Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА 70 И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии получения белка теплового шока с помощью методов генной инженерии.

Белки теплового шока (БТШ, HSP) относятся к семейству высококонсервативных внутриклеточных белков, которые играют важную роль для обеспечения гомеостаза организма, в том числе в экстремальных для него условиях. БТШ подразделяются на несколько семейств в зависимости от их молекулярной массы: HSPH (Hsp110), HSPC (Hsp90), HSPA (Hsp70), DNAJ (Hsp40), семейство малых HSPB (sHSP), а также семейство шаперонинов HSPD/E (HSP60/HSP10) (Kampinga H.H., Hageman J., Vos M.J., et al. Guidelines for the nomenclature of the human heat shock proteins. Cell Stress Chaperones. 2009; 14(1): 105-111). При этом наибольший интерес представляют белки из семейства БТШ70 (Feder M.E., Hofmann G.E. Heat-shock proteins, molecular chaperones, and the stress response: evolutionary and ecological physiology // Annu. Rev. Physiol. - 1999. - Vol.61. - P.243-282; H. Hauser, L. Shen, Q.L. Gu et al. Secretory heat-shock protein as a dendritic cell-targeting molecule: a new strategy to enhance the potency of genetic vaccines // Gene Ther. - 2004. - Vol.11, №11. - P.924-932.).

Белки, относящиеся к семейству БТШ70, индуцируются в клетках и тканях всех известных организмов, включая человека, под действием огромного числа факторов абиогенного и натурального происхождения. На сегодняшний день достаточно подробно изучен защитный эффект БТШ70 при воздействии на организм различных патогенетических факторов, включая соли тяжелых металлов, цитотоксические лекарственные средства, различные химические соединения, являющиеся неблагоприятными сопутствующими факторами химического производства, что делает их перспективными для создания на их основе противораковых препаратов связанных, в частности, с лечением патологий, вызываемых вирусом папилломы человека (бородавки, рак шейки матки и прямой кишки и т.д.) (RU 2282461, 2006).

Природные белковые препараты HSP70 млекопитающих были выделены из опухолевых тканей (P.K. Sriva stava. Purification of heat shock protein-peptide complexes for use in vaccination against cancers and intracellular pathogens. Methods, 1997 Jun, 12(2): 165-71). Эти способы включали в себя накопление и гомогенизацию ткани, экстракцию целевого белка, а также фракционирование препарата с помощью нескольких хроматографических стадий. Основными недостатками получения HSP из природных источников являются необходимость накопления опухолевых тканей, трудоемкость процесса выделения и малый конечный выход.

Генно-инженерные методы позволяют нарабатывать препаративные количества HSP, необходимые для исследования различных функций белка. Для получения БТШ70 по генно-инженерной технологии предлагалось, в частности, использовать штамм М.tuberculosis, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК (pE HSP70), которая характеризуется тем, что она представляет собой вектор pQE30, имеющий размер 3461 нуклеотидных пар оснований, с lac-промотором, геном устойчивости к ампициллину и последовательности из 18 нуклеотидов, кодирующей 6 гистидиновых остатков, в которые оперативно встроены ген белка ESAT6, имеющий 288 нуклеотидов (между сайтами для рестриктаз BglII и BamHI) и ген белка «теплового шока» HSP70 M.tuberculosis, имеющий 1878 нуклеотидов (между сайтами для рестриктаз BamHI и HindIII) (RU 2262351, 2005). Полученный таким образом белок оказался перспективен в качестве компонента вакцины для лечения и профилактики туберкулезной инфекции, содержащей смесь гибридного рекомбинантного белка ESAT-HSP70 M.tuberculosis и белка HSP65 М.tuberculosis, инертный носитель и тимоген. Однако сведений о противораковом действии полученного таким образом белка в литературе не найдено.

Известна технология, включающая рекомбинантную ДНК и штамм-продуцент E.coli, которые способны обеспечить получение рекомбинантного микобактериального БТШ70 в виде конъюгата с белком р24 вируса иммунодефицита человека. По известному способу экспрессия БТШ70 осуществляется в виде химерного белка с р24 (Suzue K.J. and Young R.A. J. Immunol., 156: 873-879, 1996).

Однако получение химерного белка проходит с небольшим выходом по сложной технологии, что не позволяет рассматривать перспективы использования его в качестве компонента лекарственных средств или вакцинных препаратов.

Известно использование для продуцирования БТШ70 в клетках E.coli, содержащих вектор pET-11 (Studier, F.W., et al. Methods Enzymol.185: 60-89) с последующей очисткой целевого продукта при помощи анионообменной хроматографии на DEAE-Сефарозе и АТР-агарозной аффинной хроматографии (K.ABRAVAYA et all., Genes Dev., 1992, V.6, p.1153-1164) с последующим концентрированием ультрафильтрацией и обессоливанием на глютатион-cефарозе.

Недостатком способа является многоступенчатая технология получения и очистки БТШ70, что ведет к большим потерям целевого продукта. К сожалению, в работе отсутствуют данные о конечном выходе и чистоте БТШ70.

Биосинтез рекомбинантного БТШ70 человека, соответствующий гену HSPA1L, был осуществлен в клетках штамма E.coli BL21(DE3) (S. Jindal, P. Murrey, S. Rosenberg, R.A. Young and K.P. Williams. Human stress protein hsp70: overexpression in E.coli, purification and characterization. Biotechnology, 1995, 13: 1105-9). Для этого кДНК HSP70 была встроена по сайтам рестрикции NdeI-BamHI в экспрессионный вектор pET-3a. После трансформации штамма E.coli BL21(DE3) полученной рекомбинантной плазмидой и индукции экспрессии гена изопропилтиогалактозидом целевой белок накапливался в клетках в виде телец включения. Выделение предварительно рефолдированного белка HSP70 было основано на аффинной хроматографии с использованием АТФ-агарозы.

К недостаткам этого метода относится контаминация целевого белка DnaK - бактериальным аналогом эукариотического БТШ70 и, как следствие, недостаточно высокий выход целевого продукта.

Наиболее близким по технической сущности является способ получения другого представителя семейства БТШ70, кодируемого геном HSPA1B (Gene Bank NM 005346) препарата белка теплового шока, путем экспрессии гена такого белка в клетках E.coli с последующим выделением, рефолдингом и очисткой (RU 2333956, 2008). При этом экспрессию гена осуществляют в составе векторной кДНК, содержащей Т7 промотор, ген устойчивости к канамицину, репликативный ориджин pUC ori и ген, кодирующий lac-индуктор, векторную ДНК культивируют в составе клеток E.coli BL21 в питательной среде с добавлением канамицина (100 мкг/мл) и глюкозы (0.2%) до уровня мутности 0,5-0,6 OD600, в среду добавляют 0.2 мМ изопропил бета-D-тиогалактозид (ИПТГ) и продолжают культивировать в течение 1-3 часов до накопления конечного продукта. Получение из клеток продуцента рекомбинантного hHSP70A1B включает несколько стадий. Бактерии отделяют от культуральной среды и разрушают одним из обычно применяемых способов. Центрифугированием отделяют растворимую клеточную фракцию от телец включения. Последние отмывают буферным раствором от водорастворимых компонентов клетки, проводят солюбилизацию, восстановление и рефолдинг рекомбинантного белка. Окончательную очистку целевого белка проводят методом металло-хелатной хроматографии. Выход полученного таким способом рекомбинантного hHSP70A1B составляет примерно 10 мг с 1 л бактериальной культуры. Выделение рекомбинантного hHSP70A1B из растворимой клеточной фракции проводят в одну стадию - методом металло-хелатной хроматографии. При этом выход целевого белка составляет примерно 30 мг с 1 л бактериальной культуры.

Недостатком данного способа является недостаточно высокий выход целевого продукта, а также недостаточная противоопухолевая эффективность полученного продукта.

Технической задачей, решаемой авторами, являлось создание более эффективного способа получения и выделения БТШ70.

Поставленная техническая задача решалась в результате создания штамма E.coli BB1553 pMSHsp70, депонированного во Всероссийскую коллекцию промышленных микроорганизмов (ВКПМ) «28»ноября 2012 года под номером В-11388, и технологии выделения БТШ70, обеспечивающего повышенный выход БТШ70.

Технический результат был достигнут созданием разработанного авторами штамма-продуцента Escherichia coli ВВ 1553, трансформированного векторной плазмидой pMSHsp70, и получением препарата БТШ70 культивированием штамма E.coli ВВ1553 pMSHsp70 с последующим разрушением клеток E.coli неоднократным замораживанием-расстаиванием и обработкой полученной суспензии последовательно раствором ДНК-зы и раствором хлорида магния, получением белоксодержащего раствора центрифугированием и очисткой белка хроматографической очисткой на ионообменном сорбенте DEAE-Сефарозой уравновешенным буферным раствором при pH 7,5 и аффинной хроматографией на АТФ-агарозе, после чего очищали раствор, полученный после аффинной хроматографии, от липополисахаридов инкубированием с гелем Полимиксин В-Агарозой и отделяли белок от сорбента центрифугированием.

Реципиентный штамм Е. coli ВВ1553 получен в Массачусетском технологическом институте (США). Физиолого-биохимические признаки штамма типичны для Escherichia coli. Каталазоположительные. Оксидазоотрицательные. Факультативные анаэробы. Катаболизируют D-глюкозу, L-арабинозу, D-ксилозу, сахарозу, лактозу, мальтозу, маннит, D-маннозу, L-рамнозу, сорбит, тригаллозу с образованием кислоты (и газа). Не гидролизуют желатину. Уреаза(-), индол(+), триптофандезаминаза(-), лизиндекарбоксилаза (+), рост в присутствии KCN (-), малонат не используют, пигмент не образуют. Реакция «Фогес-Проскауэра» отрицательная. Не образуют H₂S. Не растут на цитратной среде «Симмонса».

Рекомбинантная плазмида pMS-HSP70 ранее использовалась для получения мутантных белков (В.Ф. ЛАЗАРЕВ «МЕХАНИЗМЫ АГРЕГАЦИИ МУТАНТНЫХ БЕЖОВ В МОДЕЛЯХ БОЛЕЗНИ ХАНТИНГТОНА И АМИОТРОФИЧЕСКОГО БОКОВОГО СКЛЕРОЗА» автореферат на звание кандидата биологических наук, 2013, www.cytspb.rssi.ru/referates/2013_05_31_lazarev_autoref.pdf; diss, seluk. ru/…/675697-1-mehanizmi-agregacii-mutantnih-belkov-model…).

Плазмида вводилась в реципиентный штамм Е. coli ВВ1553 стандартным методом Са²⁺-зависимой трансформации клеток с последующим отбором целевых трансформантов на агаризованной питательной среде, содержащей ампициллин (Amp) в концентрации 50 мкг/мл.

Штамм E.coli ВВ1553 pMSHsp70 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физико-биохимическими свойствами:

Культурально-морфологические особенности штамма ГИММ. Грамотрицательные палочки овальной формы с закругленными краями, размером 2.0-3.0×l.5-5.0 мкм, чаще одиночные, но попадаются цепочки клеток по 2-4 штуки, спор и капсул не образуют. Колонии на питательном агаре LB гладкие, слабовыпуклые, с ровным краем. В жидких средах образуют равномерную муть.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма ГИММ. Штамм хранится лиофильно высушенным (до 2-х лет), криоконсервированным при -70°C (до 6 месяцев) в 15%-ном растворе глицерина (или 7% растворе диметилсульфоксида) в питательной среде LB (Бактотриптон - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 5 г/л, хлористый натрий - 10 г/л, pH 6.8).

Способ, условия и состав сред для размножения штамма ГИММ. Штамм выращивают при 37°C в LB-бульоне, содержащем ампициллин и хлорамфеникол каждый в концентрации 100 мкг/см³. Выделение и очистку белка осуществляли трехстадийной хроматографией. На первой стадии супернатант, содержащий БТШ70, наносили на колонку с сорбентом DEAE-Сефарозой. Колонку предварительно уравновешивали пятью объемами буферного раствора, содержащего 20 мМ трис-НС1, 20 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА при pH 7,5 (буфер А/2), и двумя объемами того же буферного раствора, содержащего 0,1% Тритона Х-100 и 0,2 мМ фенил метил сульфонил фторида (ФМСФ). После сорбции колонку промывали двумя объемами буферного раствора 40 мМ трис-HCl, 40 мМ NaCl, 0,2 мМ ЭДТА при pH 7,5 (буфер А) с 0,1% Тритоном Х-100. Элюцию проводили 1.5 объемами 0.35 М NaCl на буфере.

На второй стадии использовалась аффинная хроматография на колонке с АТФ-агарозой. Перед второй стадией элюат с ДЭАЭ сефарозы разбавляли в 5 раз буфером, содержащим 20 мМ трис-HCl, 1 мМ MgCl₂ при pH 7.5 (буфер В). Полученный раствор наносили на колонку с АТФ-сефарозой, уравновешенную 20-ю объемами буфера В. Затем колонку промывали 20-ю объемами буфера В; 10-ю объемами 1 мМ NaCl на буферном растворе В и 20-ю объемами буфера В. Элюцию проводили 7-ю объемами 3 мМ аденозин-трифосфата (АТФ), растворенном в том же буфере А.

На третьей стадии осуществляли удаление липополисахаридов (ЛПС) из очищенного раствора БТШ70. С этой целью полученный после аффинной хроматографии раствор очищенного белка инкубировали с гелем Полимиксин В-Агарозой производства компаний Pierce Biotechnology в соотношении 100 мг БТШ70 - 10 мл геля.

Концентрацию белка в элюате определяли по методу Брэдфорда. Выход белка БТШ70 с 1 г биомассы составил 2 мг. Гомогенность белка оценивали с помощью электрофореза в ПААГ. Чистота белка составила 99%.

Лекарственная форма нового препарата в виде раствора или лиофилизата для приготовления раствора для инъекций по 0,5 мг белка в ампуле показала высокую эффективность при лечении новообразований.

Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами использования штамма E.coli ВВ1553.

ПРИМЕР 1. Для культивирования штамма Е. coli ВВ1553 pMS-HSP70 на твердой среде на чашках Петри в суховоздушном термостате использовали стандартную агаризованную среду среду LB с добавлением двух антибиотиков, один из которых - ампициллин в концентрации 100 мг/л, а второй - стрептомицин или хлорамфеникол в концентрации 100 или 25 мг/л соответственно.

Ферментацию штамма осуществляли при 37°C в полной питательной среде LB (240 г кислотного гидролизата казеина, 120 г дрожжевого экстракта, 18,85 г Na₂HPО₄*12H₂О, 3,75 г КН₂РО₄, 300 мл 60% раствора глюкозы, 24 мл 1М MgSО₄,10 мл CaCl₂, объем доводят стерильной дистиллированной водой до 1 л), pH 6,8, с добавлением антибиотика ампициллина в концентрации 100 мг/л. Для этого засевали несколько колоний с чашки Петри и выращивали на качалке ночную культуру штамма Е. Coli при 37°C на полной среде LB с ампициллином (100 мг/л) и стрептомицином или хлорамфениколом (100 или 25 мг/л соответственно). Через 12 часов культуру разводили 1:100 свежей средой LB с ампициллином (100 мг/л) и продолжали культивирование до OD600=(0,8,1,0). После этого к культуре добавляли 1,2-изопропил-тио-бета-галактозид (ИНН) до концентрации 0,5 мМ. Через 4-5 часов после добавления ИПТГ проводили концентрирование клеточной массы с помощью центрифугирования на проточной центрифуге при 17000 g. Затем клетки были заморожены при температуре -70°C.

Для получения БТШ клеточная биомасса весом 140 г была разморожена при комнатной температуре в течение 2 часов. После этого к ней было добавлено 100 мл буфера, содержащего 10 мМ трис- HCl и 20 мМ NaCl, pH 7,6 и лизоцим до конечной концентрации 0,1 мг/мл. Сразу после этого суспензию интенсивно перемешивали в блендере в течение 2 мин и далее инкубировали при постоянном перемешивании в стакане на магнитной мешалке в течение 30 мин при комнатной температуре, переносили в емкость и замораживали при температуре -70° в течение 4 часов. Затем суспензию размораживали в холодильнике при +4°C в течение 15-16 часов. Процедуру замораживания и размораживания повторяли дважды.

После повторного размораживания в суспензию добавляли 60 мкл маточного раствора ДНК-зы (С=25 мг/мл) и раствор хлорида магния до конечной концентрации 10 мМ, интенсивно перемешивали на блендере в течение 2 мин, после чего ее объем доводили до 400 мл добавлением того же буферного раствора и инкубировали 90 мин на магнитной мешалке при 37°C.

После инкубации суспензию центрифугировали при 13 тыс. об/мин 30 мин, супернатант после центрифугирования отбирали в емкость (проба 1), а осадок суспендировали в 200 мл с помощью блендера, добавляли к суспензии 200 мл того же буфера, но содержащего 10 мМ ЭДТА, перемешивали на магнитной мешалке при комнатной температуре 30 мин и вновь центрифугировали при 13 тыс. об/мин 30 мин. Супернатант после центрифугирования отбирали в емкость (проба 2), а осадок удаляли. Супернатанты (пробы 1 и 2) объединяли, центрифугировали в течение 30 минут при 19 тыс. об/мин и подвергали трехстадийной хроматографической очистке.

На первой стадии объединенный супернатант наносили на колонку с ионообменным сорбентом DEAE-Сефарозой объемом 200 мл. Колонку предварительно уравновешивали пятью объемами, содержащего 20 мМ трис-HCl, 20 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА при pH 7,5 (буфер А/2), и двумя объемами того же буферного раствора, содержащего 0,1% Тритона Х-100 и 0,2 мМ фенил метил сульфонил фторида (ФМСФ). После сорбции колонку промывали двумя объемами буферного раствора 40 мМ трис-HCl, 40 мМ NaCl, 0,2 мМ ЭДТА при pH 7,5 (буфер А) с 0,1% Тритоном Х-100. Элюцию проводили 1.5 объемами 0.35 М NaCl на буфере.

На второй стадии использовалась аффинная хроматография на колонке с АТФ-агарозой (фирмы «Sigma», США). Перед второй стадией элюат с DEAE-Сефарозой разбавляли в 5 раз буфером, содержащим 20 мМ трис-HCl, 1 мМ MgCl₂ при pH 7.5 (буфер В). Полученный раствор наносили на колонку с АТФ-сефарозой объемом 1 мл, уравновешенную 20-ю объемами буфера В. Затем колонку промывали 20-ю объемами буфера В; 10-ю объемами 1 мМ NaCl на буферном растворе В и 20-ю объемами буфера В. Элюцию проводили 7-ю объемами 3 мМ аденозин-трифосфата (АТФ), растворенном в том же буфере А.

Концентрацию белка в элюате определяли по методу Брэдфорда. Выход белка БТШ70 составил 280 мг. Гомогенность белка оценивали с помощью электрофореза в ПААГ. Чистота белка составила 99%.

Биологическую активность полученного белка оценивали по шаперонной активности, способности к внутриклеточному транспорту и в тесте активации цитотоксических лимфоцитов. Шаперонная активность составила 72±6%. Способность к внутриклеточному транспорту оценивалась 40-50% (в клетки миелоидной лейкемии человека U-937 - не менее 40%; эритролейкемии человека К-562 - 49±10%; меланомы мыши В16 - 44±8%). Активация цитотоксических лимфоцитов в тесте CTL (50 мкг/мл БТШ70) К-562 - 40-42%; рабдомиосаркомы мыши РА-2 - 45-48%, глиобластомы крысы С6 - 45-52%.

На третьей стадии осуществляли удаление липополисахаридов (ЛПС) из очищенного раствора БТШ70. С этой целью полученный после аффинной хроматографии раствор очищенного белка инкубировали с гелем Полимиксин В-Агарозой производства компаний Pierce Biotechnology в соотношении 100 мг БТШ70 - 10 мл геля. После 30 минутной инкубации белок отделяли от сорбента центрифугированием при 500 об/мин.

Концентрацию бактериального ЛПС в конечном препарате оценивали с помощью тест-набора тест E-Toxate Assay (Sigma, США). Уровень ЛПС в препарате составлял 0,4 нг/мг белка.