СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЖЕЛЕЗОДЕФИЦИТНОЙ АНЕМИИ И АНЕМИИ ХРОНИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, в частности может быть использовано для дифференциальной диагностики анемии хронических заболеваний (АХЗ) и железодефицитной анемии (ЖДА) с целью выбора оптимальной тактики лечения.

Анемия хронических заболеваний является второй по распространенности после железодефицитной анемии и наблюдается у пациентов с острой и хронической активацией иммунной системы вследствие различных инфекционных и неинфекционных заболеваний (Weiss G., Goodnough L.T., 2005). Несмотря на то, что результаты исследований последних лет отечественных и зарубежных ученых позволили ответить на многие вопросы патогенеза, этиологии и диагностики АХЗ, при длительной сохранности воспалительного процесса эта анемия представляет трудности в плане дифференциальной диагностики с ЖДА (Сухачева Е.А., Киселева А.Ф., 2006). Применяемый на практике «стандартный» набор биохимических тестов, таких как определение уровня сывороточного железа (СЖ), коэффициента насыщения трансферрина железом (КНТ), определение ферритина сыворотки далеко не всегда позволяют объективно оценить степень нарушения феррокинетики и причину развития, что затрудняет назначение адекватной терапии анемии.

Известен «Способ дифференциальной диагностики железодефицитной анемии и анемии хронических заболеваний», Гребенщикова Л.Г., RU патент №2316007, МПК G01N 33/90 БИМП №3, публ. 27.01.2008. При реализации способа больному дважды определяют уровень сывороточного железа - до и через 3 часа после приема внутрь 20 мг железа с последующим вычислением его прироста относительно исходного уровня. При увеличении уровня сывороточного железа свыше 30% от исходного диагностируют ЖДА, при увеличении уровня сывороточного железа менее 30% диагностируют анемию хронических заболеваний.

Недостатком способа является длительность выполнения исследования. Способ имеет ограниченное применение.

Состояние запасов железа у здоровых людей отражает уровень сывороточного ферритина (Шевченко Н.Г. "Лабораторная диагностика нарушений обмена железа." - Клиническая лабораторная диагностика. - 1997 г. - №4. - С. 25-32). Сущность метода состоит в определении сывороточного ферритина с помощью иммуноферментного анализа.

Оценка запасов железа по уровню сывороточного ферритина не всегда является возможной, так как ферритин является острофазовым белком и при хронических воспалительных заболеваниях и обострениях повышается, что затрудняет в этих ситуациях оценку депонированного железа и выявление дефицита железа.

Известен «Способ диагностики заболеваний путем скрининга тканей, крови или жидкостей организма животных или человека на предмет обнаружения нефизиологических уровней гепсидина и его терапевтическое применение», RU патент №2359268, МПК G01N 33/53, С12Ρ 21/08. В данном изобретении описывается способ диагностики заболеваний, которые характеризуются нефизиологическим уровнем содержания белка гепсидина в организме млекопитающих, включающий получение образца ткани или жидкости от субъекта; контактирование образца с антителом или его фрагментом, который специфически связывает полипептид из средней части (аминокислоты от 20 до 50) или С-конца (аминокислоты от 65 до 84), и количественное определение уровня гепсидина с применением теста, основанного на связывании антитела и полипептида. Изобретение может быть использовано для скрининга заболеваний, характеризующихся нефизиологическим уровнем содержания белка гепсидина в организме.

Недостатком данного способа является то, что его можно использовать только в исследовательских целях и совершенно невозможно его применение в диагностических целях в клинической практике. Также вышеизложенный способ требует большой подготовительной работы и является достаточно трудоемким. Кроме того, применяемый здесь термин «гепсидин» означает прогепсидин, гепсидин или его фрагменты.

Наиболее близким, принятым за прототип, является «Способ дифференциальной диагностики анемии у беременных», RU патент №2407011, МПК G01N 33/50, опубл. 20.12.2010, Бюлл. №35. Для осуществления этой методики используют микротитровальные планшеты, покрытые поликлональными антителами, которые направлены к терминальной части молекулы прогепсидина. Эндогенный гепсидин в образцах сыворотки конкурирует с прогепсидином, связанным с антителами в наборе. После инкубации свободные конъюгаты отмываются. Интенсивность окрашивания, развившегося после добавления основного раствора, обратно пропорциональна концентрации гепсидина в образцах сыворотки (Kulaksiz H. at al. Pro-hepsidin: expressions and cell-specific localization in the liver and its regulation in hereditaly hemochromatosis, chronic renalinsufficiency, and renal anemia. GUT 2004; 53:735-743). При уровне гепсидина более 245 нг/мл определяют анемию хронических болезней у беременных, при уровне гепсидина менее 230 нг/мл определяют железодефицитную анемию.

Недостатком исследования является то, что в данном случае определяется прогепсидин, который является предшественником биоактивного гепсидина-25. В статье R. Deicher и W.H. Hort (2006) приводится мнение о том, что определение прогепсидина в сыворотке не полностью отражает уровень гепсидина (Deicher R. и Hort W.H. New insights into the regulation of iron homeostasis. Eur.J.Clin.Inv. 2006; 36: 301-308).

Задача изобретения: разработка способа дифференциальной диагностики гипохромных анемий: ЖДА и АХЗ на фоне инфекционно-воспалительных процессов путем определения уровня гепсидина-25 в сыворотке крови.

Поставленная задача достигается способом дифференциальной диагностики железодефицитной анемии и анемии хронических заболеваний, включающим исследование сыворотки крови с помощью иммуноферментного анализа. Определяют уровень гепсидина-25 и при увеличении его значения более 11,8 нг/мл диагностируют анемию хронических заболеваний, а при снижении его значения менее 4,33 нг/мл диагностируют железодефицитную анемию.

Новизна изобретения: определяют уровень гепсидина-25 в сыворотке крови и при увеличении его значения более 11,8 нг/мл диагностируют анемию хронических заболеваний, а при снижении его значения менее 4,33 нг/мл диагностируют железодефицитную анемию.

Способ позволяет эффективно дифференцировать две формы гипохромных анемий: железодефицитную анемию и анемию хронических заболеваний.

Техническим результатом изобретения является повышение точности и достоверности диагностики анемии хронических заболеваний за счет определения гепсидина-25, являющегося биоактивной частью прогепсидина.

Способ определения уровня гепсидина-25 является ценным в случаях «анемий хронических заболеваний», где оценка запасов железа путем исследования сывороточного ферритина невозможна по причине парадоксального повышения уровня ферритина.

За последние 5-10 лет существенно изменились представления о регуляции гомеостаза железа в связи с открытием и изучением новых белковых молекул, участвующих в процессах абсорбции железа энтероцитами тонкого кишечника, поступления железа в циркуляцию, его хранения и реутилизации.

Всасывание железа происходит в клетках эпителиального слоя слизистой оболочки дуоденального отдела кишечника - энтероцитах. Железо абсорбируется энтероцитами через ионный транспортер дивалентного металла 1 (ДМТ - 1). В транспорте железа из клеток участвует белок ферропортин.

Имеются публикации, что основным регулятором работы ферропортина и, следовательно, поступления железа в циркуляцию является гепсидин.

Гепсидин-25 - малый пептид. Его предшественник - препропептид (84 аминокислоты) преобразуется в прогормон прогепсидин (60 аминокислот), который протеолитически расщепляется до биоактивного гепсидина. Гепсидин-25 является 25-аминокислотным пептидом, богатым цистеином, с 4 дисульфидными мостиками, синтезируется в печени. Впервые гепсидин был выделен из мочи и описан Park и соавторами в 2001 году как антибактериальный пептид, способный повреждать мембрану бактерий. В дальнейшем этот пептид был выделен также и из плазмы. Имеются данные, что гепсидин является одним из регуляторов гомеостаза железа. При анемии воспаления увеличивается продукция гепсидина, индуцированная действием провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, TNFα, ИЛ-6). Эти цитокины способны нарушить метаболизм железа и привести к гипоферримии и повышению концентрации сывороточного ферритина. Провоспалительные цитокины снижают доступность железа для эритропоэза и вызывают состояние, обозначаемое как «функциональный дефицит железа».

Определение уровня гепсидина-25 в сыворотке крови стало возможным в лабораторной практике лишь в последние несколько лет в связи с появлением коммерческих тест-систем для иммуноферментного анализа. Однако информации по результатам определения уровня гепсидина-25 как у практически здоровых лиц, так и при различных патологических состояниях, в том числе при анемиях, в доступной нам литературе немного.

Способ осуществляется следующим образом.

У больных с подозрением на анемию хронических заболеваний или железодефицитную анемию из локтевой вены берут 5 мл крови, для получения сыворотки. Проводят центрифугирование и с помощью иммуноферментного анализа с использованием тест-систем фирмы Peninsula Laboratories, LLC (США), определяют уровень гепсидина-25 в сыворотке крови. При увеличении значения гепсидина-25 более 11,8 нг/мл диагностируют анемию хронических заболеваний, а при снижении его значения менее 4,33 нг/мл диагностируют железодефицитную анемию.

Нормальные лабораторные показатели гепсидина-25 определяли путем выборочного обследования здоровой популяции женщин. Используя закон Гаусса нормальное распределение для лабораторных показателей - это среднее значение показателей для здоровой популяции ±2 стандартных отклонения (±2SD) (Кишкун А.А., 2005).

Согласно современным представлениям в основе АХЗ лежит иммуно-опосредованный механизм: активация иммунной системы при воспалительных и инфекционных процессах индуцирует образование провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ФНО-α, γ-интерферон, ИЛ-6).

Всего предлагаемым способом обследовано 368 женщин в возрасте от 16 до 60 лет. 83 из них были практически здоровыми и составили контрольную группу, у 285 выявлен анемический синдром, из них 95 женщины страдали железодефицитной анемией (ЖДА), 190 - анемией хронических заболеваний (АХЗ). Среди женщин с АХЗ у 97 диагностирована анемия, развившаяся на фоне аутоиммунных заболеваний соединительной ткани (ревматоидный артрит), у 93 - анемия хронических заболеваний при бактериальных инфекциях (хронический тонзиллит, бактериальный эндокардит, хронический пиелонефрит). Характер анемии устанавливали на основании полученных результатов исследования показателей метаболизма железа с учетом клинических и гематологических данных.

Отличительной чертой анемии хронических заболеваний является гипоферримия. Нарушения метаболизма железа у пациентов с АХЗ характеризуются низким уровнем сывороточного железа, пониженным коэффициентом насыщения трансферрина при нормальном и даже высоком содержании сывороточного ферритина (Табл. 1).

Повышение уровня сывороточного ферритина у пациентов с анемией хронических заболеваний на фоне инфекционно-воспалительных процессов и при ревматоидном артрите происходит параллельно с повышением уровней плазменных белков острой фазы (С-реактивный белок, α1-кислый гликопротеид, неоптерин) (Табл. 2).

Это указывает на то, что сывороточный ферритин ведет себя как реактант острой фазы. Из-за повышения ферритина в качестве реактанта острой фазы при воспалительном процессе может создаваться ложное представление о нормальном или повышенном уровне ферритина у пациентов с анемическим синдромом и дефицитом железа.

Учитывая тот факт, что ферритин является белком острой фазы, его повышенный уровень в данной ситуации не характеризует запасы депонированного железа. При остром воспалительном процессе уровень сывороточного ферритина может резко повышаться в отсутствие каких-либо изменений в общих запасах железа организма. Эти факторы существенно ограничивают использование показателя сывороточного ферритина в качестве маркера дефицита железа при воспалительных процессах на фоне развившейся гипохромной анемии.

Избыток провоспалительных цитокинов ИЛ-6, ФНО-α, γ-ИФН снижает доступность железа для эритропоэза, повышая уровень гепсидина-25, что способствует формированию функционального дефицита железа при этих процессах. Гепсидин-25 способствует повышению секвестрации железа и блокированию железа в макрофагах, о чем свидетельствуют высокие цифры ферритина сыворотки. Отсутствие или снижение мобилизации железа из клеток макрофагальной системы приводит к низкому уровню железа сыворотки, железодефицитному эритропоэзу и анемии.

На Фиг. 1. представлен график содержания гепсидина-25 при ЖДА и АХЗ (∗ - достоверность различия по сравнению с группой здоровых лиц при р<0,001).

При исследовании гепсидина-25 у больных с ЖДА выявлено значительное снижение уровня гепсидина-25. Содержание гепсидина-25 в сыворотке крови больных ЖДА в среднем составило 0,46±0,03 нг/мл против 8,07±0,2 нг/мл у здоровых лиц, в то время как у больных с АХЗ уровень гепсидина-25 был значимо высоким - 39,33±0,38 нг/мл и 45,05±0,38 нг/мл у пациентов с анемией хронических заболеваний на фоне инфекционно-воспалительных процессов и при ревматоидном артрите, соответственно (р=0,000), причем повышение уровня гепсидина-25 у пациентов с АХЗ не зависело от этиологии и локализации воспалительного процесса (Фиг. 1).

Результаты наших исследований свидетельствуют о высокой диагностической эффективности теста - определение уровня гепсидина-25 в сыворотке крови для дифференциальной диагностики железодефицитной анемии и анемии хронических заболеваний.

Пример 1.

Больная Л., 46 лет, находилась на лечении в МБЛПУ ГКБ №2 с диагнозом анемия неясного генеза, ЖДА? В анамнезе mensis с 12 лет по 6-8 дней, регулярные, обильные, через 30 дней. Выкидышей и мертворождений не было. Роды - 1. Гемотрансфузий не было.

При обследовании выявлены следующие показатели: количество эритроцитов (RBC) - 4,0·10¹²/л; гемоглобин (HGB) - 107 г/л; средний объем эритроцита (MCV) - 71 фл; среднее содержание гемоглобина в эритроците (МСН) - 24,2 пг; средняя концентрация гемоглобина в эритроците (МСНС) - 34,2 г/дл; широта распределения эритроцитов по объему (RDW) - 14%; сывороточное железо (СЖ) - 7,2 мкмоль/л; общая железосвязывающая способность сыворотки крови (ОЖСС) - 73,4 мкмоль/л; латентная железосвязывающая способность (ЛЖСС) - 66,2 мкмоль/л, КНТ - 9,8%, ферритин - 8,8 нг/мл.

При исследовании сыворотки крови предложенным способом с использованием тест-систем фирмы Peninsula Laboratories, LLC (США), уровень гепсидина-25 снижен и составляет 0,25 нг/мл, то есть менее 4,33 нг/мл. В данном случае диагностируем хроническую постгеморрагическую железодефицитную анемию, обусловленную полименореей.

Пример 2.

Больная Б., 52 года, находилась на лечении в МБЛПУ ГКБ №1 с диагнозом: Ревматоидный артрит, суставная форма, II-III ст. активности, хроническое рецидивирующее течение.

При обследовании: количество эритроцитов (RBC) - 3,92·10¹²/л; гемоглобин (HGB) - 110 г/л; средний объем эритроцита (MCV) - 79 фл; среднее содержание гемоглобина в эритроците (МСН) - 28,2 пг; средняя концентрация гемоглобина в эритроците (МСНС) - 35,5 г/дл; широта распределения эритроцитов по объему (RDW) - 13,5%; сывороточное железо (СЖ) - 10,2 мкмоль/л; общая железосвязывающая способность сыворотки крови (ОЖСС) - 55 мкмоль/л; латентная железосвязывающая способность (ЛЖСС) - 44,8, мкмоль/л, КНТ - 18,5%, ферритин - 125 нг/мл.

При исследовании сыворотки крови предложенным способом с использованием тест-систем фирмы Peninsula Laboratories, LLC (США), уровень гепсидина-25 повышен до 45,5 нг/мл, при этом показатели СЖ, ОЖСС, ЛЖСС, КНТ и ферритина соответствуют норме. Так как уровень гепсидина-25 более 11,8 нг/мл, в данном случае диагностируем анемию хронических заболеваний, обусловленную ревматоидным артритом с хроническим рецидивирующим течением.

Пример 3.

Больная К., 56 лет, находилась на лечении в МБЛПУ ГКБ №2 с диагнозом: Хронический пиелонефрит, прогрессирующее течение, в стадии обострения.

При обследовании: количество эритроцитов (RBC) - 3,2·10¹²/л; гемоглобин (HGB) - 80 г/л; средний объем эритроцита (MCV) - 79 фл; среднее содержание гемоглобина в эритроците (МСН) - 25 пг; средняя концентрация гемоглобина в эритроците (МСНС) - 24,2 г/дл; широта распределения эритроцитов по объему (RDW) - 15%; сывороточное железо (СЖ) - 9,0 мкмоль/л; общая железосвязывающая способность сыворотки крови (ОЖСС) - 57,0 мкмоль/л; латентная железосвязывающая способность (ЛЖСС) - 48,0 мкмоль/л, КНТ - 15,8%, ферритин - 177 нг/мл.

При исследовании сыворотки крови предложенным способом с использованием тест-систем фирмы Peninsula Laboratories, LLC (США), уровень гепсидина-25 повышен до 36 нг/мл, то есть более 11,8 нг/мл. В данном случае на основании проведенных исследований показателей феррокинетики и гепсидина-25 диагностируем анемию хронических заболеваний, обусловленную хроническим пиелонефритом в стадии обострения.

Данный метод апробирован в МБЛПУ ГКБ №1, МБЛПУ №2 г. Новокузнецка.

Таким образом, нами разработан способ дифференциальной диагностики гипохромных анемий: ЖДА и АХЗ, когда оценка запасов железа путем исследования сывороточного ферритина невозможна по причине повышения уровня ферритина при острой фазе воспалительного процесса, когда создается ложное представление о нормальном или повышенном уровне ферритина у пациентов с анемическим синдромом и дефицитом железа.