Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОДГОТОВКИ МИКРОПОБЕГОВ IN VITRO ЯСЕНЯ, ОСИНЫ, ИВЫ ДЛЯ ПОСЛЕДУЮЩЕГО УКОРЕНЕНИЯ В УСЛОВИЯХ EX VITRO

Изобретение относится к области биотехнологии растений и лесному хозяйству и может быть использовано для подготовки микропобегов трансгенных клонов ясеня, осины, ивы с целью последующего укоренения в условиях ex vitro.

В настоящее время в лесном хозяйстве уже достаточно активно применяются современные достижения в области биотехнологии растений для получения оздоровленного быстрорастущего посадочного материала. Для этого используют способ клонального микроразмножения растений.

Осина (Populus tremula) и ее гибриды активно используются в биотехнологических исследованиях в качестве модельной культуры для изучения различных аспектов генетики лесных древесных растений по ряду причин: сравнительно небольшой размер генома, относительная простота ее клонального микроразмножения и генетической трансформации, быстрый рост. В лесном хозяйстве осина начинает занимать приоритетное направление для использования в целлюлозно-бумажной промышленности и получения стройматериалов.

Ясень обыкновенный является одной из самых ценных лиственных пород европейской части России. Это главная порода в защитных лесных полосах, в лесных культурах. Данная культура заслуживает широкого внедрения в лесные культуры при реконструкции малоценных молодняков в зеленые зоны вокруг населенных пунктов. Кроме того, древесина ясеня обыкновенного находит широкое применение в сельскохозяйственном машиностроении, в вагоностроении, в мебельном и столярном производствах.

Ввиду своих биологических особенностей виды и гибриды рода Salix имеют широкие ареалы распространения. Выращивание ивы позволяет получать сырье для создания плетеных изделий, экстракции дубильных и других биологически активных веществ, производства пульпы и бумаги, а также ивовая древесная биомасса является прекрасным сырьем для биоэнергетики. Однако для успешного создания целевых ивовых плантаций необходимы как продуктивные генотипы, так и эффективные технологии производства качественного клонового посадочного материала.

Анализ литературных данных не дал информации по способам укоренения ex vitro ясеня обыкновенного, осины и ивы, несмотря на наличие информации по другим культурам.

Известен способ укоренения ясеня в условиях ex vitro «In vitro and ex vitro rooting of micropropagated shoots using three green ash (Fraxinus pennsylvanica) clones» (Kim, M.S., Klopfenstein, N.B., Cregg, B.M. // New Forests, 1998, 16: 43-57), который является наиболее близким техническим решением. В нем растения ясеня пенсильванского культивировались на искусственной питательной среде для мультипликации MS (Murashige, Т. and Skoog, F. 1962. // A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497), с добавлением сахарозы 30 г/л, 6-бензиламинопурина (БАП) 5 мкмоль, тидиазурона 5 мкмоль и индолилмасляной кислоты 1 мкмоль, в течение 4 недель на свету. В конце пассажа срезались апикальные части побегов длиной 50 мм и основание побега, длиной 10 мм, на 15 секунд окунали в раствор, содержащий высокую концентрацию различных ауксинов. Подготовленные побеги помещали в специальный грунт Политерра®, после чего растения укрывали пленкой, где поддерживался высокий уровень влажности. Его недостатками является: получаемые на этапе мультипликации экспланты очень хрупкие (ломкие), и при пересадке в специальный грунт часть побегов повреждается и гибнет; схема подготовки растений сложна для исполнения, поскольку требуется погружение каждого растения в раствор ауксина на 15 секунд, в течение которых происходит увядание растения, наблюдается сильное генотипическое влияние.

Целью предлагаемого изобретения является упрощение схемы производства, повышение качества побегов, устранение сильного влияния генотипа для получения выровненного посадочного материала.

Поставленная цель достигается за счет того, что после завершения этапа мультипликации растения ясеня, осины и ивы переносятся на искусственную питательную среду для элонгации, включающую минеральные соли среды WPM (Lloyd, G. and В.Н. McCown. 1980. // Commercially feasible micropropagation of mountain laurel, (Kalmia latifolia) by use of shoot tip culture. Int. Plant Prop. Soc, Comb. Proc, 30: 421-427), 30 г/л сахарозы, 9 г/л агар-агара, 100 мг/л инозитола, 0,1 мг/л пиридоксина, 0,1 мг/л тиамина, 0,5 мг/л никотиновой кислоты и 0,5 ммоль/л глутамина. Культивирование на этапе элонгации осуществляется при повышенном уровне освещенности - 5 тыс. люкс.

Суть изобретения состоит в том, что предлагаемый способ, заключающийся в переносе растений на питательную среду для элонгации, включающую минеральные соли среды WPM, 30 г/л сахарозы, 9 г/л агар-агара, 100 мг/л инозитола, 0,1 мг/л пиридоксина, 0,1 мг/л тиамина, 0,5 мг/л никотиновой кислоты и 0,5 ммоль/л глутамина, и культивировании при повышенном уровне освещенности (5 тыс. люкс), обеспечивает получение физиологически и морфологически выровненных побегов ясеня, осины и ивы, что, в свою очередь, обеспечивает значительное повышение эффективности их укоренения в условиях ex vitro.

Анализ известных способов подготовки растений для укоренения в условиях ex vitro, проведенный по научно-технической и патентной документации, показал, что совокупность существенных признаков заявляемого способа не известна из уровня техники, следовательно, он соответствует условию патентоспособности изобретения - «новизна».

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.

1. В нестерильных условиях готовится питательная среда, включающая минеральные соли среды WPM, 30 г/л сахарозы и 9 г/л агар-агара. Среда разливается по колбам, укупоривается фольгой и бумагой, завязывается банковской резинкой. Автоклавирование проводится при 1 атм. (=1 изб. атм.) в течение 20 минут. В остывшую до 55°C среду в ламинар-боксе добавляются 100 мг/л инозитола, 0,1 мг/л пиридоксина, 0,1 мг/л тиамина, 0,5 мг/л никотиновой кислоты и 0,5 ммоль/л глутамина. Питательную среду разливают по стерильным культуральным сосудам. Все манипуляции с растительным материалом производится в стерильных условиях ламинар-бокса. На всех этапах культивирования число эксплантов в сосудах составляет 15-25 штук.

2. Этап элонгации проводят на питательной среде, включающей минеральные соли среды WPM, 30 г/л сахарозы, 9 г/л агар-агара, 100 мг/л инозитола, 0,1 мг/л пиридоксина, 0,1 мг/л тиамина, 0,5 мг/л никотиновой кислоты и 0,5 ммоль/л глутамина. Контейнеры с растениями помещают на светокультуральные стеллажи с уровнем освещенности 5 тыс. люкс.

В таблицах 1-4 представлены результаты исследований по влиянию способа подготовки растений ясеня, осины и ивы в условиях in vitro для последующего укоренения в условиях ex vitro.

Укоренение в условиях ex vitro позволяет ускорить и упростить процесс клонального микроразмножения. Однако укоренение микропобегов некоторых культур, полученных в условиях in vitro, часто сопряжено с такими проблемами, как низкая эффективность адаптации, хрупкость микропобегов, физиологическая разнородность адаптировавшихся растений и др. Для повышения физиологической зрелости растений применяют повышенный уровень освещенности культивируемых растений. В случае ясеня результаты исследования показали, что повышение уровня освещенности до 5 тыс. люкс способствовало значительному повышению частоты приживаемости и некоторому увеличению высоты растений обоих генотипов ясеня. Дальнейшее повышение освещенности (до 8 тыс. люкс) не увеличивало частоту приживаемости, а высота растений незначительно снижалась по сравнению с освещенностью 5 тыс. люкс. На число корней уровень освещенности никак не влиял (таблица 1). Уровень освещенности схожим образом влиял на степень приживаемости и морфологические характеристики осины и ивы.

В различных исследованиях показано, что глутамин, являющийся одной из ключевых аминокислот, при добавлении в питательную среду оказывает благоприятное действие на многие культуры. По нашим данным добавление глутамина в питательную среду для элонгации в концентрации более 0,5 ммоль способствовало значительному повышению высоты растений и увеличению числа корней. Приживаемость растений во всех вариантах была очень высокой (таблица 2).

В эксперименте по влиянию глутамина на эффективность последующей адаптации ивы показал, что при содержании глутамина 0,5-1,0 ммоль частота приживаемости увеличивалась до 100%, при этом значительно увеличивалась высота растений (таблица 3).

Преимуществом предложенного способа подготовки микропобегов является повышение их качества на этапе элонгации, что проявляется в более высокой частоте приживаемости растений и улучшении ростовых характеристик. Помимо этого способ позволяет получать более выровненные побеги и, как следствие, большее число растений товарного вида (таблица 4).

Способ применен в опытно-производственных условиях. Он позволяет повысить эффективность эксплуатации тепличных площадей на 15-20%. Получено и высажено более 10 тысяч микрорастений.

Перечень таблиц

1. Таблица 1. Влияние уровня освещенности на этапе элонгации в условиях in vitro на эффективность адаптации ясеня в условиях ex vitro.

2. Таблица 2. Влияние глутамина в среде для элонгации на последующую приживаемость осины в условиях ex vitro.

3. Таблица 3. Влияние глутамина в среде для элонгации на последующую приживаемость ивы в условиях ex vitro.

4. Таблица 4. Усредненные результаты, демонстрирующие эффективность введения этапа элонгации в сочетании с повышенной освещенностью, в сравнении с контролем (без этапа элонгации).

Способ подготовки микропобегов in vitro ясеня, осины, ивы для последующего укоренения в условиях ex vitro, включающий перенос растений после стадии мультипликации на питательную среду WPM для элонгации, с добавлением сахарозы 30 г/л, агар-агара 9 г/л, инозитола 100 мг/л, пиридоксина 0,1 мг/л, тиамина 0,1 мг/л и никотиновой кислоты 0,5 мг/л, отличающийся тем, что в среду для элонгации добавляют глутамин в концентрации 0,5 или 1,0 ммоль/л, при этом культивирование растений осуществляется при повышенной освещенности - от 5 до 8 тыс. люкс.