ШТАММ Lactobacillus rhamnosus, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ И АНТИГРИБКОВОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ ПАТОГЕННОЙ И УСЛОВНО-ПАТОГЕННОЙ ВАГИНАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ

Изобретение относится к фармакологии и медицине, в частности акушерству и гинекологии, и касается штамма Lactobacillus rhamnosus B51, влияющего на физиологические и иммунобиологические процессы в организме. Штамм может быть использован для получения препаратов для лечения репродуктивных осложнений бактериального вагиноза у женщин.

Уровень техники.

Бактериальный вагиноз (БВ) является одним из самых распространенных заболеваний у женщин репродуктивного возраста во всем мире.

Согласно Международной классификации болезней МКБ-10 (шифр N89.0) - это инфекционный невоспалительный синдром полимикробной этиологии, связанный с дисбиозом вагинального биотопа, который характеризуется количественным снижением или полным исчезновением лактобактерий, особенно перекись-продуцирующих, и резким увеличением облигатно- и факультативно анаэробных условно-патогенных микроорганизмов, таких как Gardnerella vaginalis (8-75%), Candida albicans (2-30%), Prevotella spp., Mycoplasma hominis, Mobiluncus spp. и патогенных Trichomonas vaginalis (1-34%). [Клинические рекомендации по ведению больных инфекциями, передаваемыми половым путем, и урогенитальными инфекциями. Российское общество дерматологов и косметологов, 2012. - 112 с.; Ling Z, Liu X, Luo Y. et al. Associations between Vaginal Pathogenic Community and Bacterial Vaginosis in Chinese Reproductive-Age Women. // PLoS One., 2013].

По данным Британской ассоциации Сексуального Здоровья и ВИЧ за 2012 год, ежегодно БВ переживают 300 млн женщин во всем мире [Powell K. Bacterial vaginosis: risks and treatment. // Br J Nurs., 2013].

Бактериальный вагиноз выявляют преимущественно у женщин в репродуктивном возрасте. Заболевание не представляет непосредственной опасности для жизни женщины, однако является фактором риска развития осложнений беременности (хориоамниотит, преждевременное излитие околоплодных вод, преждевременные роды) и воспалительных заболеваний малого таза после оперативных вмешательств и инвазивных диагностических процедур.

Суть лечения бактериального вагиноза заключается в устранении не только симптоматических проявлений, но и причин развития отклонения. С этой целью назначаются оральные и интравагинальные медикаментозные препараты, иммуностимуляторы, препараты на основе лактобактерий [Jackie Sherrard, Gilbert Donders, David White. European (IUSTI/WHO) Guideline on the Management of Vaginal Discharge, 2011]

Клинические исследования, проведенные Лоусонским научно-исследовательским институтом здравоохранения (Lawson Health Research Institute) в Онтарио и Канадским центром по исследованию и разработке пробиотиков (Canadian Research and Development Centre for Probiotics), выявили, что пероральное введение L.acidophilus, L.rhamnosus GR-1 и L.fermentum RC-14 в течение 2 месяцев позволило восстановить нормальное состояние вагинальной микрофлоры. Эффект был обусловлен способностью указанных штаммов восстанавливать и поддерживать естественную кислую среду во влагалище и обеспечивать колонизационную резистентность, путем продукции биосурфактантов, подавляющих адгезию вагинальных и уропатогенных микроорганизмов [Falagas M., Betsi G.I., Athanasiou S. Probiotics for the treatment of women with bacterial vaginosis. // Clin Microbiol Infect., 2007].

Разработаны композиции для физиологического восстановления микрофлоры на основе лактобацилл [Патент США №20130171253, 2013 г.; Европейский патент № EP 2428214, 2012 г.; Международный патент № WO 2012035028, 2012 г.]. При этом наиболее часто используемыми в терапии нарушений вагинально микрофлоры являются штаммы L.acidophilus и Lactobacillus spp. [Европейский патент № EP 2128243, 2009 г., Европейский патент № EP 1512408, 2005 г.].

В настоящее время в России наиболее широко применяются препараты на основе L.acidophilus, L.fermentum и L.plantarum. Изначально эти препараты были предложены для лечения дисбактериоза кишечника, однако, в дальнейшем их стали использовать в гинекологии. [Патент РФ №2188660, 2002 г., Патент РФ №2183963, 2002 г.].

На данный момент в государственный реестр лекарственных средств РФ внесены препараты в форме суппозиториев вагинальных для лечения бактериального вагиноза: «Ацилакт» - на основе штаммов Lactobacillus acidophilus 100 AIII, KIII24 и NK1; «Лактобактерин» - на основе комбинации Lactobacillus plantarum 8 Р-АЗ, Lactobacillus fermentum 90TC-4, Lactobacillus acidophilus 38, Lactobacillus acidophilus 10 и Lactobacillus casei Сб.

Однако наиболее часто встречающимися видами лактобактерий во влагалище здоровых женщин репродуктивного возраста являются: Lactobacillus jensenii, L.crispatus, L.iners, L.gasseri и L.rhamnosus, которые обусловливают основные биологические эффекты с точки зрения поддержания гомеостаза биоценоза влагалища [McLean NW, Rosenstein IJ. Characterisation and selection of a Lactobacillus species to re-colonise the vagina of women with recurrent bacterial vaginosis. // J Med Microbiol., 2000].

В связи с этим, актуальным, эффективным и безопасным подходом к лечению бактериального вагиноза является использование препаратов на основе индигенных для биоценоза влагалища видов лактобактерий с выраженными пробиотическими свойствами.

В настоящее время известно, что различные штаммы L.rhamnosus участвуют в создании и поддержании гомеостаза вагинальной микрофлоры путем продукции бактериоцинов, обеспечения колонизационной резистентности и оказания иммуномодулирующего эффекта. [Barrons R, Tassone D. Use of Lactobacillus probiotics for bacterial genitourinary infections in women: a review. // Clin Ther., 2008; Parma M, Dindelli M, Caputo L. et al. The role of vaginal Lactobacillus Rhamnosus (Normogin®) in preventing Bacterial Vaginosis in women with history of recurrences, undergoing surgical menopause: a prospective pilot study // Eur Rev Med Pharmacol Sci., 2013].

Принципиальной характеристикой данного вида лактобактерий является наличие генов системы токсин-антитоксин, что обусловливает высокую устойчивость микроорганизмов к стрессовым факторам окружающей среды. [K.M. Klimina, D.K. Kjasova, E.U. Poluektova et al. Identification and characterization of toxin-antitoxin systems in strains of Lactobacillus rhamnosus isolated from humans // Anaerobe, 2012].

Ближайшим аналогом изобретения являются вагинальные таблетки «Normogin®» (Baldacci Laboratories, Италия) на основе Lactobacillus rhamnosus BMX 54 широкого спектра действия и препарат Вагилак (Jadran Galenski Laboratorij (Республика Хорватия) на основе бактерий Lactobacillus reuteri RC-14 и Lactobacillus rhamnosus GR-1, предназначенный для комбинированной терапии гинекологических заболеваний, которые сопровождаются нарушением микрофлоры влагалища [MacPhee RA, Hummelen R, Bisanz JE et al. Probiotic strategies for the treatment and prevention of bacterial vaginosis. // Expert Opin Pharmacother, 2010].

Последний, благодаря выраженной иммуномодулирующей активности Lactobacillus rhamnosus GR-1, рекомендуется для терапии инфекционных осложнений беременности и профилактики преждевременных родов, поскольку доказана способность этого штамма, а также бактерий вида L.rhamnosus стимулировать продукцию противовоспалительных цитокинов IL-4 и IL-10 и снижать синтез провоспалительного цитокина - TNF-α и простагландинов PGDH, PGHS-2 и G-CSF [Bloise E., Torricelli R., Novembri L.E. et al. Heat-killed Lactobacillus rhamnosus GG Modulates Urocortin and Cytokine Release in Primary Trophoblast Cells // Placenta, 2010; Yeganegi, M., Watson, C.S., Martins, A. et al. Effect of Lactobacillus rhamnosus GR-1 supernatant and fetal sex on lipopolysaccharide-induced cytokine and prostaglandin-regulating enzymes in human placental trophoblast cells: implications for treatment of bacterial vaginosis and prevention ofpreterm labor. // Am. J. Obstet. Gynecol., 2009]

Важно отметить, что видовой состав лактобактерий, как ключевых представителей нормальной микрофлоры влагалища, имеет существенные популяционные отличия, что было показано в исследованиях по идентификации штаммов Lactobacillus, присутствующих в вагинальных выделениях здоровых и больных бактериальным вагинозом мексиканских женщин [Martínez-Peña MD, Castro-Escarpulli G, Aguilera-Arreola MG. Lactobacillus species isolated from vaginal secretions of healthy and bacterial vaginosis-intermediate Mexican women: a prospective study. // BMC Infect Dis., 2013] и женщин, проживающих в Индии и США. [Madhivanan P., Rumphs A., Ravi K. et al. Characterization of Vaginal Lactobacillus Among Non-Pregnant Women with and Without Bacterial Vaginosis in India and US. // Transmitted Infections, 2013].

Кроме того, в структуре биоценоза при дисбиотических нарушениях, на фоне патологических состояний и терапии с использованием препаратов на основе живых лактобактерий также возможны изменения видового состава и формирование лактобациллярной флоры, не соответствующей по активности состоянию нормы репродуктивного возраста.

В связи с этим, необходимо разработать новые препараты для лечения бактериального вагиноза и его репродуктивных осложнений на основе российских штаммов L.rhamnosus, адаптированных для российской популяции, и с учетом происхождения штамма (выделенный из влагалища).

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является получение штамма Lactobacillus rhamnosus, обладающего антагонистической активностью по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре и фенотипически апатогенного, т.е. не обладающего гемолитической, протеолитической, летициназной, гиалуронидазной, антилизоцимной, ДНК-ной и РНК-ной активностью, со средним показателем адгезии 2,2.

Принципиальным является характеристика пробиотических свойств выбранного штамма Lactobacillus rhamnosus в связи с известными существенными межштаммовыми различиями в пробиотической активности лактобактерий одного вида.

Штамм Lactobacillus rhamnosus B51 выделен в марте 2009 г. из влагалища здоровой женщины возрасте 38 лет г. Твери, которая на момент обследования была клинически здорова, не имела в анамнезе инфекционных и соматических заболеваний желудочно-кишечного тракта и других систем органов.

Штамм депонирован в ВКПМ, коллекционный номер В-11816 от 21.10.2013 г. Заявляемый штамм может быть использован при производстве лекарственных препаратов в виде свечей, пероральных средств, а также кремов, гелей и других аналогичных средств для лечения бактериального вагиноза и его осложнений.

Штамм L.rhamnosus B51 отобран и охарактеризован в соответствии с требованиями по биобезопасности, которые приведены в Фармакопейной статье «Пробиотики для медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Государственный стандарт качества лекарственных средств), опубликованной 19.09.2013 г. на официальном сайте Министерства здравоохранения РФ (https://www.rosminzdrav.ru/docs/mzsr/regulation/81)

Культурально-морфологические особенности штамма:

Морфологические и тинкториальные свойства: грамположительные палочки короткие и длинные с закругленными концами, некоторые расположены в цепочку.

Выросшие колонии имели следующие культуральные свойства: колонии S-формы 1-2 мм, выпуклые, гладкие, светло-желтого или белого цвета с ровными краями.

Способ, условия и состав сред для размножения штамма.

Штамм культивировали на жидкой и агаризованной средах MRS (Himedia). Культивирование осуществляли как в анаэробных условиях с использованием анаэростата и системы GasPak+, так и в аэробном режиме. Температура инкубации 37°C.

Ферментацию проводили как в анаэробных, так и в аэробных условиях на MRS-бульоне (Himedia) при 37°C.

Продукты, синтезируемые штаммом:

Антибиотикоподобные вещества (бактериоцины, микроцины), в том числе: карнобактериоцин-B2, энтероцин A; белки системы токсин-антитоксин YoeB- yefM; серин/треониновые протеинкиназы PrkC, адгезионный экзопротеин, адгезионный белок к коллагену; органические кислоты.

Активность (продуктивность) штамма:

На MRS-бульоне и ферментационных средах продуктивность штамма составляет 10⁸-10⁹ кл/мл

Активность штамма определяли по антагонистическому действию на бактериальные и дрожжевые тест-культуры. Изучение антагонизма проводили методом перпендикулярных штрихов (Блинкова Л.П., 1997, 2003). Чувствительность к продукции бактериоцинов выявляли методом агаровых слоев или методом отсроченного антагонизма на бактериальных тест-штаммах: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Shigella sonnei I фазы 941, Bacillus subtillis 534, Escherichia coli 25922, Klebsiella pneumoniae K₁ 5054, C.albicans ATCC 885-653. (Блинкова Л.П., 1986). Зона угнетения роста тест-штаммов должна быть не менее 20 мм.

Устойчивость (чувствительность) к антибиотикам, фагам и т.д.:

Штамм устойчив к бензилпенициллину, ванкомицину, ципрофлоксацину, левофлоксацину, левомицетину, фурадонину, промежуточно устойчив к эритромицину, к остальным антибиотикам, используемым в данном исследовании штамм чувствителен (ампициллин, гентамицин, стрептомицин, тетрациклин, доксициклин, рифампицин, меропенем, линезолид). Устойчивость не связана с генами, расположенными на мобильных генетических элементах.

Иммуномодулирующая активность:

Осуществлялась методом ПЦР с детекцией результатов в режиме «реального времени» путем анализа экспрессии генов про- и противовоспалительных цитокинов: IL-8, IL-10, TNF-α. Выявлена способность штамма индуцировать экспрессию гена противовоспалительного цитокина IL-10.

Таким образом, способность штамма Lactobacillus rhamnosus B51 наращивать биомассу в различных питательных средах, кислотообразующая активность, антагонистическая активность по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре, выраженная иммуномодулирующая активность, а также другие полезные для организма человека свойства, характерные для вида Lactobacillus rhamnosus, делают возможным использование штамма в составе различных препаратов для лечения вагинозов.

Примеры определения пробиотических свойств штамма L.rhamnosus B51 по настоящему изобретению.

Пример 1.

Секвенирование последовательности ДНК генома L.rhamnosus B51.

Проведено полногеномное секвенирование ДНК штамма L.rhamnosus B51 на секвенаторе GS Junior («Roche»). Результаты проведенного биоинформатического анализа показали:

Размер генома - 2,953,049 пн; G+C состав - 46,6%; Количество генов - 2,970

Количество rRNA оперонов - 5; Количество tRNAs - 58; Тандемные повторы - 130.

Установлено наличие пробиотических генов, в том числе:

а) обусловливающих устойчивость к стрессорным воздействиям и антигенную активность штамма (dltD - d-аланилирование ЛТА; rfbX - белок-экспортер полисахарида, о-антигена и тейхоевых кислот; yceI yttB oxlT mdr - пермеазы главного суперсемейства MFS1; гены Emr/QacA семейства белков, yxeA - транспортер антимикробных белков);

б) обусловливающих гидролазную активность (mleP - малат пермеаза; galK, gale, galT, galR, galM - цикл Лелуара; lacC, lacD, lacB, lacA, lacR, lacE, lacT, lacF, lacG - тагатоза-6-фосфатный путь утилизации лактозы; malE, malF, malG, malK - утилизация мальтозы; sorE, sorR, sorF, sorA, sorB, sorC, sorD, sorG - утилизация сорбозы; rbsR, rbsD, rbsA, rbsC, rbsB, rbsK - утилизация рибозы);

в) обусловливающие взаимодействие микроорганизма с эпителиальными клетками человека (luxS - активированный метальный цикл; srtC2 - сортаза; spaD - специфический белок пилей, главный опорный белок; spaE - специфический белок пилей, минорный опорный белок; spaF - специфический белок пилей, вовлеченный в процесс адгезии; mabA - модуляция адгезии и образования биопленок; wzb - адгезия и биосинтез полисахарида).

Проведено депонирование геномного сиквенса в NCBI:

SubmissionID: SUB359186;

BioProject ID: PRJNA222883;

Organism name/label: Lactobacillus rhamnosus 51В

Title: Lactobacillus rhamnosus 51В Genome sequencing

Locus_tag prefix: LR51B

Пример 2.

Полиморфизм пробиотических генов L.rhamnosus B51.

Проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей выявленных пробиотических генов штамма L.rhamnosus B51 с последовательностями аналогичных генов секвенированных и аннотированных штаммов L.rhamnosus GG, Lc705, ATCC8530, LOC900, LOC908.

Полученные результаты представлены в таблице 1. Жирным шрифтом обозначены гены с единичными заменами, курсивом - те, где больше 3-х замен.

При анализе для штамма L.rhamnosus B51 были выявлены полиморфизмы по всем пробиотическим генам. Со всеми штаммами L.rhamnosus выявлены полиморфизмы по следующим генам:

wzr1 - ген из кластера генов синтеза полисахаридов,

acm - ген лизоцима,

npk3 - ген оперона синтеза бактериоцинов.

Пример 3.

Выявление уникальных генов у штамма L.rhamnosus B51.

При анализе данных штамма Lactobacillus rhamnosus B51 были обнаружены уникальные гены при сравнении с 11 аннотированными геномами штаммов L.rhamnosus из GenBank. Среди них особый интерес представляют АТФ-зависимая казеинолитеская протеаза, сайт-специфическая ДНК-метилтрансфераза и транскрипционный регулятор белков семейства XRE (ксенобиотик чувствительных элементов).

Пример 4.

Определение адгезивных свойств штамма L.rhamnosus B51.

Адгезивность штамма L.rhamnosus B51 определяли на 100% конфлюентной культуре клеток HeLa в среде DMEM/10% FBS.

Клеточную культуру HeLa культивировали в 24-лучночных планшетах на среде DMEM с добавлением 10% фетальной коровьей сыворотки и антибиотиков (пенициллин и стрептомицин) до достижения 100% конфлюентности. Клетки промывали дважды раствором DPBS и помещали в среду DMEM без добавления антибиотиков и сыворотки.

Культуры лактобацилл выращивали в среде MRS при 37 C в течение 18 часов до достижения оптической плотности OD₆₀₀ 4-5. Культуры выравнивали по концентрации клеток и добавляли в планшет с клетками HeLa в количестве 2×10⁸ на одну лунку. Совместную инкубацию проводили при 37 C в течение 1 часа. После этого среду из лунок удаляли и проводили отмывку 4 раза по 0.5 мл DPBS.

Полученные препараты фиксировали раствором 3% параформальдегида в PBS и выдерживали 20 часов при +4 C. Далее проводили фиксацию охлажденным до -20 C метанолом в течение 1 часа. Фиксированные культуры окрашивали по Граму в соответствии со стандартной процедурой.

Планшеты микроскопировали и проводили подсчет числа бактерий прикрепленных к одной клетке - индекс адгезивности (не менее 10 клеток на лунку). Эксперимент с каждым штаммом повторяли трижды. Полученные результаты представлены в таблице 2. В таблице указана степень адгезивности (среднее число лактобацилл, прикрепленных к одной клетке).

Пример 5.

Определение антагонистической активности штамма L.rhamnosus В51 в отношении индикаторных штаммов условно-патогенных бактерий.

Антагонистическую активность штамма L.rhamnosus B51 определяли методом отсроченного антагонизма в агаровых слоях с использованием бляшек изучаемых культур на среде МРС и индикаторных штаммов в слое среды Columbia.

Определение антагонистической активности лактобацилл проводили по отношению к клиническим изолятам условно-патогенных микроорганизмов: Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Bacteroides fragilis, Gardnerella vaginalis, Candida albicans. Для выращивания лактобацилл использовали - MRS-агар (HiMedia, Индия), для роста индикаторных микроорганизмов - полужидкий (0,5%) Columbia агар (HiMedia, Индия).

Антагонистическую активность определяли при помощи метода отсроченного антагонизма в агаре по Р.Muriana и Т.Klaenhammer (1987) в модификации. Для этого на поверхность плотной питательной среды MRS-агар бактериологической петлей бляшками с диаметром 15 мм засевали 24 часовые культуры лактобактерий и культивировали 24 часа при 37°C в анаэробных условиях.

После культивирования круглым металлическим пробойником с диаметром 16 мм удаляли фрагмент агара с выросшими бактериями. Затем на подготовленные таким образом чашки наносили 5,5 мл расплавленной и остуженной до 50°C полужидкой (0,5% агара) среды Columbia agar, в которую предварительно вносили 0,1 мл суточной культуры индикаторного штамма.

После 18-часовой инкубации при 37°C в анаэробных условиях для Streptococcus agalactia, Bacteroides fragilis, Gardnerella vaginalis и в аэробных условиях для Staphylococcus aureus и Candida albicans измеряли величину зон задержки роста от края удаленной бляшки до края роста индикаторных штаммов.

Исследования по определению антагонистической активности по отношению к индикаторным штаммам микроорганизмов повторяли три раза. Из полученных данных вычисляли среднюю величину. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Пример 6.

Иммуномодулирующая активность L.rhamnosus B51.

Сравнительная характеристика иммуномодулирующей активности штаммов L.rhamnosus B51 и L.rhamnosus GR-1 осуществлялась методом ПЦР с детекцией результатов в режиме «реального времени» путем анализа экспрессии генов про- и противовоспалительных цитокинов: IL-8, IL-10, TNF-α. Исследование проведено с использованием адгезионной линии клеток эпителия кишечника (аденокарциномы толстой кишки человека НТ-29) в условиях предварительной индукции ЛПС в концентрации 20 нг/мл и без нее.

Установлено, что коинкубация клеток с суспензией живых бактерий L.rhamnosus B51 (1:10) приводит к активации синтеза мРНК IL-10 через 24 часа после начала эксперимента. Аналогичный эффект в присутствии бактерий L.rhamnosus GR-1 наблюдается через 4 часа и сохраняется на высоком уровне в течение всего эксперимента.

Коинкубация с указанными штаммами клеток, индуцированными ЛПС, не приводит к активации экспрессии гена IL-10 - уровень соответствует контролю.

Не выявлено влияние живых бактерий L.rhamnosus B51 и L.rhamnosus GR-1 на продукцию IL-8 и TNF-α как в индуцированных, так и неиндуцированных ЛПС клетках, на всем протяжении эксперимента.