Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ СОЗДАНИЯ НАНОРАЗМЕРНОЙ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ МЕТКИ НА ОСНОВЕ КОНЪЮГАТОВ НАНОЧАСТИЦ И ОДНОДОМЕННЫХ АНТИТЕЛ

1.

Способ создания наноразмерной диагностической метки на основе конъюгатов наночастиц и однодоменных антител может применяться для производства диагностикумов новых поколений, обеспечивающих высочувствительную детекцию анализируемых молекул - биологических маркеров заболеваний в биологических жидкостях и тканях.

Известен способ, включающий применение водорастворимых фотолюминисцентных наночастиц, имеющих на своей поверхности меркаптоундеканоевую кислоту. Недостатком данного метода являются ограниченные функциональные возможности диагностической метки в связи с применением только одного вида наночастиц - полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллов - и покрытий их поверхности только одним низкомолекулярным соединением - меркаптоундеканоевой кислотой, не обеспечивающим стабильности наночастиц в биологических жидкостях и тканях (WO 0017642(A2)).

Известен также способ, включающий применение водорастворимых фотолюминисцентных наночастиц состава CdSe/ZnS, имеющих на своей поверхности карбоксильную или аминогруппу, или карбоксильную и аминогруппу одновременно (WO2010/043053(Al)). В данном способе проводят подготовку поверхности наночастиц при помощи производных полиэтиленгликоля. Гидрофильный лиганд на поверхности таких наночастиц специфически связывается с нужной биомолекулой. Для определения анализируемой молекулы в образце используют однодоменные антитела из камелоидов. Этот способ выбран в качестве прототипа предложенного решения.

Основным недостатком способа является произвольно ориентированное конъюгирование антител с нанокристаллами, при котором значительное количество антител оказываются ориентированы таким образом, что их распознающие центры блокируются поверхностью нанокристаллов и не могут связаться с анализируемой молекулой в биологической жидкости или ткани. Указанный недостаток резко снижает чувствительность детекции анализируемых молекул с использованием диагностической метки, приготовленной согласно описанному способу. Другими недостатками данного способа является крупный конечный размер диагностической метки (около 30 нм), а также ограничение функциональных возможностей ее применения исключительно областью визуализации раковых клеток.

Технический результат изобретения заключается в расширении функциональных возможностей современных методов детекции биологических маркеров различных заболеваний, а также в повышении чувствительности детекции анализируемых молекул.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе создания наноразмерной диагностической метки на основе конъюгатов наночастиц и однодоменных антител, включающем подготовку поверхности наночастиц при помощи производных полиэтиленгликоля, в С-концевую часть однодоменного антитела вводят гексагистидиновую последовательность аминокислот с терминальным остатком цистеина, проводят очистку металлоаффинной хроматографией, далее восстанавливают межмолекулярные дисульфидные связи для получения мономерных фракций антител со свободными сульфгидрильными группами, поверхность наночастиц модифицируют низкомолекулярными соединениями, содержащими тиольные группы, с последующим их замещением производными полиэтиленгликоля с гидроксильными и тиольными группами; гидроксильные группы активируют, проводят конъюгацию между С-концевым остатком цистеина однодоменного антитела и активированной гидроксильной группой производного полиэтиленгликоля на поверхности наночастицы, при этом распознающие центры однодоменных антител ориентированы в сторону расположения анализируемых молекул.

Существует вариант, в котором в качестве наночастиц используют полупроводниковые нанокристаллы с разной длиной волны максимума флуоресценции.

Существует также вариант, в котором в качестве наночастиц используют магнитные наночастицы.

Возможен вариант, где в качестве наночастиц используют плазмонные наночастицы.

Возможен также вариант, где в качестве наночастиц используют одностенные нанотрубки.

Существует вариант, в котором в качестве наночастиц используют гибридные материалы, представляющие собой комбинации перечисленных наносистем.

Существует вариант, в котором наночастицы солюбилизируют в воде молекулами тиолсодержащих низкомолекулярных соединений и в дальнейшем модифицируют путем замещения молекул тиолсодержащих низкомолекулярных соединений производными полиэтиленгликоля.

Возможен также вариант, где в качестве первичного источника однодоменных антител используют особи семейства камелоидов или надотряда акул.

Существует вариант, в котором селекцию однодоменных антител проводят методом фагового дисплея.

Существует также вариант, в котором селекцию однодоменных антител проводят методом фагового дисплея при помощи хелперного фага КМ13.

Возможен вариант, где в С-концевую часть молекулы рекомбинантных однодоменных антител вводят гексагистидиновую последовательность аминокислот.

Возможен также вариант, где в С-концевую часть молекулы рекомбинантных однодоменных антител вводят терминальный остаток цистеина.

Возможен также вариант, где очистку однодоменных антител проводят методом металл-аффинной хроматографии.

Существует также вариант, в котором после очистки однодоменных антител проводят реакцию восстановления межмолекулярных дисульфидных связей при помощи трис-(2-карбоксиэтил)фосфина для получения мономерной фракции антител со свободными сульфгидрильными группами.

Возможен вариант, где реакцию восстановления межмолекулярных дисульфидных связей при помощи трис-(2-карбоксиэтил)фосфина проводят в течение 25-35 мин при температуре 20-25°C.

Существует вариант, в котором наночастицы модифицируют производными полиэтиленгликоля, имеющими в своем составе гидроксильную и тиольную группы.

Существует также вариант, в котором после модификации поверхности наночастиц производными полиэтиленгликоля, имеющими в своем составе гидроксильную и тиольную группы, конъюгирование наночастиц проводят через стадию активации поверхности при помощи N-(п-малеимидофенил)-изоцианата.

Возможен вариант, где стадию активации поверхности наночастиц при помощи N-(п-малеимидофенил)-изоцианата проводят в диапазоне значений pH 8.4-8.6 в течение 30-60 мин в темноте, при комнатной температуре и постоянном мягком перемешивании.

Возможен также вариант, где наночастицы модифицируют смесью двух производных полиэтиленгликоля, имеющих в своем составе гидроксильную и тиольную группы или амино- и тиольную группы.

Существует вариант, в котором после модификации поверхности наночастиц смесью двух производных полиэтиленгликоля, имеющих в своем составе гидроксильную и тиольную группы или амино- и тиольную группы, конъюгирование наночастиц проводят через стадию активации поверхности при помощи сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилата.

Существует также вариант, в котором стадию активации поверхности наночастиц при помощи сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилата проводят в диапазоне значений pH 7.1-7.3 в течение 55-65 мин в темноте, при комнатной температуре и постоянном мягком перемешивании.

На фиг. 1 изображена схема подготовки поверхности наночастиц и конъюгации наночастиц и однодоменных антител.

1 - неорганическая наночастица; 1.1 - наночастица, солюблизированная цистеином; 1.2 - наночастица, поверхность которой модифицирована производными полиэтиленгликоля; 1.3 - конъюгат наночастицы и однодоменных антител; 2 - однодоменное антитело; 3 - распознающий центр однодоменного антитела (часть молекулы однодоменного антитела, способная распознавать анализируемую молекулу - биомаркер заболевания); 4 - молекула цистеина; 5 - молекулы производных полиэтиленгликоля; 6 - аминокислотная последовательность, содержащая шесть остатков гистидина и С-концевой остаток цистеина, вводимые генно-инженерными методами в последовательность аминокислот молекулы рекомбинантных однодоменных антител для аффинной очистки (с использованием гексагистидиновой последовательности) и проведения конъюгации с наночастицами, используя экспонированный остаток цистеина; 7 - молекула оксида триоктилфосфина.

На фиг. 2 изображена наноразмерная диагностическая метка, приготовленная с использованием изложенного способа, а также ее состав и типичный размер.

1 - наночастица; 2 - однодоменное антитело; 3 - распознающий центр однодоменного антитела; 4 - молекулы производных полиэтиленгликоля на поверхности наночастицы; 5 - аминокислотная последовательность, содержащая шесть остатков гистидина и С-концевой остаток цистеина, вводимые генно-инженерными методами в последовательность аминокислот молекулы рекомбинантных однодоменных антител для аффинной очистки (с использованием гексагистидиновой последовательности) и проведения конъюгации с наночастицами (используя экспонированный остаток цистеина);

На фиг. 3 приведена фотография среза эпителиальных крипт кишечника при иммуногистохимическом окрашивании онкологического биомаркера СБА с помощью конъюгатов однодоменных антител анти-СЕА и квантовых точек с максимумом флюоресценции при 570 нм, позволяющих проводить дифференцированную идентификацию патологически измененной ткани, меченной конъюгатами (области изображения оранжево-красного цвета), от здоровой ткани, с которой конъюгаты квантовых точек и однодоменных антител не взаимодействуют.

Способ создания реализуется следующим образом. Наноразмерная диагностическая метка 1.3 (фиг. 1) на основе конъюгатов наночастиц и однодоменных антител состоит из наночастицы 1, для перевода которой в водную фазу на первом этапе используют низкомолекулярное тиолсодержащее соединение 4 (например, DL-цистеин). Далее, молекулу низкомолекулярного тиолсодержащего соединения 4 на поверхности нанокристаллов замещают производными полиэтиленгликоля 5, имеющими в своем составе тиольную группу для связи с поверхностью, гидрофобную алифатическую часть, остаток полиэтиленгликоля и концевую, экспонированную в раствор, гидроксильную или амино- или карбоксильную группу. Затем проводят активацию гидроксильной группы при помощи N-(п-малеимидофенил)-изоцианата, либо амино-группы при помощи сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилата (фиг. 1 - активация поверхности). Такие малеимидактивированные группы реагируют с сульфгидрильной группой остатка цистеина (ссылка 1) молекул рекомбинантных однодоменных антител с образованием конъюгата - наноразмерной диагностической метки 1.3 (фиг. 1).

Наночастицы 1 (фиг. 2) конъюгируют с однодоменными антителами 2 таким высокоориентированным образом, что распознающий центр однодоменного антитела 3 всегда ориентирован в сторону раствора, а не в сторону поверхности наночастицы, и, таким образом, не блокируется поверхностью наночастицы, а способен эффективно связывать анализируемую молекулу. Типичный размер создаваемой наноразмерной диагностической метки не превышает 11 нм.

В одном из вариантов, в качестве наночастиц используют полупроводниковые нанокристаллы состава «ядро-оболочка» CdSe/ZnS с различными длинами волны максимума флуоресценции (от 450 до 650 нм) и с квантовым выходом более 70%.

В другом варианте, в качестве наночастиц используют магнитные наночастицы состава Fe₂O₃ или кобальтсодержащие наночастицы.

В третьем варианте, в качестве наночастиц используют плазмонные наночастицы серебра и золота.

В четвертом варианте, в качестве наночастиц могут использоваться одностенные углеродные нанотрубки.

Также в качестве наночастиц используют гибридные материалы, представляющие собой комбинации перечисленных наносистем.

На первом этапе поверхность наночастиц модифицируют молекулой низкомолекулярного тиолсодержащего соединения (например, DL-цистеина) 4 (фиг. 1), что делает их растворимыми в воде. Далее, поверхность наночастиц модифицируют путем замещения молекул DL-цистеина производными полиэтиленгликоля 5, что придает им стабильность в водных растворах в течение более чем полугодового временного промежутка и стабильность в биологических жидкостях и тканях сроком до нескольких недель. В качестве первичного источника однодоменных антител используют особи семейства камелоидов или надотряда акул. Антитела, полученные из данных организмов, отличаются высокой стабильностью, малыми размерами, а также простотой получения.

Селекцию рекомбинантных однодоменных антител проводят методом фагового дисплея, что повышает специфичность распознавания ими анализируемых молекул.

Селекцию однодоменных антител проводят методом фагового дисплея при помощи хелперного фага КМ13, данный протокол обеспечивает быстрое получение высокоспецифичных клонов антител.

На следующем этапе, в С-концевую часть молекулы однодоменных антител вводят гексагистидиновую последовательность аминокислот 6 (фиг. 1), что значительно упрощает процедуру их очистки. Таким образом, очистку однодоменных антител проводят методом металл-аффинной хроматографии при помощи гексагистидиновой последовательностив С-концевой части молекулы антител.

В С-концевую часть молекулы однодоменных антител вводят терминальный остаток цистеина, что позволяет в дальнейшем провести конъюгацию тиольной группы цистеина с активированной группой на поверхности наночастиц с высокой специфичностью. После очистки однодоменных антител проводят реакцию восстановления межмолекулярных дисульфидных связей при помощи трис-(2-карбоксиэтил)фосфина для получения мономерной фракции антител со свободными сульфгидрильными группами, что в дальнейшем позволяет получить высокоориентированные наноразмерные диагностические метки.

Восстановление межмолекулярных дисульфидных связей при помощи трис-(2-карбоксиэтил)фосфина проводят в течение 25-35 мин при температуре 20-25°C, что позволяет получить фракцию мономерных антител.

Наночастицы модифицируют производными полиэтиленгликоля 5 (фиг. 1), имеющими в своем составе гидроксильную и тиольную группы. При этом реакцию конъюгации наночастиц проводят через стадию активации поверхности при помощи N-(п-малеимидофенил)-изоцианата. Реакцию проводят в диапазоне значений pH 8.4-8.6 в течение 30-60 мин в темноте при постоянном мягком перемешивании.

Наночастицы также модифицируют смесью двух производных полиэтиленгликоля, имеющих в своем составе гидроксильную и тиольную группы или амино- и тиольную группы. При этом реакцию конъюгации наночастиц с однодоменными антителами проводят через стадию активации поверхности наночастиц при помощи сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилата. Реакцию проводят в диапазоне значений pH 7.1-7.3 в течение 55-65 мин в темноте, при комнатной температуре и постоянном мягком перемешивании.

Наночастицы конъюгируют с однодоменными антителами высокоориентированным образом (фиг. 1 и фиг. 2) и, с помощью полученных наноразмерных диагностических меток, детектируют анализируемую молекулу в биологическом образце. В данном случае в качестве биологического образца выступают биологические жидкости (кровь, сыворотки крови, бронхиальные смывы, моча, спинно-мозговая жидкость) и срезы тканей (биопсийный материал) (фиг. 3).

Описанный способ расширяет функциональные возможности современных методов детекции биологических маркеров различных заболеваний по сравнению с прототипом за счет использования различных наноматериалов в качестве визуализирующего агента, а также повышает чувствительность детекции анализируемых молекул за счет высокой ориентированности однодоменных антител в приготовленных конъюгатах.

Литература

1. Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Second Edition 2008: Academic Press.