Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАСЛЕДСТВЕННОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К СЕНСИБИЛИЗАЦИИ ПРОИЗВОДСТВЕННЫМИ АЛЛЕРГЕНАМИ

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения наследственной предрасположенности к сенсибилизации производственными аллергенами.

Известен способ выявления наследственной предрасположенности к сенсибилизации, включающий забор венозной крови, выделение ДНК, проведение полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами, определение нуклеотидной последовательности и на основании этого выявление полиморфных вариантов гена ФНОα в полиморфном положении G308A, -590С>Т гена ИЛ4 и 431G>A гена ИЛ13 (см. Карунас А.С. Молекулярно-генетическое исследование аллергических заболеваний. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук, Уфа, 2012 г., с. 8-16).

Однако, известный способ выявления наследственной предрасположенности к сенсибилизации имеет специфическую особенность, так как определение полиморфного варианта 431G>A гена ИЛ 13 для выявления наследственной предрасположенности к сенсибилизации этноспецифично в отношении единичной популяции - татар, что снижает возможность выявления наследственной предрасположенности к сенсибилизации у лиц различных популяционных групп, работающих с веществами сенсибилизирующего действия.

Задачей настоящего изобретения является определение наследственной предрасположенности к сенсибилизации производственными аллергенами и риску развития профессиональных аллергодерматозов у лиц различных популяционных групп в процессе предварительных или периодических медицинских осмотров большого количества работающих или поступающих на работу на аллергоопасные производства.

Техническим результатом изобретения является возможность индивидуального определения наследственной предрасположенности к сенсибилизации производственными аллергенами у лиц различных популяционных групп, работающих с веществами сенсибилизирующего действия, что позволит своевременно выявлять лиц, предрасположенных к развитию профессиональных аллергодерматозов, для предупреждения развития профессиональной патологии путем рационального трудоустройства вне контакта с веществами сенсибилизирующего действия и формирования групп повышенного риска с целью проведения своевременной иммунокоррекции для повышения адаптационных способностей организма различными неспецифическими способами.

Указанная задача достигается тем, что в известном способе определения наследственной предрасположенности к сенсибилизации производственными аллергенами, включающем забор венозной крови, выделение ДНК, проведение полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами, определение нуклеотидной последовательности гена ФНОα в полиморфном положении G308A, гена ИЛ 4 в полиморфном положении С589Т, гена ИЛ10 в полиморфных положениях Т819С и A1082G и при обнаружении гомозиготных вариантов АА генотипа гена ФНОα G308A, ТТ генотипа гена ИЛ4 С589Т, ТТ генотипа гена ИЛ10 Т819С, АА генотипа гена ИЛ10 A1082G или АА генотипа гена ФНОα G308A, ТТ генотипа гена ИЛ4 С589Т, АА генотипа гена ИЛ10 A1082G определяют наследственную предрасположенность к сенсибилизации производственными аллергенами.

Проведенные исследования по патентным и научно-техническим информационным источникам показали, что предлагаемый способ неизвестен и не следует явным образом из изученного уровня техники, т.е. соответствует критериям "новизна" и "изобретательский уровень".

Предлагаемый способ может быть применен в клинических, биохимических, молекулярно-генетических лабораториях, укомплектованных широко используемым оборудованием, выпускаемым отечественной или зарубежной промышленностью.

Следовательно, заявленный способ является доступным и практически применимым.

Таким образом, предложена совокупность приемов, позволяющих обеспечить определение наследственной предрасположенности к сенсибилизации производственными аллергенами у лиц различных популяционных групп.

Предлагаемый способ основан на исследовании комплекса диагностических тестов, при этом наличие или отсутствие полиморфных вариантов генов ИЛ4 С589Т, ИЛ10 Т819С, ИЛ10 A1082G, ФНОα G308A соответственно в генах ИЛ4, ИЛ10, ФНОα играет основную роль при выявления наследственной предрасположенности к сенсибилизации производственными аллергенами у лиц различных популяционных групп.

Гомозиготный ТТ вариант генотипа гена ИЛ4 С589Т определяет снижение количественного уровня ИЛ4, обладающего противовоспалительным действием, гомозиготный ТТ вариант гена ИЛ10 Т819С и гомозиготный АА вариант гена ИЛ10 A1082G, при которых наблюдают снижение уровня ИЛ10, обладающего противовоспалительным действием, гомозиготный АА вариант гена ФНОα G308A, продуцирующего напротив повышенное количество воспалительного белка ФНОα, обладающего провоспалительными свойствами, что свидетельствует о нарушении соотношения провоспалительных и противооспалительных цитокинов в сторону увеличения провоспалительных, активизирующих и запускающих воспалительные процессы. На основании этого выявляют наследственную предрасположенность к сенсибилизации при воздействии на организм производственных факторов сенсибилизирующего действия.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

У пациентов осуществляют забор венозной крови. Кровь исследуют в соответствии с предлагаемым способом. Из 100 мкл цельной крови выделяют ДНК с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В" (ТУ9398-071-01897593-2008), в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.

Далее проводят полимеразную цепную реакцию со специфическими праймерами и определяют нуклеотидную последовательность. Для этого из полученного препарата ДНК объемом 50 мкл готовят серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации 1-3 нг/мкл, добавляют 10 мг конечного раствора ДНК в пробирку для осуществления генотипирования ИЛ4 С589Т, ИЛ10 Т819С, ИЛ10 A1082G, ФНОα G308A с помощью наборов, например, фирмы «Литех», Россия. При этом используют реагенты производства фирмы «Литех», Россия: разбавитель, реакционная смесь (НОРМА - N, ПАТОЛОГИЯ - Р), Taq-полимераза. Объем амплификационной смеси - 25 мкл.

Полимеразную цепную реакцию проводят по следующей программе.

При использовании термоциклера Т 100 Thermal Cycler (фирма BIO RAD, США), когда температура достигнет 94°C - режим Pause, ставят пробирки в ячейки термоциклера и выдерживают их при температуре 93°C - 1 мин. Далее выдерживают пробирки 35 циклов: при 93°C - 10 с, при 64°C - 10 с, при 72°C - 20 с, а в конце при 72°C - 1 мин, затем 10° Storage.

После проведения полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами осуществляют анализ продуктов реакции в 3% полиакриламидном геле с последующей окраской этидиумбромидом и визуализацией в проходящем УФ-свете.

При этом определяют нуклеотидную последовательность гена ФНОα в полиморфном положении G308A, гена ИЛ4 в полиморфном положении С589Т, гена ИЛ10 в полиморфных положениях Т819С и A1082G. При обнаружении гомозиготных вариантов АА генотипа гена ФНОα G308A, ТТ генотипа гена ИЛ4 С589Т, ТТ генотипа гена ИЛ10 Т819С, АА генотипа гена ИЛ10 A1082G или АА генотипа гена ФНОα G308A, ТТ генотипа гена ИЛ4 С589Т, АА генотипа гена ИЛ10 A1082G определяют наследственную предрасположенность к сенсибилизации производственными аллергенами у лиц различных популяционных групп, работающих с веществами сенсибилизирующего действия.

Пример 1

Больной П., 57 год. При анализе анамнеза и профессионального маршрута пациента было выявлено, что больной П. работал оператором на заводе в контакте с эпоксидной смолой. Через год после начала работы по результатам обследования был поставлен диагноз профессиональная экзема верхних конечностей. Со слов, имеет аллергическую реакцию на новокаин и эритромицин в виде сыпи. По результатам клинико-лабораторных исследований: эозинофилы - 15% (норма до 5%), эозинофильный катионный белок - 27 нг/мл (норма до 10 нг/мл), иммуноглобулин Е - 204 МЕ/мл (норма до 120 МЕ/мл).

Согласно предлагаемому способу кровь исследовали следующим образом.

Из 100 мкл цельной крови выделяли ДНК-сорбент однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В" (ТУ9398-071-01897593-2008), в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.

Из полученного препарата ДНК объемом 50 мкл готовили серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации 1-3 нг/мкл, добавляют 10 мг конечного раствора ДНК в пробирку для осуществления генотипирования ИЛ4 С589Т, ИЛ10 Т819С, ИЛ10 A1082G, ФНОα G308A с помощью наборов фирмы «Литех», Россия. При этом использовали реагенты производства фирмы «Литех», Россия: разбавитель, реакционная смесь (НОРМА - N, ПАТОЛОГИЯ - P), Taq-полимераза. Объем амплификационной смеси - 25 мкл.

Реакцию амплификации проводили по следующей программе.

При использовании термоциклера Т 100 Thermal Cycler (фирма BIO RAD, США), когда температура достигала 94°C - режим Pause, ставили пробирки в ячейки термоциклера и выдерживали их при температуре 93°C - 1 мин. Далее выдерживали пробирки 35 циклов: при 93°С - 10 с, при 64°C - 10 с, при 72°C - 20 с, а в конце при 72°C - 1 мин, затем 10° Storage.

После проведения амплификации осуществляли анализ продуктов реакции в 3% полиакриламидном геле с последующей окраской этидиумбромидом и визуализацией в проходящем УФ-свете.

При анализе результатов были выявлены полиморфные гомозиготные варианты ИЛ4 С589Т - ТТ, ИЛ10 Т819С - ТТ и ФНОα G308A - АА, ИЛ10 A1082G - АА, что свидетельствует о нарушении экспрессии генов провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, следствием чего явилось развитие наследственной предрасположенности к сенсибилизации производственными аллергенами. Это подтверждают данные клинико-лабораторного обследования: повышение уровня эозинофилов крови, значительное повышение содержания воспалительного белка - эозинофильного катионного протеина и антител, ответственных за аллергическую реакцию - иммуноглобулина Е в сыворотке крови.

Пример 2

Больная М., 53 года. При анализе анамнеза и профессионального маршрута пациента было выявлено, что больная М. работала аппаратчиком на заводе, подвергаясь воздействию солей хрома, никеля и кобальта, входящих в состав цемента. Через 6 лет после начала работы по результатам обследования был поставлен диагноз профессиональный аллергический распространенный дерматит. По данным анамнеза имеет пищевую аллергию, проявляющуюся сыпью. По результатам клинико-лабораторных исследований: эозинофилы - 3% (норма до 5%), эозинофильный катионный белок - 23 нг/мл (норма до 10 нг/мл), иммуноглобулин Е - 56 МЕ/мл (норма до 120 МЕ/мл).

Согласно предлагаемому способу кровь исследовали следующим образом.

Из 100 мкл цельной крови выделяли ДНК-сорбент однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В" (ТУ9398-071-01897593-2008), в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.

Из полученного препарата ДНК объемом 50 мкл готовили серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации 1-3 нг/мкл, добавляют 10 мг конечного раствора ДНК в пробирку для осуществления генотипирования ИЛ4 С589Т, ИЛ10 Т819С, ИЛ10 A1082G, ФНОα G308A с помощью наборов фирмы «Литех», Россия. При этом использовали реагенты производства фирмы «Литех», Россия: разбавитель, реакционная смесь (НОРМА - N, ПАТОЛОГИЯ - P), Taq-полимераза. Объем амплификационной смеси - 25 мкл.

Реакцию амплификации проводили по следующей программе.

При использовании термоциклера Т 100 Thermal Cycler (фирма BIO RAD, США), когда температура достигала 94°C - режим Pause, ставили пробирки в ячейки термоциклера и выдерживали их при температуре 93°C - 1 мин. Далее выдерживали пробирки 35 циклов: при 93°C - 10 с, при 64°C - 10 с, при 72°C - 20 с, а в конце при 72°C - 1 мин, затем 10° Storage.

После проведения амплификации осуществили анализ продуктов реакции в 3% полиакриламидном геле с последующей окраской этидиумбромидом и визуализацией в проходящем УФ-свете.

При анализе результатов были выявлены полиморфные варианты ИЛ 4 С589Т - ТТ, ИЛ10 A1082G - АА, и ФНОα G308A - АА и полиморфные варианты генов интерлейкинов, соответствующие норме - ИЛ10 (Т819С) СС, что свидетельствует о нарушении экспрессии генов провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, следствием чего явилось развитие наследственной предрасположенности к сенсибилизации производственными аллергенами. Это подтверждают данные клинико-лабораторного обследования: показатели эозинофилов крови в пределах нормы, повышение содержания воспалительного белка - эозинофильного катионного протеина и нормальные показатели ответственного за аллергическую реакцию иммуноглобулина Е в сыворотке крови.

Пример 3

Больная Р., 64 года. При анализе анамнеза и проф. маршрута пациента было выявлено, что больная Р. работала в АМО «ЗИЛ», в течение 29 лет имела контакт с солями хрома, шпатлевкой, клеем ПВА, отвердителем. Через 26 после начала работы по результатам обследования в НИИ Медицины Труда был поставлен диагноз профессиональная экзема верхних конечностей. Аллергоанамнез со слов не отягощен. По результатам клинико-лабораторных исследований: эозинофилы - 2% (норма до 5%), эозинофильный катионный белок - 11 нг/мл (норма до 10 нг/мл), иммуноглобулин Е - 61 МЕ/мл (норма до 120 МЕ/мл).

Согласно предлагаемому способу кровь исследовали следующим образом.

Из 100 мкл цельной крови выделяли ДНК-сорбент однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В" (ТУ9398-071-01897593-2008), в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.

Из полученного препарата ДНК объемом 50 мкл готовили серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации 1-3 нг/мкл, добавляют 10 мг конечного раствора ДНК в пробирку для осуществления генотипирования ИЛ4 С589Т, ИЛ10 Т819С, ИЛ10 A1082G, ФНОα G308A с помощью наборов фирмы «Литех», Россия. При этом использовали реагенты производства фирмы «Литех», Россия: разбавитель, реакционная смесь (НОРМА - N, ПАТОЛОГИЯ - P), Taq-полимераза. Объем амплификационной смеси - 25 мкл.

Реакцию амплификации проводили по следующей программе.

При использовании термоциклера Т 100 Thermal Cycler (фирма BIO RAD, США), когда температура достигала 94°C - режим Pause, ставили пробирки в ячейки термоциклера и выдерживали их при температуре 93°C - 1 мин. Далее выдерживали пробирки 35 циклов: при 93°C - 10 с, при 64°C - 10 с, при 72°C - 20 с, а в конце при 72°C - 1 мин, затем 10° Storage.

После проведения амплификации осуществили анализ продуктов реакции в 3% полиакриламидном геле с последующей окраской этидиумбромидом и визуализацией в проходящем УФ-свете.

При анализе результатов были выявлены полиморфные варианты генов ИЛ4 С589Т - СС, ИЛ10 Т819С - СС, ИЛ10 A1082G - GG, ФНОα G308A GG, соответствующие норме, вследствие чего не диагностировали наследственную предрасположенность к сенсибилизации производственными аллергенами. Этот вывод подтверждают результаты клинико-лабораторных исследований: нормальные показатели содержания количества эозинофилов крови, незначительное повышение воспалительного белка - эозинофильного катионного протеина и нормальное содержание антител, ответственных за аллергическую реакцию иммуноглобулина Е в сыворотке крови.

Таким образом, предложенная совокупность приемов позволяет осуществить выявление наследственной предрасположенности к сенсибилизации производственными аллергенами у лиц различных популяционных групп в процессе предварительных или периодических медицинских осмотров большого количества работающих или поступающих на работу на аллергоопасные производства, а также при оценке риска развития профессиональных аллергодерматозов при воздействии на организм производственных факторов сенсибилизирующего действия.

Предлагаемый способ может быть использован в клинических, биохимических, молекулярно-генетических лабораториях, укомплектованных оборудованием, выпускаемым отечественной или зарубежной промышленностью, при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества лиц различных популяционных групп, работающих во вредных и/или опасных условиях труда за короткие (сжатые) сроки времени.