Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ ГРИБА Eremothecium ashbyi - ПРОДУЦЕНТ ЭФИРНОГО МАСЛА С ЗАПАХОМ СВЕЖИХ ЦВЕТКОВ РОЗЫ

Изобретение относится к биотехнологии, прикладной микробиологии и может быть использовано для применения в качестве продуцента эфирного масла.

Целью изобретения является получение нового штамма гриба Eremothecium ashbyi Guill. 503-ssa-II (регистрационный номер ВКМ F-4565D), синтезирующего эфирное масло с запахом свежих цветков розы. Штамм Eremothecium ashbyi Guill. 503-ssa-II является мутантом, селекционированным в лаборатории Пензенского государственного университета из популяции штамма Eremothecium ashbyi ВКПМ F-36 (NRRL Υ-1363), полученного из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов.

Изобретение относится к биологически чистой культуре штамма гриба Eremothecium ashbyi Guill. 503-ssa-II, которая может быть использована в качестве продуцента эфирного масла с запахом свежих цветков розы.

В настоящее время известны технологии получения индивидуальных душистых веществ с использованием микроорганизмов, способных как продуцировать их de novo, так и биоконвертировать из дополнительно введенных в питательную среду компонентов [1, 2]. За рубежом в производственных условиях осуществляются биотехнологии 4-декалактона с персиковым запахом (BASF), ванилина (Evolva), макроциклических компонентов мускуса (Nippon Mining Co., Quest International) [3. 4]. Однако производство смеси душистых соединений, в частности, с запахом свежих цветков розы не реализовано. Проведенные в 90-е годы прошлого века исследования Бугорского П.С., Семеновой Е.Ф. показали возможность получения ароматического продукта с запахом розы на основе штаммов Eremothecium ashbyi Guilliermond 1935 и Ε. gossypii Kurtzman 1995 [6, 7].

Предлагаемый штамм гриба Eremothecium ashbyi Guill. 503-ssa-II новый, в научной и патентной литературе не описан. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому положительному эффекту являются штамм гриба Eremothecium gossypii В KM F-3276 - продуцент эфирного масла (Авт.св. СССР 1794948) [9]. Однако по сравнению с прототипом при одинаковых условиях культивирования и выделения (экстракция гексаном) предлагаемый штамм отличается составом эфирного масла (см. таблицу), в составе которого доминируют монотерпеновые спирты, которые обеспечивают запах свежих цветков розы [10].

Идентификацию штамма проводили по основным культурально-морфологическим признакам, физиолого-биохимическим свойствам согласно Определителю Kurtzman′a [11].

Для проверки чистоты культур был произведен посев коллекционного образца на агар Сабуро и инкубация его в течение 120 ч.

Морфология. Микроорганизм образует на твердой агаризованной среде кремовые плоские колонии, которые позднее приобретают оранжевое окрашивание и радиальную складчатость. Форма колоний округлая с правильным мелкопаутинистым краем, диаметр составляет через 120 ч роста при 29°C на рисовом агаре - 3…4 мм, на агаре Сабуро - 5…9 мм, на картофельно-глюкозном агаре - 6…10 мм. Микроорганизм имеет дихотомически ветвящийся септированный мицелий, состоящий из многоядерных клеток (диаметр гиф - 2,1…17,5 мкм); спорангии продолговатые многоспоровые, конидии веретеновидные; размеры аскоспор 2,3…2,8×19,4…26,6 мкм.

Физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Оптимальная температура роста 25-28°C. Оптимум pH лежит в диапазоне 5,5…6,5. В качестве источников углерода и энергии использует глюкозу, сахарозу, не усваивает целлюлозу. Штамм синтезирует эфирное масло, которое обладает запахом, схожим со свежими цветками розы, и содержит гераниол (43,8-46,9%), цитронеллол (5,6-9,4%), нерол (1,4-1,5%), нераль (0,0-0,3%), ФЭС (0,6-10,8%). Селекционированный штамм Е. ashbyi отличается компонентным составом синтезируемого ароматического продукта от исходного штамма и прототипа (см. таблицу).

Условия хранения штамма.

Методы хранения: в пробирках на твердой скошенной агаризованной среде до 1 месяца при температуре 24°C, до 3 месяцев при температуре 5°C, до 5 лет под вазелиновым маслом.

Среды хранения: агар Сабуро (г/л: глюкоза - 40,0; пептон - 10,0; агар-агар - 18,0-20,0); глюкозо-пептонный агар с дрожжевым экстрактом (г/л: глюкоза - 10,0-30,0; пептон - 2,0-10,0; дрожжевой экстракт - 0,5-3,0; агар-агар - 18,0-20,0); мальт-пептонный агар (г/л: мальт-экстракт - 15,0-30,0; пептон - 1,0-4,0; агар-агар - 18,0-20,0); мальт-агар (г/л: солодовое сусло (3,5°Б) - 1,0 л; агар-агар - 18,0-20,0); картофельно-глюкозный агар (г/л: картофель - 200,0; глюкоза - 1,0-10,0; агар-агар - 18,0-20,0); соево-сахарозный агар (г/л: сахароза - 10,0-30,0; соевая мука - 10,0-40,0; агар-агар - 18,0-20,0).

Среды культивирования:

Твердые: агар Сабуро (г/л: глюкоза - 40,0; пептон - 10,0; агар-агар -18,0-20,0); глюкозо-пептонный агар с дрожжевым экстрактом (г/л: глюкоза - 10,0-30,0; пептон - 2,0-10,0; дрожжевой экстракт - 0,5-3,0; гидроортофосфат калия - 0,0-0,5; агар-агар - 18,0-20,0); мальт-пептонный агар (г/л: мальт-экстракт - 15,0-30,0; пептон - 1,0-4,0; агар-агар - 18,0-20,0); мальт-агар (г/л: солодовое сусло (3,5°Б) - 1,0 л; агар-агар - 18,0-20,0); картофельно-глюкозный агар (г/л: картофель - 200,0; глюкоза - 1,0-10,0; агар-агар - 18,0-20,0); соево-сахарозный агар (г/л: сахароза - 10,0-30,0; соевая мука - 10,0-40,0; агар-агар - 18,0-20,0); рисовый агар (г/л: обезвоженные рисовые хлопья - 20,0; глюкоза - 10,0-20,0; агар-агар - 15,0-20,0);

Жидкие: соево-сахарозная (г/л: соевая мука - 10,0-30,0, сахароза - 10,0-35,0); солодовый бульон с дрожжевым экстрактом (г/л: экстракт солода - 5,0-15,0, мальтоза - 5,0-10,0, дрожжевой экстракт - 0,5-2,0, глюкоза - 7,5-15,0, пептон - 3,0-10,0, гидроортофосфат калия - 0,0-0,5); глюкозо-пептонная (г/л: глюкоза - 7,5-15,0, пептон - 2,0-10,0, натрия сукцинат - 1,0-2,5, калия гидроортофосфат - 0,0-1,0, инозит - 0,0-0,5).

Температура и время культивирования: 25-28°C, 7 суток.

Частота пересевов: 12 раз в год при хранении при температуре 24°C, 4 раза в год при температуре 5°C, до 5 лет под вазелиновым маслом.

Использование штамма иллюстрируется следующим примерами.

Пример 1. Штамм выращивали в течение 6 суток при 28°C в пробирках на скошенной агаризованной среде следующего состава, г/л: глюкоза - 10,0, пептон - 3,0, дрожжевой экстракт - 0,5, гидроортофосфат калия - 0,5, агар-агар - 20,0, вода дистиллированная до 1 л. Для образования и накопления эфирного масла вносили клеточную суспензию в изотоническом растворе, соответствующую стандарту мутности 2, в количестве 1% в колбы с жидкой питательной средой следующего состава, г/л: экстракт солода - 6,0, мальтоза - 6,0, дрожжевой экстракт - 1,2, глюкоза - 13,5, пептон - 4,0, гидроортофосфат калия - 0,5, вода дистиллированная до 1 л. Инкубирование осуществляли при 28°C на качалке (150 об/мин) в течение 120 ч. Эфирное масло экстрагировали гексаном. Количество ароматического продукта составило 181,1 мг/л. Состав ароматоообразующих соединений, мас.%: гераниол 43,75, цитронеллол 5,61, нерол 1,42, нераль 0,27, β-фенилэтанол 0,57; массовая доля стеароптенов - 46,88%.

Пример 2. Штамм выращивали в течение 6 суток при 28°C в пробирках на скошенной агаризованной среде следующего состава, г/л: глюкоза - 10,0, пептон - 3,0, дрожжевой экстракт - 0,5, гидроортофосфат калия - 0,5, агар-агар - 20,0, вода дистиллированная до 1 л. Культуру использовали для получения инокулята. Засев проводили в жидкую питательную среду следующего состава, г/л: глюкоза - 7,5, пептон - 4,0, гидроортофосфат калия - 0,5, натрия сукцинат - 2,0, инозит - 0,14, вода дистиллированная до 1 л. Культивировали при 28°C 24 ч на качалке (180 об/мин). Для образования и накопления эфирного масла инокулят в количестве 10% вносили в колбы с жидкой питательной средой следующего состава, г/л: соевая мука - 20,0, сахароза - 20,0, вода дистиллированная до 1 л. Инкубирование осуществляли при 28°C на качалке (220 об/мин) в течение 59 ч. Эфирное масло экстрагировали гексаном. Количество ароматического продукта достигло 172,0 мг/л. Состав ароматообразующих соединений, мас.%: гераниол 56,85, цитронеллол 9,36, нерол 1,5, β-фенилэтанол 14,75; массовая доля стеароптенов - 17,54%.

Пример 3. Штамм выращивали в течение 7 дней при 28°C в пробирках на скошенном картофельно-глюкозном агаре. Культуру использовали для получения инокулята. Засев проводили в жидкую питательную среду следующего состава, г/л: глюкоза - 10,0, пептон - 3,0, дрожжевой экстракт - 0,5, натрия сукцинат - 1,5, калия гидроортофосфат - 0,5, инозит - 0,14, вода дистиллированная до 1 л. Культивировали при 28°C в течение 48 ч на качалке (220 об/мин). Для образования и накопления эфирного масла инокулят в количестве 5% вносили в ферментер (на 15 л) с жидкой питательной средой следующего состава, г/л: соевая мука - 20,0, сахароза - 20,0, вода дистиллированная до 1 л. Культивирование осуществляли в течение 64 ч при 28°C, 600 об/мин, аэрации 500 л/ч. Эфирное масло экстрагировали гексаном. Количество ароматического продукта достигло 362,7 мг/л. Состав ароматообразующих соединений, мас.%: гераниол 68,38, цитронеллол 8,31, нерол 2,86, β-фенилэтанол 20,44.

Список литературы

1. Krings U. Biotechnological production of flavours and fragrances / U. Krings, R.G. Berger // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1998. - V. 49. - P. 1-8.

2. Biotechnological production of bioflavors and functional sugars/ J.L. Bicas, J. C. Silva, A. P. Dionisio, G. M. Pastore // Ciencia e Technologia de Alimentos. - 2010. - V. 30, №1. - P. 7-18.

3. Production of flavours by microorganisms / L. Janssens, H.L. De Pooter, N.M. Schamp, E.J. Vandamme // Process Biochemistry. - 1992. - V. 27. - P. 195-215.

4. Bomgardner Μ. M. The sweet smell of microbes / Μ.M. Bomgardner // Chemical & Engineering News. - 2012. - V. 90, №29. - P. 25-29.

5. Егорова H.A. Некоторые итоги и перспективы биотехнологических исследований эфиромасличных растений / Н.А. Егорова, И.В. Ставцева // Эфиромасличные растения и лекарственные растения. Научные труды Института эфиромасличных и лекарственных растений Украинской академии аграрных наук. - 2006. - Выпуск 26. - С. 19-26.

6. Авт.св. СССР 1454845. Штамм гриба Eremothecium ashbyi - продуцент эфирного масла / Семенова Е.Ф., Родов B.C., Бугорский П.С. (СССР) Заявл. 28.07.1987 (заявка №4291537 с датой приоритета изобретения 28.07.1987 г. ). Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР 01.10.1988 г. Опубл. 30.01.1989, БИ №4.

7. Авт.св. СССР 1794948. Штамм гриба Ashbya gossypii - продуцент эфирного масла / Семенова Е.Ф., Бугорский П.С., Радзимовская С.Б. (СССР). Заявл. 23.08.1990 (заявка №4862283 с датой приоритета изобретения 23.08.1990 г. ). Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР 08.10.1992 г. Опубл. 15.02.1993, БИ №6.

8. Авт.св СССР 1421765. Способ получения смеси душистых веществ, обладающей запахом розы / Бугорский П.С., Семенова Е.Ф., Родов B.C., Миронов В.А. (СССР) Заявл. 22.05.1987 (заявка №4246910 с датой приоритета изобретения 22.05.1987 г. ). Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР 08.05.1988 г. Опубл. 07.09.1988, БИ №33.

9. Авт.св. СССР 1698276. Способ получения ароматического продукта с запахом розы / Семенова Е.Ф., Бугорский П.С. (СССР). Заявл. 20.07.1988 (заявка №4600171 с датой приоритета изобретения 20.07.1988 г.). Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР 15.08.1991 г. Опубл. 15.12.1991, БИ №46.

10. Содержание терпеновых спиртов в розовом эфирном масле / К.Г. Персидская, В.И. Тютюнник, Л.Н. Лупачева, В.Н. Мельников // Τ руды. Новые сорта эфироносов, технологии их возделывания переработки. - 1986. - Том XVII. - С. 199-202.

11. The yeast, a taxonomic study. Ed. by Kurtzman C.P., Fell J. W. Fourth Edition. - Elsevier Science, 1998. - 1055 p.