Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ РЕГЕНЕРАЦИОННОГО ПОТЕНЦИАЛА ИМПЛАНТАТОВ ДЛЯ ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЙ ХИРУРГИИ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ

Изобретение относится к области медицины, конкретно к способам повышения регенерационной способности имплантируемых материалов для восстановительной хирургии при повреждении соединительной ткани, включая опорные ткани внутренних органов, кости, хрящи, связки.

Известно, что имплантаты могут способствовать восстановлению поврежденной соединительной ткани и обеспечивать выполнение ее функции. Особый интерес вызывают синтетические полимерные материалы. Однако синтетические полимеры по своей структуре отличаются от тканей человеческого тела, что составляет риск возникновения асептического воспаления, реакции отторжения и может препятствовать восстановлению поврежденной ткани. Полимерным материалам свойственно деформироваться и по прошествии определенного промежутка времени они могут растягиваться и терять эластичность и упругость (Rushton N., Dandy D.J, Naylor CP. The clinical, arthroscopic and histological findings after replacement of the anterior cruciate ligament with carbon-fibre. J. Bone Joint Surg. Br. 1983, May; 65(3), p. 308-3099; Bolton C.W, Bruchman W.C. The GORE-TEX expanded polytetrafluoroethylene prosthetic ligament. An in vitro and in vivo evaluation. Clin. Orthop. Relat. Res. 1985, Jun; (196), p. 202-213).

В связи с этим важно, чтобы имплантируемые материалы наряду с выполнением функций поврежденной соединительной ткани способствовали ее регенерации. Например, искусственные связки должны способствовать восстановлению собственных связок, костные имплантаты должны способствовать восстановлению костной ткани, а сетчатые имплантаты, устанавливаемые при операции грыжи, должны способствовать восстановлению опорного каркаса брюшной стенки. В настоящее время нет четкого понимания процессов, обеспечивающих восстановление собственной соединительной ткани в области дефекта. Известно, что в этих процессах в организме принимают участие множество цитокинов, ростовых факторов, что в область дефектов мигрируют клетки-предшественники и эта миграция управляется цитокинами, что в области дефекта происходит дифференцировка клеток и они сами сигнализируют осуществление процессов миграции, пролиферации, дифференцировки. В результате всех этих процессов формируется система с множественными обратными связями. Детально разобраться в этих процессах в конкретных случаях пока не представляется возможным, поэтому при разработке новых материалов стараются обеспечить направленность процессов регенерации. Например, стараются обеспечить кондуктивные и адгезионные свойства материалов, чтобы клетки могли мигрировать в область дефекта для инициирования процесса образования новой ткани.

Известен способ обработки поверхности искусственных протезов из полиэфира, в частности из полиэтилентерефталата, с целью сообщения им способности к имитации живых материалов путем облегчения адгезии клеток и развития фибробластов после имплантации (RU 2339407, МПК A61L 27/34, A61L 27/54, A61F 2/08, опубл. 27.11.2008). Способ обработки включает одну стадию прививки биологически активных полимеров или сополимеров к полиэфирной поверхности протезов, причем эта стадия прививки состоит в осуществлении окисления поверхности с образованием пероксидных соединений путем озонирования с последующей стадией радикальной полимеризации раствора мономера. В результате предложенного способа на поверхности волокон протеза формируется адгезивная полимерная пленка, которая способствует повышению кондуктивных свойств протезов.

Недостатком этого способа является то, что при имплантации такого протеза в организм регенерат формируется лишь на поверхности полиэфирных волокон, не образуя цельной структуры утраченных тканей. Это указывает на недостаточность кондуктивных свойств и регенерационной способности имплантата.

Известен способ обработки протезной связки раствором коллагена (патент FR 2.651.994, МПК A61F 2/08, опубл. 22.03.1991), где волокна коллагена ориентируют вдоль продольной оси связки с целью обеспечения эффективного заселения протеза фибробластами и достижения благоприятного направления ее заполнения живой соединительной тканью.

Недостатком способа является слабая эффективность регенерации, которая локализуется только вблизи волокон. Этот недостаток можно объяснить тем, что согласно предложенному способу миграция улучшена только на полимерных волокнах, что не обеспечивает регенерацию самой связки в объеме. Более того, в результате быстрой резорбции тонкого слоя коллагена с полимерных волокон (1 неделя) эффект улучшения кондуктивного свойства после такой обработки непродолжителен и недостаточен для положительного эффекта.

Наиболее близким к заявляемому способу повышения регенерационного потенциала имплантатов для восстановительной хирургии соединительной ткани является способ повышения регенерационного потенциала сетчатого эндопротеза из синтетических волокон, согласно которому волокна протеза, выполняющие опорную функцию, покрывают биорезорбируемым биополимером поли-3-гидроксибутиратом (ПГБ) молекулярной массой от 300 до 1500 кДа для создания на их поверхности кондуктивного слоя (RU 2316290, МПК A61F 2/00, D06M 16/00, опубл. 10.02.2008 - прототип). Достоинством способа-прототипа является длительное время резорбции ПГБ (1-4 мес), которое позволяет обеспечить длительное сохранение кондуктивных свойств на волокнах, покрытых ПГБ.

Недостатком известного способа, принятого за прототип, является то, что кондуктивные свойства и регенерационный потенциал сосредоточены только на поверхности волокон сетчатого биопротеза, в результате регенерат локализуется вблизи поверхности волокон, что ограничивает регенерационный потенциал протеза.

Задачей настоящего изобретения является создание такого способа повышения регенерационного потенциала имплантатов для восстановительной хирургии соединительной ткани, который позволит многократно увеличить поверхность имплантата, обладающую кондуктивными свойствами, и приведет к существенному повышению сорбции сигнальных молекул регенерации и усилению миграции клеток по всему объему имплантата.

Решение поставленной задачи достигается предлагаемым способом повышения регенерационного потенциала имплантатов для восстановительной хирургии соединительной ткани, включающих опорную конструкцию и кондуктивный слой, согласно которому кондуктивный слой создают путем размещения в пространстве между элементами опорной конструкции имплантата и вокруг нее кондуктивного материала в виде трехмерной волокнистой структуры из биорезорбируемых нано- и микроволокон биополимера.

Использование кондуктивного материала в виде нано- и микроволокон для размещения в пространстве между элементами опорной конструкции и вокруг них позволяет многократно увеличить удельную поверхность кондуктивного слоя имплантата, определяющую его регенерационный потенциал. Это позволит увеличить сорбцию сигнальных молекул регенерации (морфогенетические белки, цитокины) и усилить миграцию клеток по всему объему имплантата, а не только на поверхности элементов его опорной конструкции, как это осуществляется в прототипе. Все это приведет к значительному увеличению регенерационного потенциала имплантатов и обеспечит условия более быстрого формирования в тканевом дефекте прочного и морфологически оформленного соединительнотканного регенерата в сравнении с прототипом.

В качестве материала опорной конструкции биоимплантата могут использоваться, например, полиэтилентерефталат (ПЭТФ), сверхвысокомолекулярный полиэтилен (СВПЭ), полиамид (ПА), политетрафторэтилен (ПТФЭ), полипропилен (ПП), углеродные волокна, металлы, а также механически прочные биорезорбируемые материалы с длительным сроком биодеградации, превышающим сроки формирования и структурно-функциональной перестройки соединительнотканного регенерата. Нано- и микроволокна, размещенные в объеме между элементами опорной конструкции и вокруг нее, могут быть изготовлены из коммерчески доступных полиоксиалканоатов (например, ПГБ и сополимеры на его основе), полилактида и его сополимеров, полигликолида и его сополимеров, поливинилпирролидона, коллагена, фибрина и других полимеров, а также их комбинаций. Высокая пористость с большой удельной поверхностью материала из нано- и микроволокон дает возможность для его избирательной активации сигнальными молекулами дифференцировки клеток.

Размещение кондуктивного материала в пространстве между элементами опорной конструкции имплантата и вокруг нее по предлагаемому способу создает дополнительные возможности для модификаций упорядоченного расположения опорных волокон протеза и тем самым для регуляции регенерационным процессом, для согласования резорбции материала имплантата и регенерации соединительной ткани.

Изобретение поясняется следующими фигурами:

фиг. 1 - пример №1 реализации способа (биополимерный композитный имплантат для восстановления связок и сухожилий округлой формы);

фиг. 2 - пример №2 реализации способа (биополимерный композитный имплантат для пластики дефектов апоневроза и связок уплощенной формы);

фиг. 3 - пример №3 реализации способа (биополимерный композитный имплантат для пластики костных дефектов);

фиг. 4 - структура волокнистого нетканого материла слоя из нано- и микроволокон полигидроксибутирата вокруг опорных элементов имплантата (сканирующая электронная микроскопия HITACHI ТМ-1000);

фиг. 5 - жизнеспособность фибробластических клеток в структуре волокнистого материала из нано- и микроволокон ПГБ (флуоресцентная микроскопия, микроскоп Leica DM 6000, окраска флуоресцентными ядерными красителями Hoechst 33342 и этидиумбромидом, × 400);

фиг. 6 - иммобилизация Ахиллова сухожилия в экспериментальной модели сухожильного дефекта у крыс;

фиг. 7 - экспериментальный тотальный дефект Ахиллова сухожилия;

фиг. 8 - экспериментальный образец биополимерного композитного имплантата по примеру №1 настоящего изобретения;

фиг. 9 - имплантация в дефект Ахиллова сухожилия экспериментального образца биополимерного композитного имплантата, изготовленного по примеру №1 настоящего изобретения.

фиг. 10 - гидрофильные свойства разработанного биополимерного композитного имплантата;

фиг. 11 - закрытие раны узловыми швами;

фиг. 12 - пластика дефекта Ахиллова сухожилия полиамидными нитями с поверхностью, покрытой полигидроксибутиратом согласно прототипу (контрольные наблюдения);

фиг. 13 - результат пластики дефекта Ахиллова сухожилия полиамидными нитями с покрытием из ПГБ (срок 5 недель эксперимента, контрольные наблюдения);

фиг. 14 - результат пластики дефекта Ахиллова сухожилия биополимерным композитным имплантатом по разработанному способу (срок 5 недель эксперимента, опытные наблюдения);

фиг. 15 - сравнительная макроскопическая характеристика 5-и недельных регенератов Ахиллова сухожилия в опытной и контрольной группах.

Примеры реализации предложенного способа повышения регенерационного потенциала имплантатов для восстановительной хирургии.

Пример 1

Биополимерный композитный имплантат, предназначенный для использования при восстановлении связок и сухожилий округлой формы (например, крестообразных связок коленного сустава, круглой связки головки бедра и сухожилий сгибателей пальцев). Имплантат состоит из четырех полиамидных (ПА) не связанных между собой плетеных нитей (1) диаметром 200 мкм, выполняющих роль осевых опорных нитей протеза, между и вокруг которых согласно изобретению размещен цилиндрический слой (2) диаметром 3 мм из нано- и микроволокон полигидроксибутирата (ПГБ) (фиг. 1).

Пример 2

Биополимерный композитный имплантат, предназначенный для закрытия дефектов апоневроза, в частности, при пластике грыжевых ворот живота, мышечных грыж и дефектов поврежденных связок опорно-двигательного аппарата, имеющих уплощенную форму. Имплантат состоит из плетеных в виде сетки волокон ПА (3) диаметром 200 мкм, выполняющей роль опорного каркаса биопротеза, около которых согласно изобретению размещен слой (2) толщиной 3 мм из нано- и микроволокон полигидроксибутирата (ПГБ) (фиг. 2).

Пример 3

Биополимерный композитный имплантат, предназначенный для использования при пластике костных дефектов. Имплантат состоит из литого ячеистого каркаса 4 связанных между собой перекрещивающихся балок диаметром 1 мм из биополимера полигидроксибутирата (ПГБ), выполняющего роль опорной структуры имплантата, около которых согласно изобретению размещен слой (2) толщиной 4 мм из нано- и микроволокон полигидроксибутирата (ПГБ) (фиг. 3).

На фиг. 4 приведена фотография, полученная на электронном микроскопе ТМ-1000, использованных в примерах 1-3 нано- (5) и микроволокон (6) из ПГБ. Окружающий элементы опорных конструкций имплантатов кондуктивный слой из нано- и микроволокон ПГБ получали методом электроформования из 5%-ного раствора ПГБ в хлороформе. Размещаемый кондуктивный слой представляет собой нетканый волокнистый материал с диаметром нитей от 100 до 900 нм.

Для проверки эффективности предложенного технического решения были проведены испытания изготовленных имплантатов in vitro и in vivo. Проводили испытания биосовместимости имплантатов, полученных по примеру 1 настоящего изобретения, в сравнении с прототипом (опорные нити, поверхность которых покрыта слоем ПГБ молекулярной массой от 300 до 1500 кДа) с использованием культуры первичных фибробластов, полученных из кожи человека. Для этого культуру фибробластов человека высевали на материал, расположенный в культуральной чашке в питательной среде Дальбекко, с добавлением 10 процентов эмбриональной сыворотки коров и через сутки оценивали количество живых клеток в материалах. Для определения живых клеток использовали одновременную окраску флуоресцентными ядерными красителями Hoechst 33342 (проникает в живые клетки) и этидиумбромидом (не проникает в живые клетки), которые позволяют в ходе микроскопического анализа определить по флуоресценции ядер клеток их жизнеспособность, характер клеточной гибели (некроз, апоптоз), а также деление клеток. Через сутки после посева клетки в слое нано- и микроволокон были живыми (зеленая окраска ядер клеток), количество погибших клеток 7 (желто-оранжевая флуоресценция) было не более 3%, как и в контроле в культуральных флаконах (фиг. 5). Микроскопический анализ распределения хроматина, характерного для митоза (метафаза, анафаза, телофаза, цитокинез), позволил оценить митотическую активность клеток на связке, модифицированной нано- и микроволокнами, которая составляла 5,2±0,7%, как и в контроле в культуральных флаконах. Открепление клеток от исследуемых связок и их подсчет с помощью камеры Горяева показали, что на модифицированной согласно предложенному способу связке клеток было в 100 раз больше, чем на обработанной согласно прототипу, что позволяет говорить о значительном увеличении регенерационного потенциала связки, модифицированной нано- и микроволокнами по заявленному способу.

Эффективность восстановления сухожильно-связочного аппарата с использованием имплантатов по разработанному способу была изучена на экспериментальной модели дефекта Ахиллова сухожилия у крыс породы Wistar, утрата которого в клинической практике ведет к инвалидизации пациента.

В эксперименте Ахиллово сухожилие 8 выделяли целиком от икроножной мышцы 9 до пяточного бугра 10 (фиг. 6). После его отсечения от икроножной мышцы 9 и пяточного бугра 10 образовывался тотальный сухожильный дефект 11 (фиг. 7). Учитывая преимущественно осевые механические напряжения, испытываемые Ахилловым сухожилием при функциональных нагрузках, и его округлую в сечении анатомическую форму, для восстановления целостности сухожилия в экспериментальном дефекте применили биополимерный композитный имплантат, изготовленный по примеру 1 настоящего изобретения, состоящий из четырех полиамидных (ПА) не связанных между собой плетеных нитей 1 диаметром 200 мкм, выполняющих роль осевых опорных нитей протеза, около которых согласно изобретению размещен слой (2) диаметром 3 мм из нано- и микроволокон ПГБ (фиг. 8).

Подготовленный имплантат устанавливали в дефект Ахиллова сухожилия 12 и с помощью его опорных нитей фиксировали узловыми швами 13 к икроножной мышце 9 и пяточному бугру 10 с сохранением физиологического тонуса икроножной мышцы (фиг. 9). В ране установленный имплантат демонстрировал высокую степень гидрофильности, быстро и равномерно пропитываясь кровью 14 (фиг. 10). Рану послойно ушивали узловыми швами 15 (фиг. 11).

Дефект Ахиллова сухожилия 11 в контрольных наблюдениях замещали 4-мя полиамидными не связанными между собой плетеными нитями 16, поверхность которых была покрыта ПГБ согласно прототипу, фиксированных узловыми швами 17 к пяточному бугру 10 и к икроножной мышце 9 с сохранением ее исходного физиологического тонуса (фиг. 12).

В послеоперационном периоде животные опытной группы демонстрировали адекватность пластического замещения сухожилия, активно и полноценно пользуясь оперированной конечностью с момента выхода их из наркоза. Через 5 недель эксперимента животные обеих групп выводились из опыта. На этом сроке в контрольных наблюдениях имело место потеря натяжения опорных нитей 16, происходящая в результате естественного постепенного нагрузочного «прорезывания» фиксирующих нити швов 17, которая привела к сокращению, деформации и развитию атрофии икроножной мышцы 9 с увеличением расстояния от ее края до пяточного бугра 10, замещенного тонким растянутым соединительнотканным регенератом 18 (фиг. 13), что характеризует функциональную несостоятельность выполненного пластического восстановления Ахиллова сухожилия. В опытных наблюдениях в отличие от контроля к 5-й неделе эксперимента образовался прочный соединительнотканный регенерат 19, надежно зафиксировавший икроножную мышцу 9 к пяточному бугру 10 до потери натяжения опорных нитей 1 с полноценным функционально-анатомическим замещением утраченного Ахиллова сухожилия (фиг. 14). Макроскопическая оценка полученных регенератов показала адекватное структурно-анатомическое соответствие Ахиллову сухожилию опытного регенерата 19 в отличие от контроля, где формировался тонкий удлиненный регенерат 18 за 5 недель не достигший сухожильной плотности и формы (фиг. 15).

Как видно из приведенных результатов, размещение согласно изобретению между и вокруг опорных нитей имплантата слоя нетканого волокнистого материала из нано- и микроволокон ПГБ обеспечило полноценное функциональное восстановление отсутствующего Ахиллова сухожилия с формированием анатомически-адекватных тканевых структур, заместивших резорбируемую часть имплантированной конструкции. При этом форма и структура волокнистого материала моделировали структуру регенерата, способствовали его более полному анатомо-механическому соответствию естественному сухожилию.

Таким образом, предлагаемый способ повышения регенерационного потенциала имплантатов для восстановительной хирургии соединительной ткани позволяет многократно увеличить поверхность имплантата, обладающую кондуктивными свойствами, что приводит к существенному повышению сорбции сигнальных молекул регенерации, усилению миграции клеток по всему объему имплантата и обеспечивает повышение регенерационного потенциала имплантатов.