Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ F26 ПОСТОЯННОЙ ГИБРИДОМНОЙ ЛИНИИ КЛЕТОК МЫШИ MUS. MUSCULUS - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ОЛИГОПОЛИСАХАРИДНОМУ (ОПС) АНТИГЕНУ B. ABORTUS

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, в частности к гибридомной технологии, и касается получения моноклональных антител к олигополисахаридному (ОПС) антигену Brucella abortus. Изобретение может быть использовано в ветеринарии при создании диагностикумов и иммунохимических тест-систем для выявления антител к ОПС антигену Brucella в биологических жидкостях.

Бруцеллез - хроническая инфекционная болезнь всех млекопитающих, в том числе и человека, вызываемая бактериями рода Brucella, объединяющего следующие виды: В. melitensis, В. abortus, В. suis, В. neotomae, В. ovis, В. canis, В. сеti, B. pinnipedialis, В. microti, В. inopinata и входящего в семейство Brucellaceae, подкласс Rhizobiales, класс Альфа-Протеобактерии, подцарство Протеобактерии, царство Бактерии.

Болезнь имеет тенденцию к широкому распространению при скоплении животных и проявляется в виде массовых абортов, бесплодия, снижения продуктивности животных и жизнеспособности приплода.

Источником возбудителя инфекции являются больные животные. В стаде заражение происходит в основном алиментарным путем при употреблении животными контаминированных бруцеллами кормов и воды, а также при контакте с инфицированными абортированными плодами, плодными оболочками и водами, фекалиями, подстилкой и пр. Заражение поголовья благополучных по бруцеллезу стад или групп обычно происходит при введении в них больных животных.

Человек - вторичный хозяин, и вероятность заражения больным другого человека невысока. Заболевания людей, исключая случаи лабораторного заражения, регистрируют, как правило, при эпизоотиях. Заражаются люди преимущественно контактным (с больными животными или патологическим материалом, сырьем и продуктами животного происхождения от больных животных) или алиментарным путем.

У животных всех видов бруцеллез обычно протекает в хронической форме. Большинство особей переболевает бессимптомно, часть маточного поголовья абортирует. В стадах аборты иногда носят массовый характер. Аборт бруцеллезной этиологии сопровождается массовым и длительным выделением возбудителя с абортированным плодом, околоплодными водами, плацентой, истечениями из родовых путей. Больные животные выделяют бруцеллы также с мочой и молоком. При этом происходит контаминация возбудителем бруцеллеза кожных покровов и слизистых оболочек животных, полов, подстилки, кормов, предметов ухода за животными, пастбищ и водоемов.

Помимо абортов бруцеллез у животных характеризуется проявлением орхитов, эпидидимитов, эндометритов, маститов и бурситов.

Молодняк большинства видов сельскохозяйственных животных более устойчив к заражению бруцеллезом, чем взрослые особи. Клинические признаки болезни проявляются только при достижении животными половой зрелости.

Наиболее достоверными при диагностике болезни являются культуральный и молекулярно-генетические методы, в частности полимеразная цепная реакция, но они трудно осуществимы в полевых условиях, кроме того, наличие возбудителя в исследуемом материале, особенно при проведении прижизненной диагностики, не всегда однозначно [Bricker B.J. Differentiation of Brucella abortus bv. 1, 2, and 4, Brucella melitensis, Brucella ovis, and Brucella suis bv. 1 by PCR. / Bricker B.J., Hailing S.M. //J. Clin. Microbiol. - 1994. - V. 32. - P. 2660-2666].

Для массовой диагностики бруцеллеза животных применяются серологические методы. В Руководстве по диагностическим тестам и вакцинам Всемирной организации здравоохранения животных описаны доступные серологические тесты, рекомендуемые для применения при международной торговле животными [Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 2012]. Это твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА): непрямой (i-ELISA) и конкурентный (c-ELISA), роз-бенгал проба (РБП), метод флуоресцентной поляризации (МФП, FPA), а также - реакция связывания комплемента (РСК), хотя последний метод уже не рекомендуется применять. Следует отметить, что ни один из этих тестов не обладает оптимальной, а тем более достаточной для индивидуальной диагностики чувствительностью и специфичностью из-за ложноположительных реакций, которые обусловлены сходством строения гладкого липополисахаридного (s-ЛПС) антигена у грамотрицательных бактерий, в основном Yersinia enterocolitis и бруцелл. Перекрестные реакции осложняют диагностику и могут препятствовать проведению программ по борьбе с бруцеллезом.

Иногда в сыворотках крови, например свиней, могут присутствовать неспецифичные антитела, главным образом IgM, которые снижают специфичность стандартных тестов, направленных на выявление агглютининов. Кроме того, комплемент свиней взаимодействует с комплементом морских свинок, что обуславливает прокомплементарную активность, снижающую чувствительность РСК.

В целях дифференциации иерсиниозной и бруцеллезной инфекций были разработаны различные методы. Corbel M. предложил реакцию перекрестной адсорбции, аналогичный метод бы предложен Соколовой Е.Е. (дифференциацию проводят после абсорбции перекрестно-реагирующих сывороток лиофилизированным препаратом фенольной фракции штамма бруцелл; положительные результаты с иерсиниозным диагностикумом и снижение титров в РА с бруцеллезным свидетельствует о том, что исследуемая сыворотка является иерсиниозной) [Соколова Е.Е., 1986; Hendry D.M.F.D. Brucella antigen production and standardisation. / Hendry D.M.F.D., Corbel M.J., Bell R.A., Stack J.A. // Booklet 2499. Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, Lion House, Alnwick, Northumberland, UK, 1985].

Также были предложены различные модификации ИФА с ЛПС-антигенами, белками наружных мембран в комбинации с гладкими ЛПС [Weynants V. Characterization of smooth-lipopolysaccharide and О polysaccharides of Brucella species by competition binding assays with monoclonal antibodies. / Weynants V., Gilson D., Cloeckaert Α., Tibor Α., Denoel P.A., Godfroid F., Limet J.N., Letesson J.J. // Infect. Immun. - 1997. V. 65. - P. 1939-1943; Kittelberger R. Serological crossreactivity between Brucella abortus and Yersinia enterocolitica 0:9:111. Specificity of the in vitro antigen-specific gamma interferon test for bovine brucellosis diagnosis in experimentally Yersinia enterocolitica 0:9 infected cattle. / Kittelberger R., Reichel M., Joyce M., Staak C. // Vet. Microbiol. - 1997. - V. 57. - P. 361-371; Nielsen K. Serological discrimination by indirect enzyme immunoassay between the antibody response to Brucella sp. and Yersinia enterocolitica 0:9 in cattle and pigs. / Nielsen K., Smith P., Yu W., Nicoletti P., Jurgersen G„ Stack J., Godfroid J. // Vet. Immunol. Immunopathol. - 2006. - V. 109. - P. 69-78]. T. Di Febo с соавторами разработали c-ELISA, i-ELISA и усиленный диссоциацией лантанидный флуоресцентный иммуноанализ (DELFIA) для серологической диагностики бруцеллеза свиней, кроме того, была произведена оценка поляризационного флуоресцентного иммуноанализа (FPA) [Di Febo T. Development and evaluation of diagnostic tests for the serological diagnosis of brucellosis in swine. / Di Febo T., Luciani M., Portanti O., Bonfini В., Lelli R., Tittarelli M. // Veterinaria Italiana. - 2012. - V. 48(2). - P. 133-156.]

P. Munoz с соавторами предприняли попытку оценки пригодности ряда серологических тестов (РБП, РСК, i-ELISA, c-ELISA, РИД, встречного иммуноэлектрофореза и др.) и антигенов (эпитопы кора липида А, нативный гаптеновый полисахарид, рекомбинантный ВР26, цитозольные белки и др.) для дифференциальной диагностики бруцеллеза и иерсиниоза. Наилучшие результаты были получены с использованием тестов иммунопреципитации с нативным гаптеном или цитозольными белками [Muñoz P. Efficacy of several serological tests and antigens for the diagnosis of bovine brucellosis in the presence of false positive serological results due to Yersinia enterocolitica 0:9. / Munoz P., Marin C, Monreal D., Gonzales D., Garin-Bastuji В., Diaz R., Mainar-Jaime R., Moriyon I., Blasco J. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. - 2005. - V. 12. - P. 141-151].

В некоторых странах широко применяется бруцеллиновая кожная проба. Однако данный метод позволяет выявить больных животных только через определенное с момента заражения время и рекомендуется для применения в составе комплексного сероаллергического метода, являющегося более надежным способом диагностики бруцеллеза [Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 2012].

В доступной нам литературе сведения о штаммах гибридомных культур клеток, продуцирующих моноклональные антитела к ОПС антигену В. abortus, не найдены.

В задачу наших исследований входило - получить штамм постоянной гибридомной линии клеток, обладающий in vitro высокой продукцией моноклональных антител к ОПС антигену В. abortus, которые можно использовать в качестве «захватывающих» и детектирующих антител в ИФА.

Способ получения предложенного штамма состоит в следующем.

Предлагаемый штамм гибридных клеток получен путем слияния клеток перевиваемой культуры миеломы мыши P3-X63-Ag-8. 653 с лимфоцитами селезенки мыши линии BALB/c, иммунизированной двукратным внутрибрюшинным и однократным внутривенным введением ОПС антигена в концентрации 8,5 мг/см³ в 0,5 см³ фосфатно-солевого буферного раствора. ОПС получали методом термического кислотного гидролиза бакмассы В. abortus 19 в уксусной кислоте с последующей очисткой от белков и нуклеиновых кислот осаждением трихлоруксусной кислотой. На высоте иммунного ответа (через 3 дня после последней инъекции) проводили слияние спленоцитов иммунизированных мышей с клетками мышиной миеломы линии P3-X63-Ag-8.653.

Слияние клеток выполняли по стандартной методике с использованием ПЭГ с м.м. 1500. Соотношение клеток миеломы и лимфоцитов составляло 1:4 - 1:10. Селекцию гибридом проводили на среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Гибридомы культивировали на 96-луночных панелях производства фирмы «Nunc» на среде RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров в атмосфере, содержащей 5% СО₂.

Скрининг гибридом на продукцию специфических моноклональных антител проводили методом твердофазного ИФА с использованием ОПС антигена В. abortus 19 и антигенов Y. enterocolitica. Клонирование и рекдонирование клеточных культур проводили на 96-луночных панелях методом предельных разведений с использованием макрофагального фидерного слоя.

В результате был отобран и размножен клон клеток, продуцирующий моноклональные антитела к ОПС антигену В. abortus. Этот клон клеток был последовательно размножен в 96-, 24-луночных панелях, а затем в культуральных матрасах.

Культуральная жидкость была исследована на содержание специфических антител. Титр специфических антител в ИФА составлял 1:16-1:64. Препараты моноклональных антител получали трехкратным осаждением раствором сульфата аммония 50% насыщения с последующим диализом. Была определена видовая принадлежность и специфичность моноклональных антител методом ИФА.

Предложенный штамм обладает следующими свойствами.

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ. Клетки однородные, округлой формы с крупным овальным ядром, содержащим от 1 до 3, чаще 1-2 ядрышек. При посеве клетки равномерно распределяются на поверхности субстрата и в культуральной жидкости. Индекс пролиферации равен 5-6.

КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА. Клетки культивируют в среде RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров. Клетки размножаются в суспензии, частично прикрепляясь к поверхности пластикового культурального сосуда. Посевная концентрация 10000 клеток/см³ ростовой среды. Через 2-3 суток после образования суспензии 80% культуральной жидкости удаляют вместе с находящимися в ней клетками. К оставшимся клеткам добавляют такой же объем свежей питательной среды, pH 7,2-7,4. Кратность рассева 1:5. Периодичность субкультивирования - 1 раз в 3-5 суток. При посевной концентрации 20000 клеток/см² суспензия формируется через 2-3 суток. Индекс пролиферации равен 5-6.

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ В ОРГАНИЗМЕ ЖИВОТНЫХ. Клетки вызывают образование асцитов у линейных мышей BALB/c, обработанных пристаном за 7-10 дней до внутрибрюшинного введения 2-10×10⁶ клеток/мышь. Активность в ИФА асцитической жидкости составляет 1:2560-1:5120.

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА. Штамм продуцирует моноклональные антитела к ОПС антигену В. abortus, не взаимодействующие с Y. enterocolitica. Специфичность антител определяют в ИФА с использованием в качестве антигенов Brucella и Y. enterocolitica.

КОНТАМИНАЦИЯ. Контаминация простейшими, грибами, бактериями, микоплазмами, вирусами не выявлена.

ХРАНЕНИЕ КУЛЬТУР. Среда для замораживания: 70% среды RPMI-1640, 20% сыворотки эмбрионов коров, 10% диметилсульфоксида. Концентрация клеток в пластиковых криопробирках 1,5-2,0×10⁶ клеток/см³ среды. Режим замораживания: до минус 70°C - 1% мин, далее - жидкий азот (минус 196°C). Восстановление после замораживания: быстрое размораживание при 37°C, центрифугирование при 1200 об/мин 10 мин, ресуспендирование в ростовой среде. Жизнеспособность после размораживания 70-80%.

Штамм используют при изготовлении диагностической тест-системы для выявления антител к ОПС антигену В. abortus в биологических жидкостях.

Штамм гибридных клеток F26 является постоянной линией клеток с неограниченным сроком жизни, пригодной для биотехнологии при наработке препаратов.

Свойства штамма и продуцируемых им моноклональных антител отражены в конкретных примерах.

Пример 1. Иммунологические свойства моноклональных антител. Специфичность антител определяют методом иммуноферментного анализа в планшетах, сенсибилизированных антигенами: ОПС антигеном Brucella (нечетные ряды) и антигеном Y. enterocolitis (четные ряды).

Во все лунки (нечетных и четных рядов) планшета вносят культуральную жидкость клеток F26, содержащую моноклональные антитела, и инкубируют 1,5 часа при 37°C. Затем вносят конъюгат антител против иммуноглобулина IgG мыши с пероксидазой (изготовленный предприятием по производству бакпрепаратов НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН) в фосфатном буферном растворе, содержащем 0,05% твина-20, инкубируют в том же режиме и вносят субстратную смесь, содержащую пероксид водорода (Н₂О₂) и тетраметилбензидин (ТМБ). Избыток реагентов после каждой стадии иммуноферментного анализа промывают раствором детергента в фосфатно-солевом буферном растворе.

После развития окрашивания в течение 10 мин останавливают реакцию добавлением раствора серной кислоты и измеряют значения оптической плотности. Значения оптической плотности в лунках рядов, сенсибилизированных антигенами Brucella и Y. Enterocolitis, составили соответственно 1,635 и 0,035. Отношение оптических плотностей, превышающее 45, свидетельствует о том, что моноклональные антитела взаимодействуют только с ОПС антигеном Brucella и не обладают кросс-реактивностью по отношению к антигенам Y. enterocolitis.

Пример 2. Культивирование штамма in vitro и количественная оценка продукции моноклональных антител. Клетки штамма F26 культивируют в стеклянных матрасах при температуре 37,0°C в питательной среде, состоящей из среды RPMI-1640 и 10% сыворотки крови эмбрионов коров, антибиотиков (пенициллина и стрептомицина по 500000 ЕД/дм³). Оптимальная плотность посадки 2×10⁴ клеток на 1 см³ среды. Через 3-5 суток после образования суспензии культуральную жидкость частично удаляют и добавляют необходимое количество свежей питательной среды. Титр антител к ОПС антигену В. abortus в культуральной жидкости в ИФА составил 1:128.

Пример 3. Культивирование в организме животных и количественная оценка продукции моноклональных антител. Клетки штамма F26 в дозе 2-10×10⁶ клеток/мышь в 0,5 см³ фосфатно-солевого буферного раствора вводили в брюшную полость линейных мышей BALB/c, которым предварительно за 7 суток вводили 0,3 см³ пристана. На 10-14 сутки получали асцитическую жидкость, титр специфических моноклональных антител к ОПС антигену В. abortus в которой составил в ИФА 1:2560.

Пример 4. Проведение иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител. Препараты моноклональных антител получали из асцитической жидкости трехкратным осаждением раствором сульфата аммония 50% насыщения с последующим диализом.

На первом этапе поверхность лунок планшета для постановки ИФА сенсибилизировали препаратом моноклональных антител к ОПС антигену В. abortus, продуцируемых штаммом F26, из раствора с концентрацией 10 мкг/см³ при pH 7,2-7,4. Инкубацию проводили в течение 18-20 часов при температуре 4°C. После сенсибилизации твердой фазы избыток моноклональных антител удаляли и планшет промывали раствором детергента в фосфатно-солевом буферном растворе.

Вносили антигены термоинактивированной культуры В. abortus 19, содержащей ОПС антиген, и инкубировали в течение 1 часа при температуре 37°C.

На следующем этапе вносили исследуемые сыворотки крови животных (крупного рогатого скота, козы, иммунизированных В. abortus, В. melitensis соответственно), для контроля на специфичность вносили сыворотки крови крупного рогатого скота, иммунизированного антигеном Y. enterocolitica. Все контрольные и испытуемые пробы сывороток разводили 1:26 фосфатным буферным раствором, содержащим 0,1% твина-20, непосредственно в лунках планшета. Планшет закрывали крышкой и инкубировали в течение 1 часа при температуре 37°C.

В качестве детектирующих антител использовали моноклональные антитела к IgG крупного рогатого скота, меченные пероксидазой, и моноклональные антитела к IgG козы, меченные пероксидазой. Связывание моноклональных антител с пероксидазой хрена проводили методом, разработанным Wilson, Nakane после активации фермента перйодатом натрия [Immunofluorescence and related staining techniques /Ed. W. Knapp. - Elsevier: North-Holland Biomedical Press. - 1978. - P. 215-221]. Инкубацию моноклональных антител, меченных пероксидазой, проводили в фосфатном буферном растворе, содержащем 0,05% твина-20, в течение 1 часа при температуре 37°C.

Избыток реагентов после каждой стадии проведения ИФА удаляли и планшет промывали раствором детергента в фосфатно-солевом буферном растворе.

Учет реакции проводили по изменению оптической плотности анализируемых образцов по сравнению с контрольными образцами, не содержащими антител к бруцеллезным антигенам, после добавления субстратной смеси, состоящей из ТМБ и Н₂О₂. Положительными считали пробы, оптическая плотность которых в три и более раз превышала оптическую плотность контрольных образцов.

При проведении исследования 20 проб сывороток крови крупного рогатого скота, реагирующих в РСК и РА, установили, что антитела к ОПС антигену В. abortus выявлены во всех пробах. Две контрольные сыворотки животных, иммунизированных В. melitensis, проявили высокую активность в ИФА-анализе. При исследовании 6 проб сывороток, содержащих антитела к антигенам Y. enterocolitica, уровень оптической плотности не превысил уровень отрицательного контроля более чем в два раза, что позволяет отнести данные сыворотки к отрицательным в отношении бруцеллеза.

Предложенный штамм F26 гибридных клеток в 2013 году апробирован с положительным результатом в Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко» (ГНУ ВИЭВ) и в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»).

Технико-экономическое обоснование. Получен штамм F26 гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела к ОПС антигену В. abortus, характеризующийся следующими полезными свойствами:

- является постоянной линией клеток с неограниченным сроком жизни, пригодной для биотехнологии при наработке препаратов;

- обладает высоким уровнем продукции моноклональных антител. Титры антител в нативной культуральной жидкости составляли 1:16-1:64, в асцитической жидкости 1:2560-1:5120 в иммуноферментном анализе;

- моноклональные антитела специфичны к ОПС антигену В. abortus;

- моноклональные антитела не реагируют с антигенами Y. enterocolitica;

- моноклональные антитела, адсорбированные на твердой фазе, обеспечивают прочную фиксацию ОПС антигена В. abortus и специфичность иммуноферментного анализа при выявлении антител к ОПС антигену Brucella в биологических жидкостях.

Штамм F26 депонирован в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК (СХЖ РАСХН) ВИЭВ под №90.

Штамм F26 - продуцент моноклональных антител к ОПС антигену В. abortus, может найти применение при изготовлении иммуноферментной тест-системы для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота. Использование такой тест-системы позволит выявлять специфические антитела у животных, инфицированных как В. abortus, так и В. melitensis, что позволит повысить эффективность противоэпизоотических мероприятий, сократить сроки оздоровления хозяйств, неблагополучных по бруцеллезу животных.