целью определения уровня иммунитета у иммунизированных животных. В качестве контроля к каждой опытной группе служила группа животных, иммунизированных вакциной в той же концентрации микробных клеток, что и опытная, но без добавления антигена. В качестве контроля заражения использовали группу невакцинированных морских свинок и группу животных, вакцинированных одним антигеном. Через 15, 30, 60 и 90 дней после иммунизации у морских свинок брали кровь и проводили определение титра специфических антител в реакции агглютинации и реакции связывания комплемента с Антигеном бруцеллезным единым для РА, РСК, РДСК. Результаты бактериологических исследований представлены в таблицах 1 и 2, результаты серологических исследований представлены в таблицах 3 и 4.

Таким образом, как видно из таблиц 1 и 2, введение в состав пониженных доз живой противобруцеллезной вакцины антигена в концентрациях от 0,01 до 2 мг/мл позволяет увеличить расселяемость вакцинного штамма в организме морской свинки по сравнению с вакцинным штаммом, введенным без антигена. Иммунизация морских свинок вакциной из штамма 19 в дозах от 100 до 10 тыс. микробных клеток и вакциной из штамма Рев-1 в дозах от 50 до 10 тыс. микробных клеток вызывает иммунитет максимально у 30% животных. Антигены, выделенные из бруцелл, в дозах от 0,05 до 2 мг также индуцируют аналогичный иммунитет. Совместное применение живой противобруцеллезной вакцины и антигена в аналогичных дозах вызывают иммунитет у 60-100% животных. Уменьшение или увеличение вводимых концентраций вакцины и антигена не приводит к достижению поставленной цели.

Как видно из таблиц 3 и 4, введение в состав антигена позволяет снизить уровень специфических бруцеллезных антител, регистрируемых коммерческими диагностикумами, без снижения уровня иммунитета.

Пример 33. Овец в возрасте 3-5 месяцев разбили на группы по 10 голов в каждой и привили противобруцеллезной вакциной из штамма 19, полученной по примерам 1-4. В качестве контроля служили группы, привитые вакциной в полной дозе 40 млрд. м.к., в малой 1,5 млрд. м.к., а также животные, которым вводили культуру бруцелл из штамма 19 в уменьшенных дозах, соответствующих использованным при приготовлении препарата в примерах 1-4. У животных на 7, 15, 30, 60, 90 день брали кровь и исследовали в серологических реакциях (РБП, PA, PCK). Результаты представлены в таблицах 5, 6, 7.

Пример 34. Овец в возрасте 3-5 месяцев разбили на группы по принципу аналогов и привили противобруцеллезной вакциной из штамма РЕВ-1, полученной по примерам 14-16. В качестве контроля служили группы, привитые вакциной в полной дозе 2 млрд. м.к., в малой 20 млн. м.к., а также животные, которым вводили культуру бруцелл из штамма РЕВ-1 в уменьшенных дозах, соответствующих использованным при приготовлении препарата в примерах 14-16. У животных на 7, 15, 30, 60, 90 день брали кровь и исследовали в серологических реакциях (РБП, PA, PCK). Результаты представлены в таблицах 8, 9, 10.

Пример 35. Телок в возрасте 4-6 месяцев разбили на группы по 20 голов в каждой и привили противобруцеллезной вакциной из штамма 19, полученной по примерам 1-4. В качестве контроля служили группы, привитые вакциной в полной дозе 80 млрд. м.к., в малой 3 млрд. м.к., а также животные, которым вводили культуру бруцелл из штамма 19 в уменьшенных дозах, соответствующих примерам 1-4. У животных на 7, 15, 30, 60 и 90 день брали кровь и исследовали в серологических реакциях (РБП, PA, PCK). Результаты представлены в таблицах 11, 12, 13.

Таким образом, при введении живой вакцины В.abortus 19 в дозе от 100 млн. до 80 тыс. микробных клеток, живой вакцины из штамма B.melitensis Rev-1 в дозе 1 млн. до 10 тыс. микробных клеток совместно с бруцеллезным антигеном в дозе 0,005-2,0 мг/мл снижается индукция специфических бруцеллезных антител у крупного и мелкого рогатого скота, что позволяет проводить диагностические исследования и выявлять более полно инфицированных животных среди вакцинированных.

Представленные данные свидетельствуют о том, что введение антигена как одного из факторов агрессии в состав живой вакцины увеличивает остаточную вирулентность вакцинного штамма и, как следствие, уменьшает количество микробных клеток, необходимое для расселения в организме вакцинированного животного (табл. №1 и 2). В то же время параллельно с расселением и приживаемостью вакцинного штамма в организме развивается иммунный ответ на введенный антиген (который происходит быстрее, чем на живую вакцину, требующую для полноценного иммунного ответа время для расселения и приживаемости штамма), что, в свою очередь, ведет к сокращению длительности персистенции вакцинного штамма в организме и приводит к снижению серопозитивности у вакцинированных животных (табл. №3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13). Заявляемый диапазон доз антигена и вакцины при совместном их введении ведет к двоякому действию, что позволяет снизить концентрацию микробных клеток в одной профилактической дозе и одновременно уменьшить уровень специфических бруцеллезных антител у вакцинированных животных, вплоть до недиагностического, без снижения напряженности иммунитета (табл. №1, 2).

Предложенный способ апробирован с положительным результатом на лабораторных животных, 3500 овцах и на 800 головах крупного рогатого скота, работы проводили в период с 2000 по 2012 гг. на опытной базе ВИЭВа в Вышнем Волочке и в хозяйствах Туркменистана.

Данный способ снижения серопозитивности у живых противобруцеллезных вакцин может найти применение при проведении профилактической вакцинации сельскохозяйственных животных против бруцеллеза живыми вакцинами из штаммов В.abortus 19 и B.melitensis Rev-1.

Источники информации

1. Сборник научных трудов Сибирского отделения ВАСХНИЛ. - Новосибирск, 1984. - С.21-26.

2. Российский ветеринарный журнал. - М.: КолосС, 2006 г. - №4. - С.8-11.

3. Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук «Бруцеллез животных в России: эпизоотологические особенности и совершенствование специфической профилактики», Искандаров М.И. Москва, 2012 г. С.382.

4. Тезисы докладов Всесоюзной конференции «Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организации медицинской помощи больным», Новосибирск, 1989 г., с.145-146.

5. Книга «Патогенез и иммунология бруцеллеза». - М.: Медгиз, 1974 г., с.178-179.

6. А.С. СССР «Способ получения бруцеллезного антигена» №1256258, A61K 39/10, 1984 г.

7. А.С. СССР «Способ получения бруцеллезного антигена» №691056, A61K 39/10, 1974 г.

8. А.С. СССР «Способ получения антигена» №467933, A61K 39/10, 1977 г.