Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАЗВИТИЯ СТЕНОЗИРОВАНИЯ СТЕНТОВ

Изобретение относится к медицине, в частности к кардиологии, и может применяться для прогнозирования возникновения рестеноза стентов, в том числе, покрытых лекарственным веществом.

В литературе рассматриваются различные маркеры, являющиеся показателями возможного развития рестеноза стента, такие как С-реактивный белок, фибриноген (Duk-Woo Park, Sung-Cheol Yun, et al. C-Reactive Pritein and the Risk of Stent Thrombosis and Cardiovascular Events After Drug-Eluting Stent Implantation. Circulation. 2009; 120; 1987-1995), BNP (мозговой натрий-уретический пептид, Eriko Hasumi, Hiroshi Iwata, et al. Change in Levels Of B-Type Natriuretic Peptide (BNP) During Follow up Predicts in Stent Restenosis After Drug-Eluting Stent (DES) Implantation. Circulation. 2010; 122:A17669), а также эозинофильный катионный белок.

Недостатками данных способов являются чрезвычайно низкая чувствительность и специфичность. Повышение уровня С-реактивного белка ассоциировано с возникновением позднего тромбоза стента, а не с развитием рестеноза, по данным метаанализа, проведенного в 2009 г., в который вошли 2651 больных. Уровень фибриногена, также как и определение количества лейкоцитов не являются специфическими, т.е. характерными только для рестеноза показателями. Повышение уровня BNP также может быть независимым предиктором возникновения рестеноза, в то же время, повышенный уровень данного показателя может быть связан с сердечной недостаточностью, гипертрофией левого желудочка, миокардитом и другими заболеваниями.

Прототипом настоящего изобретения является способ диагностики развития стенозирования стентов путем определения в крови пациентов количества секретируемых эозинофилами белков и при уровне выше 11 нг/мл констатируют высокий риск развития рестеноза (Патент РФ №2466403, МПК G01N 33/49, опубл. 10.11.2012 г.).

Однако уровень секретируемых эозинофилами белков не является специфическим показателем в связи с тем, что его изменение может возникнуть и в ответ на введение контрастного вещества, а также при наличии у данной группы пациентов сопутствующей патологии, такой как легочные и кожные заболевания, поливалентная аллергия, паразитарная инвазия. Также его определение достаточно неудобно в отношении временных параметров (образцы крови необходимо исследовать незамедлительно). В этом случае достаточно сложно интерпретировать результаты как связанные именно с возникновением рестеноза, а не с каким-либо из перечисленных заболеваний.

Задачей изобретения является создание эффективного способа диагностики развития стенозирования стентов, позволяющего с высокой точностью и специфичностью прогнозировать риск развития рестеноза после имплантации стентов, в том числе с лекарственным покрытием.

Техническим результатом изобретения является повышение точности и специфичности способа.

Это достигается тем, что в заявляемом способе диагностики возникновения рестеноза в ранее стентированном сегменте, включающем исследование крови пациентов, согласно изобретению определяют уровень циркулирующих CD45⁺ и при показателе, равном 0,91% и более от общего числа тромбоцитов, судят о наличии рестеноза.

Способ осуществляется следующим образом. Пациентам, которым выполнялось коронарное стентирование, в периферической крови определяют уровень циркулирующих в крови тромбоцитов, которые несут на своей поверхности антиген, характерный для лейкоцитов, например общий лейкоцитарный антиген CD45 (CD45+ тромбоциты). Для этого из локтевой вены в пробирку берут кровь, образцы крови центрифугируют, отбирают в отдельные пробирки (эппендорфы). Уровень циркулирующих CD45+ тромбоцитов в образце крови определяют методом проточной цитофлуориметрии. Количество CD45+ тромбоцитов определяют с использованием комбинации антител к CD42-PE и CD45-TC. В размерном гейте тромбоцитов выделяют клетки, которые одновременно экспрессировали CD42 и CD45 (CD45+ тромбоциты). При уровне CD45+ тромбоцитов в образце крови, равном 0,91% и более от общего числа тромбоцитов, судят о развитии рестеноза.

Возникновение рестеноза - сужение просвета сосуда в ранее стентированном сегменте (внутри стента и на 5 мм дистальнее или проксимальнее стента), уменьшающего просвет сосуда более чем на 50% по диаметру - развивается в среднем через 6-12 мес. после установки стента и представляет собой результат избыточного клеточного ответа на повреждение стенки сосуда. Возникновение рестеноза обусловлено 3 основными причинами - непосредственной эластической отдачей {elastic recoil) стенки сосуда, неблагоприятным ремоделированием сосудистой стенки в поздние сроки, миграцией гладкомышечных клеток (ГМК) в субэндотелиальный слой и их избыточной пролиферацией, а также избыточным синтезом внеклеточного матрикса, приводящим к гиперплазии неоинтимы. Развитие рестеноза сопровождается активацией клеточных элементов сосудистого русла - тромбоцитов, лейкоцитов и эндотелиальных клеток, и повышением их способности к взаимодействию друг с другом. Одно из известных последствий этих процессов - повышение содержания в кровотоке у больных с рестенозом тромбоцитарно-лейкоцитарных агрегатов.

Еще одно проявление внутрисосудистой активации клеток - высвобождение и появление в плазме крови мембранных микрочастиц (или микровезикул) субклеточного размера. Их источником могут быть тромбоциты, лейкоциты и другие клетки крови и сосудистой стенки. Такие микрочастицы содержат в своем составе белковые антигены, специфичные для поверхности образующих их клеток. Повышение концентрации в крови микрочастиц различного происхождения характерно для многих сосудистых патологий и, в том числе, для рестеноза. Тромбоциты, ассоциированные с микрочастицами лейкоцитов, могут служить эффективными переносчиками их прокоагулянтных компонентов в места повреждения сосудистой стенки. Методически такие тромбоциты возможно идентифицировать по содержанию на их поверхности характерных лейкоцитарных антигенов. Появление в кровотоке CD45+ тромбоцитов обусловлено их взаимодействием с мембранными микрочастицами, образующимися при активации лейкоцитарных микрочастиц и лейкоцитов. Тромбоциты являются клеточными элементами, которые первыми среди других клеток крови взаимодействуют со стенкой сосуда после ее повреждения. Адгезия тромбоцитов к экспрессируемому в зоне повреждения субэндотелиальному внеклеточному матриксу является начальным этапом, который запускает активацию тромбоцитов. Тромбоциты, адгезировавшиеся через экспрессированные на поверхности эндотелиальных клеток нити фактора фон Виллебранда, поддерживают прикрепление лейкоцитов. Такое межклеточное взаимодействие уменьшает скорость движения лейкоцитов вдоль поверхности стенки сосуда, позволяя им прочно адгезировать и в последствии трансмигрировать в стенку сосуда. Описанный феномен показывает участие тромбоцитов в механизме привязки лейкоцитов к активированным эндотелиальным клеткам и потенциальную связь между воспалением и атеротромбозом. Однако участие тромбоцитов в атеротромбозе не ограничивается только этим феноменом. Повышение уровня прокоагулянтных микрочастиц внутри зоны окклюзированных артерий может говорить о важной патофизиологической роли этих частиц в развитии атеротромбоза. Способность тромбоцитов переносить на своей поверхности лейкоцитарный антиген говорит о том, что участие тромбоцитов в патогенезе сосудистых поражений в некоторых случаях может заключаться в участии в межклеточном обмене специфическими белками.

Пример 1. У пациента Попова В.Г. (с развитием рестеноза) производился забор крови. Для сравнения провели два анализа: по прототипу и по заявляемому способу.

Сначала образец крови подвергался обработке согласно способу, указанному в прототипе, т.е. определялся уровень эозинофильного катионного белка. Взяли два образца крови. По стандартной схеме для работы на хемилюминесцентном анализаторе для определения данного показателя, в течение первых двух часов от момента забора крови; второй образец - через 6 часов. Уровень эозинофильного катионного белка в первом образце был равен 23 нг/мл, во втором образце - 17,6 нг/мл. Также необходимо отметить, что технически определение данного показателя подразумевает соблюдение, в том числе температурных параметров, что возможно тоже сыграло роль в наличии полученного разброса полученных результатов (17,6-23нг/мл). Следовательно, определение эозинофильного катионного белка имеет низкую точность и специфичность, по сравнению с CD45+ тромбоцитами.

Второй образец крови исследовали по заявляемому способу с определением CD45+ тромбоцитов.

Взяли два образца крови. Первый образец исследовался через 2 часа после забора крови, второй образец через 6 часов, третий образец через 2 дня, четвертый - через три дня. После работы на проточном цитофлюориметре определялись следующие уровни CD45+ тромбоцитов: 1 образец - 1,05%, 2 образец - 1,02%, 3 образец - 0,97%, 4 образец - 0,90%. Приведенные данные свидетельствуют о высокой точности, специфичности, простоте, удобстве метода, в отличие от эозинофильного катионного белка.

Данный пример демонстрирует точность, более высокую специфичность заявляемого способа.

Пример 2. В исследование было включено 37 больных с хронической ИБС, которым 6-12 мес. назад выполнялось коронарное стентирование стентами с лекарственным покрытием. По результатам ангиографического исследования пациенты были разбиты на 2 группы. В первую группу вошли 23 пациента, у которых не было выявлено возникновение рестеноза, во вторую группу - 14 больных, у которых было отмечено возникновение рестеноза, по крайней мере, в одном стенте. Пациенты в обеих группах не различались по возрасту, полу, соотношению курящих и некурящих, наличию гиперлипидемии, сахарного диабета, а также по ангиографическим характеристикам пораженных артерий. Всем пациентам, которым выполнялась контрольная коронароангиография, в крови по стандартизованной методике определялся уровень циркулирующих CD45+ тромбоцитов. При значении данного показателя 0,91% и выше у пациентов был выявлен рестеноз. В случае, если уровень данного показателя был ниже 0,91% - об отсутствии рестеноза стента. Среди пациентов, у которых уровень CD45+ тромбоцитов был выше медианы распределения (0,68%), рестеноз был выявлен в 53% случаев, в то время как у пациентов с уровнем CD45+ тромбоцитов ниже медианы распределения - в 22% случаев (р=0,045). Пациенты в этих группах достоверно не различались по общему уровню тромбоцитов и лейкоцитов крови.

Кровь пациентов или здоровых добровольцев собирали, используя в качестве антикоагулянта 3,8% цитрат натрия в соотношении антикоагулянт /кровь - 1/9. Обогащенную тромбоцитами плазму (ОТП) получали, центрифугируя кровь при 1200 об. в течение 4 мин при комнатной температуре. К 100 мкл ОТП добавляли 100 мкл 2 мМ ЭДТА в 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4), фиксировали образцы формалином (200 мкл 2% параформальдегида в фосфатном буфере) и хранили до 4 суток при 4°C. Для определения на поверхности тромбоцитов специфического для них антигена CD42 и специфического лейкоцитарного антигена CD45, экспрессируемого всеми типами лейкоцитов, использовали моноклональные антитела меченные фикоэритрином и CY5-PE (ТС) соответственно. Все антитела были производства фирмы Becton Dickinson (США). В день анализа к 5 мкл образца ОТП добавляли по 10 мкл раствора соответствующих антител и инкубировали в течение 40 минут при комнатной температуре в темноте. После окончании инкубации в пробы добавляли 500 мкл фосфатного буфера и анализировали тромбоциты в проточном цитофлуориметре FACS Calibur (Becton Dickinson).

Таким образом, определение в крови пациентов с рестенозом количества тромбоцитов, которые несут на своей поверхности лейкоцитарный антиген (CD42+/CD45+ тромбоцитов), может служить дополнительным маркером, с помощью которого можно выявлять риск развития воспалительных процессов при рестенозе.