Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Listeria monocytogenes НА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ, ПРИГОТОВЛЕННОЙ НА ОСНОВЕ ЛИСТОВОГО САЛАТА (Lactuca sativa)

Изобретение относится к микробиологии, а именно к санитарно-гигиеническому контролю за инфицированностью растений, употребляемых в пищу человеком, как фактора передачи возбудителя листериоза.

Одной из важных особенностей листериоза является то, что он относится к возбудителям сапрозоонозов, обладающим сапрофитной и паразитической природой, способными существовать как в организме человека и животных, вызывая инфекционный процесс, так и в объектах окружающей среды (почва, вода, растения и т.д.). Употребляемые в пищу человеком растения являются одним из важных факторов передачи Listeria monocytogenes (Г.П. Сомов, Л.С. Бузолева. Адаптация патогенных бактерий к абиотическим факторам окружающей среды./ Изд-во ОАО "Примполиграфкомбинат", г. Владивосток, 2004 г., с. 13).

Индикация L. monocytogenes из объектов внешней среды, в том числе из растений, вызывает определенные трудности, в основном из-за некорректного употребления в способах диагностики необходимых питательных сред и температуры культивирования на этих средах.

Известен способ культивирования иерсиний и листерий среды накопления листериозного микроба - среды Хоттингера (Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, Москва, 1967, с. 53-54). Среду готовят на основе гидролизата мяса или рыбы, которые варят, затем к отвару добавляют либо свежую перемолотую поджелудочную железу, либо сухой панкреатин, перемешивают, доводят до pH 7,8 - 8,0. Добавляют хлороформ и оставляют смесь для переваривания на 7-16 дней.

Недостатками среды Хотингера как диагностической среды для выявления листерий из растительных субстратов являются: неадаптированность к растительным субстратам (среда готовится на рыбном гидролизате), в связи с этим неполное выявление внеорганизменных популяций из смывов с овощей. Известно, что смена сред обитания (с растения на мясо) способствует формированию стресса у микроорганизмов (Работнова И.Л., Позмогова И.Н. Некоторые вопросы общей физиологии микроорганизмов // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиологии. 1994. № 4. С. 116-120), что, в свою очередь, приводит к модификационным изменениям биологических свойств листерий, а следовательно, к некорректной диагностике. Кроме того, приготовление среды трудоемко и в качестве компонентов используются дорогостоящие пищевые продукты.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению является способ культивирования и количественного учета иерсиний и листерий в объектах внешней среды на питательной среде, включающей продукты растительного происхождения. В качестве продуктов растительного происхождения используют отвары отрубей ржаных, капусты и моркови. Для приготовления 1 л питательной среды берут: 5-20 мл отвара отрубей ржаных, 10-30 мл отвара капусты, 5-20 мл отвара моркови, 10-15 г агара микробиологического и доводят до 1 л фосфатным буфером pH 7,4. Культивирование иерсиний и листерий на питательной среде ведут при температуре 37°С среды (Патент РФ № 2161655, МПК C12Q 1/04, C12N 1/20, опубл. 10.01.2001).

Недостатком данного способа является использование для культивирования листерий многокомпонентной среды на основе отвара капусты, моркови и отрубей. Многокомпонентность питательной среды в микробиологии считается отрицательным фактором из-за трудности сохранения состава среды, к тому же осложняется процесс способа культивирования, поскольку отвары для приготовления питательной среды готовятся в раздельных емкостях, при кипячении, далее полученные отвары требуют раздельной фильтрации и стерилизации. Однако основным недостатком данного способа следует считать невысокую корректность диагностики, связанную, в частности, с культивированием листерий при стандартной температуре 36-37°C, которая не обеспечивает получение листерий в устойчивой форме на этой среде (колонии имеют R-форму), а также с проявлением угнетающего действия моркови на рост листерий.

Задача, решаемая изобретением, разработка простого, нетрудоемкого способа культивирования Listeria monocytogenes, обеспечивающего точность и корректность диагностики листериоза, за счет получения листериозного микроба в устойчивой форме, а также расширение сырьевой базы для приготовления питательных сред, способствующих улучшению дифференциально-диагностических свойств в отношении количественного и качественного роста колоний листерий.

Поставленная задача решается тем, что в известном способе культивирования листериозного микроба (Listeria monocytogenes) на питательной среде, включающей продукт растительного происхождения, агар и фосфатный буфер, согласно изобретению, в качестве продукта растительного происхождения берут маточный раствор сока листового салата. Компоненты смешивают при следующем соотношении:

Затем в подготовленную среду вносят исследуемый материал и инкубируют для накопления листериозного микроба (Listeria monocytogenes) при температуре 20-22°C не менее 24 часов.

Использование в составе питательной среды в качестве продукта растительного происхождения маточного сока листового салата не только значительно упрощает и удешевляет процесс приготовления питательной среды, но и обеспечивает, в конечном результате, повышение точности диагностики очень опасного для человека заболевания - листериоза.

На основе данных литературы (базы данных SCOPUS, WEB of Science, РИНЦ) основным фактором передачи листерий является салат листовой, по сравнению с другими видами культурных растений (Koch, Stark, 2006; Doorduyh et al., 2007). На фиг. 1 представлено распределение количества случаев контаминации растений, как факторов передачи возбудителя Listeria monocytogenes по данным доступной литературы, где самый большой - столбик 2 - относится к листовому салату.

Однако по результатам поиска по научно-технической и патентной документации и питательных сред на основе листового салата не выявлено. На основании этого заявитель считает, что заявленное техническое решение соответствует критериям новизна и изобретательский уровень.

Листовой салат (Lactuca sativa) является одной из наиболее распространенных и любимых потребителями культур, поскольку он очень полезен - в нем много витаминов и минералов. Существует более ста видов салатов: самых разных форм и расцветок - от нежно-зеленых до темно-бордовых, и все удивительно вкусные. Для приготовления питательной среды может быть использован маточный раствор следующих видов листового салата: рукола, изумрудный, московский парниковый, одесский кучерявец, эндивий нежный, хрустящий витаминный, дубочек МС, энергия лета и др.

Для приготовления маточного раствора сока листового салата его промывают последовательно водопроводной и стерильной водой, высушивают при комнатной температуре, измельчают, и из полученной массы отжимают сок, и определяют содержание сухого вещества в 1 мл маточного раствора сока.

В питательную среду вводят маточный раствора сока, содержащий 6-9 г сухого вещества, именно данное количество необходимо для получения питательной среды, содержащей достаточное количество органического и минерального питания, а также витаминов для культивирования листериозного микроба.

Применение фосфатного буфера в заявляемом количестве позволяет получить бактериям необходимое минеральное питание, особенно фосфор, а также фосфатный буфер стабилизирует растительную среду, поддерживая значение pH постоянным 7,4.

Применение агара в количестве 100 г/л обеспечивает плотную основу для формирования колоний.

Выход за пределы заявленных значений компонентов среды приводит либо к перерасходу используемых реактивов, либо к снижению ростовых показателей среды и появлению нежелательной изменчивости листериозного микроба, и, как следствие, к некорректности определения количества Listeria monocytogenes.

Экспериментально установлено, что проведение процесса культивирования при температуре 20-22 МПК C12Q 1/04, C12N 1/20

Способ культивирования Listeria monocytogenes на питательной среде, приготовленной на основе листового салата (Lactuca sativa)

C позволяет получить листериозный микроб Listeria monocytogenes в наиболее устойчивой S-форме, вследствие чего, значительно повышается точность и корректность диагностики листериоза. Кроме того, это позволяет избежать изменения биологических свойств листерий, изначально обитающих на растениях при этой температуре, и увеличивает вероятность обнаружения листериозного микроба.

Накопление листериозного микроба при разных температурах в различных формах наглядно подтверждается результатами морфологических исследований, представленных на фиг. 2 и фиг. 3. Морфологическое изучение структуры колоний выявило, что при 37°C бактерии на растительных средах находились в R-форме (Фиг. 2), а при 20-22°C - в S-форме (Фиг. 3). Известно, что R-форма или шероховатые колонии листерий образуются за счет клеток, имеющих измененные поверхностные структуры, что сказывается при идентификации листерий. Так, например, при постановке биохимических рядов Гиса не ферментируются L-сорбоза, D-маннитол, D-раффиноза D-мелезидоза, являющиеся ключевыми диагностическими признаками для идентификации Listeria monocytogenes. Это проявляется в возможной неточности и замедленности проявления реакции агглютинации.

При температуре ниже 20°C культура растет медленно (2-3 суток), а при повышении температуры культивирования более 22°C большая часть колоний переходит в R-форму. Это, в конечном результате, приводит к получению некорректных результатов диагностики листериоза, а также к ухудшению дифференциально-диагностических свойств в отношении количественного и качественного роста колоний листерий.

Экспериментально установлено, что культивирование листериозного микроба целесообразно вести не менее 24 часов, если проводить культивирование меньше по времени, то колонии формируются в недостаточном количестве, что осложняет впоследствии их характеристику как качественного, так и количественного состава. Таким образом, суток вполне достаточно для накопления листериозного микроба, обеспечивающего корректность выявления листериоза, а также очень удобно с практической стороны работы.

Описание чертежей: на фиг. 1 представлено количество случаев контаминации растений, как факторов передачи возбудителя Listeria monocytogenes по данным доступной литературы, где столбец 1 картофель, столбец 2 - салат листовой, столбец 3 - другие овощи; на фиг. 2 - рост колоний Listeria monocytogenes на питательной среде на основе салата листового при культивировании при 37°C (R-форма); на фиг. 3 - рост колоний Listeria monocytogenes на питательной среде на основе салата листового при культивировании при 20-22°C (S-форма).

Для реализации способа культивирования Listeria monocytogenes предварительно готовят маточный раствор салата, фосфатный буфер и питательную среду.

Маточный раствор сока салата готовят следующим образом: берут 100-150 г листового салата определенного вида, промывают водопроводной и стерильной водой последовательно, высушивают при комнатной температуре и измельчают, затем получают сок при помощи соковыжималки. Сок можно готовить впрок, хранить в холодильнике, использовать по мере необходимости.

Буфер фосфатный готовят на основе стерильной воды. Для приготовления фосфатного буфера берут натрий фосфорнокислый двузамещенный - 8,7 г/л, калий фосфорнокислый однозамещенный - 2,7 г/л, до 1 л - дистиллированная вода, устанавливают pH 7,4, стерилизуют при давлении 0,5 атм в течение 30 мин.

Осуществление способа демонстрируется следующими примерами.

Пример 1.

К 100 мл маточного раствора сока листового салата «Рукола», содержащего 6 г сухого вещества, добавляют 100 г агара микробиологического и доводят стерильным буфером фосфатным до 1 л (установленного pH 7,4). Полученная питательная среда прозрачная, зеленоватого цвета, не имеет запаха, pH среды 7,4.

На приготовленную среду высевают листерий в физиологическом растворе в количестве 10² КОЕ/мл. На культивирование в течение 24 час термостатируют 5 проб при различных температурах: 19°C, 20°C, 21°C, 22°C и для контроля одну из проб при 37°C - стандартной, широко используемой температуре культивирования бактерий Listeria monocytogenes.

Полученные результаты отражены в табл. 1.

Пример 2.

К 150 мл маточного раствора сока листового салата «Рукола», содержащего 9 г сухого вещества, добавляют 100 г агара микробиологического и доводят стерильным буфером фосфатным до 1 л (установленного pH 7,4). Полученная питательная среда прозрачная, зеленоватого цвета, не имеет запаха, pH среды 7,4.

На приготовленную среду высевают листерий в физиологическом растворе в количестве 10² КОЕ/мл. На культивирование в течение 24 часов 10 минут термостатируют 5 проб при различных температурах: 19°C, 20°C, 21°C, 22°C и для контроля одну из проб при 37°C - стандартной, широко используемой температуре культивирования бактерий Listeria monocytogenes.

Полученные результаты отражены в табл. 1.

Пример 3.

К 100 мл маточного раствора сока листового салата «Кучерявец одесский», содержащего 6 г сухого вещества, добавляют 100 г агара микробиологического и доводят стерильным буфером фосфатным до 1 л (установленного pH 7,4). Полученная питательная среда прозрачная, зеленоватого цвета, не имеет запаха, pH среды 7,4.

На приготовленную среду высевают листерий в физиологическом растворе в количестве 10² КОЕ/мл. На культивирование в течение 24 час термостатируют 5 проб при различных температурах: 19°C, 20°C, 21°C, 22°C и для контроля одну из проб при 37°C - стандартной, широко используемой температуре культивирования бактерий Listeria monocytogenes.

Полученные результаты отражены в табл. 1.

Пример 4.

К 100 мл маточного раствора сока листового салата «Эндивий нежный», содержащего 6 г сухого вещества, добавляют 100 г агара микробиологического и доводят стерильным буфером фосфатным до 1 л (установленного pH 7,4). Полученная питательная среда прозрачная, зеленоватого цвета, не имеет запаха, pH среды 7,4.

На приготовленную среду высевают листерий в физиологическом растворе в количестве 10² КОЕ/мл. На культивирование в течение 24 час термостатируют пять проб при различных температурах: 19°C, 20°C, 21°C, 22°C и для контроля одну из проб при 37°C - стандартной, широко используемой температуре культивирования бактерий Listeria monocytogenes.

Полученные результаты отражены в табл. 1.

Пример 5.

К 100 мл маточного раствора сока листового салата «Лоло-росса», содержащего 6 г сухого вещества, добавляют 100 г агара микробиологического и доводят стерильным буфером фосфатным до 1 л (установленного pH 7,4). Полученная питательная среда прозрачная, зеленоватого цвета, не имеет запаха, pH среды 7,4.

На приготовленную среду высевают листерий в физиологическом растворе в количестве 10² КОЕ/мл. На культивирование в течение 24 час 30 минут термостатируют пять проб при различных температурах: 19°C, 20°C, 21°C, 22°C и для контроля одну из проб при 37°C - стандартной, широко используемой температуре культивирования бактерий Listeria monocytogenes.

Полученные результаты отражены в табл. 1.

Пример 6 (используется питательная среда из способа прототипа).

Для приготовления 1 л питательной среды берут: 10 мл отвара отрубей ржаных, 15 мл отвара капусты, 10 мл отвара моркови, 15 г агара микробиологического и доводят до 1 л фосфатным буфером pH 7,4. На приготовленную среду высевают листерий в физиологическом растворе в количестве 10² КОЕ/мл. На культивирование в течение 24 час термостатируют пять проб при различных температурах: 19°C, 20°C, 21°C, 22°C и для контроля одну из проб при 37°C - стандартной, широко используемой температуре культивирования бактерий Listeria monocytogenes.

Полученные результаты отражены в табл. 1.

Из приведенных в таблице 1 данных видно, что прирост листерий в заявляемой питательной среде, в заявляемых режимных параметрах, значительно выше по сравнению с прототипом.

Таким образом, заявляемое техническое решение позволяет получить достаточно высокую численность листерий в устойчивой S-форме, что обеспечивает более полное выявление и учет внеорганизменных популяций неизмененных форм листерий, обитающих на растениях, являющихся факторами передачи инфекции.

Дополнительными преимуществами разработанного способа учета являются расширение сырьевой базы, а также улучшение ее дифференциально-диагностических свойств в отношении количественного и качественного роста колоний листерий. Способ прост в осуществлении, не требует использования специального оборудования и химических реактивов.