СПОСОБ ИНАКТИВАЦИИ ПАТОГЕНОВ

Изобретение относится к медицинской и фармацевтической промышленности и может быть использовано в процессах получения инактивированных безопасных белковых препаратов из плазмы донорской крови человека или крови животных.

В числе инфекционных агентов, передающихся при трансфузии крови, плазмы донорской крови и препаратов из плазмы крови можно выделить вирусы, бактериальную микрофлору и паразиты. Особо опасными среди вирусов являются вирусы иммунодефицита человека, гепатитов B и C, цитомегаловируса человека. Роль этих агентов в структуре инфекционной патологии человека в последнее десятилетие возрастает в связи с изменением образа жизни, экологической обстановки, а кроме того, естественного процесса вирусной эволюции в человеческой популяции. Тем более, что за последнее время медики сталкиваются с выявлением все новых и новых вирусных инфекционных агентов, возможность инфицирования которыми при использовании белковых препаратов из плазмы человека и животных, предназначенных для трансфузии и терапии, особенно велика в силу ограниченности или невозможности диагностики вновь открытых, а тем более не известных еще вирусов.

Бактериальная же контаминация крови и ее продуктов до сих пор является одной из ведущих причин посттрансфузионных осложнений. Возможными источниками бактериальной контаминации считают следующее: коллекционные контейнеры, пластиковые трубки, раствор антикоагулянта, попадание микроорганизмов с кожных покровов донора, транзиторная бактериемия у донора. При этом грамотрицательная и грамположительная флора, как источник контаминации, встречается одинаково часто.

Поэтому, несмотря на предварительное и повторное диагностическое обследование доноров и введение на предприятиях службы крови условий обязательной карантинизации плазмы донорской крови человека, а также соблюдение стерильных условий забора крови, приготовления и хранения плазмы крови и препаратов из плазмы крови, потенциальный риск гемотрансмиссивных инфекций остается достаточно высоким.

В связи с этим, весьма актуальным является введение в процедуру заготовки препаратов из донорской крови человека и крови животных обязательных стадий инактивации инфекционных агентов. Тем более что Всемирная организация здравоохранения, учитывая все возрастающую потребность в плазме крови и препаратах из плазмы крови и увеличение числа случаев гемотрансмиссивных инфекций и посттрансфузионных бактериальных осложнений, ввела обязательное проведение процедур инактивации инфекционных агентов в процессе заготовки плазмы и препаратов из плазмы крови.

Учитывая вышесказанное, большое значение должно уделяться разработке надежных, доступных, универсальных способов инактивации широкого спектра инфекционных агентов в препаратах из плазмы донорской крови и плазмы крови животных.

К наиболее перспективным и современным методам инактивации патогенов в плазме и препаратах крови относятся методы фотодинамической инактивации [Н.Mohr, В.Lambrecht, “Process for inactivating viruses in blood and blood products” United States Patent 6348309, Foreign Application Priority Data, Sep.13, 1989], которые заключаются в обработке биологических жидкостей, содержащих инфекционные агенты, фотосенсибилизаторами под действием освещения в присутствии кислорода. Активные формы кислорода, производимые фотовозбужденными сенсибилизаторами под действием освещения, оказывают разрушающее действие на инфекционные агенты. Как правило, используемые фотосенсибилизаторы растворимы в биологических жидкостях.

Так, известен способ инактивации вирусов в крови и ее компонентах путем смешения биологической жидкости с фенотиазиновыми красителями и последующего облучения светом, за счет того, что краситель используется в концентрации 0.1-10 мкм, причем облучение осуществляют непосредственно в емкостях для сбора и хранения крови [Харальд Мор, Бернд Ламбрехт, Пат. RU 2036235 от 1992 г.].

Существенным недостатком известного метода инактивации инфекционных агентов является использование красителей в виде раствора в биологических жидкостях. В этом случае после процесса инактивации патогенов, несмотря на использование стадии фильтрации при помощи специальных фильтров для удаления красителя, в целевом продукте частично остается краситель, а также продукты его возможной фото-деструкции. Сложность и неполнота отделения фотосенсибилизатора, по всей видимости, связана с высокой вязкостью инактивируемых жидкостей.

Принимая во внимание генотоксичные и цитотоксичные свойства большинства используемых в настоящее время красителей, становится ясна проблематичность использования таких препаратов для множественной трансфузии.

Тем более процедура удаления красителя из реакционной смеси после процесса инактивации становится совсем уж проблематичной в случае использования красителей для инактивации больших объемов пулированной плазмы или в масштабной технологической схеме процесса выделения и очистки препаратов из плазмы крови, таких как альбумин, иммуноглобулин, фетопротеин и других.

Известен способ инактивации патогенов в больших объемах пулированной плазмы [Патент RU 2040260 от 1991.12.27], который представляет собой обработку плазмы в течение 10 часов растворителем и детергентом в виде эмульсии. В качестве растворителя применяется 1% три-N-бутилфосфат (TNPB), а детергентом является 1% Тритон Х-100. Инактивация патогенов в этом случае заключается в разрушении липидной мембраны патогенов под действием химических реагентов. После процесса инактивации детергент и растворитель, содержащие инактивирумые патогены, отделяют от водной фазы, используя, прежде всего, метод экстракции их в растительное или органическое масло, например соевое или касторовое. Затем производят отделение органической фракции от водной фракции методом длительного расслоения и дальнейшее хроматографическое отделение следов органических реагентов из биологической жидкости с использованием аффинных сорбентов.

Из пулированной плазмы, инактивированной сольвент/детергентным методом, затем выделяют белковые компоненты путем осаждения этиловым спиртом по Кону.

Следует отметить, что данный способ имеет ряд существенных недостатков. Прежде всего, технологический процесс сольвент/детергентной инактивации занимает очень длительное время. Технологический процесс инактивации связан с большими объемами пулированной плазмы, из которой выделяют лишь незначительное количество лечебных белковых препаратов.

Недостатком также является то, что отделение используемых химических реагентов из инактивируемой плазмы - очень трудоемкий процесс, предполагающий использование сложной аппаратуры и, к сожалению, весьма ненадежный. Зачастую целевые продукты после процедуры инактивации и отделения органических реагентов содержат диагностируемые количества примесей растворителя и детергента, что весьма ограничивает использование данного метода для инактивации пулированной плазмы. Так, например, нежелательно использовать такую плазму или препараты из нее, если речь идет о множественных трансфузиях, а также в случае, если плазма переливается ребенку, поскольку в этом случае реципиенту вместе с инактивированной плазмой попадают ощутимые количества не желательных примесей химических реагентов.

Известно техническое решение, использующее твердофазные, не растворимые в водных средах фотосенсибилизаторы. Таковым является способ инактивации оболочечных вирусов, используя фотосенсибилизаторы-фуллерены в виде суспензии мелких кристаллических частиц. Фуллерены характеризуются высокой эффективностью генерирования активных форм кислорода при облучении светом, не токсичны, не растворимы в водной фазе и обладают высокой фотостабильностью [Kasermann F. and Kempf С. Photodynamic inactivation of enveloped vimses by buckminsterfullerene. Antiviral Res. 1997, v.34, p.65-70].

Способ заключается в смешивании частиц кристаллического фуллерена, с биологическими жидкостями, последующим насыщении смеси молекулярным кислородом путем барбатирования в жидкость и облучении светом вплоть до полной инактивации вирусов. В известном способе фотосенсибилизатор используется в виде суспензии мелких частиц фуллерена, которые получаются обработкой кристаллического фуллерена ультразвуком и практически не растворимы в водных средах.

Однако нами было установлено, что на скорость процесса инактивации вирусов в этом случае существенное влияние оказывает размер частиц суспензии кристаллического фуллерена. А именно эффективность процесса инактивации увеличивается по мере уменьшения размера частиц фотосенсибилизатора. В частности, оптимальным размером для такого фотосенсибилизатора является диаметр частиц менее 1 мкм. Процесс же инактивации с использованием более крупных частиц фотосенсибилизатора проходит менее эффективно из-за уменьшения суммарной поверхности частиц фотосенсибилизатора. В связи с этим следует заметить, что использование в качестве сенсибилизатора частиц фуллерена размером менее 1 мкм имеет ряд существенных недостатков, ограничивающих применение известного метода.

Прежде всего, в этом случае в процессе инактивации наблюдается агломерация мелких частиц кристаллического фуллерена в вязких биологических средах, содержащих высокое количество белков (плазма донорской крови, препараты из плазмы донорской крови и так далее), что снижает эффективность процесса инактивации и, в свою очередь, приводит к неполноте инактивации патогенов.

Другим недостатком, ограничивающим применение этого способа, является трудоемкость процесса отделения мелких частиц фотосенсибилизатора из вязкой биологической жидкости после процесса фотодинамического воздействия. Процесс отделения использованного мелкодисперсного фотосенсибилизатора от биологической жидкости осуществляется с помощью высокоскоростного центрифугирования или фильтрации через мелкопористые фильтры. Также недостатком способа является необходимость барботирования кислорода в среду биологической жидкости. Учитывая тот факт, что плазма донорской крови содержит большое количество белков, барботирование кислорода в белковую среду приводит к образованию пены на поверхности жидкости. Образование пены, с одной стороны, приводит к частичной денатурации белков, с другой стороны, снижает эффективность поглощения излучения фотосенсибилизатором, а также мешает проведению процесса в целом.

Также известен способ фотодинамической инактивации вирусов и клеток с помощью не растворимого в воде углеродного фотосенсибилизатора, заключающийся в том, что в качестве фотосенсибилизатора используют полиэдральные многослойные наноструктуры [Патент RU №2291700, от 20.11.2002, Мак А.А., Киселев О.И. и др]. Указанные наноструктуры (торговая марка - Астралены) относятся к фуллероидному типу и обладают способностью при фотовозбуждении генерировать активные формы кислорода, которые выступают как агенты, инактивирующие патогены.

Недостатком известного способа также является малый размер частиц фотосенсибилизатора (еще меньше, чем в вышеприведенном способе), - астралена (60-200 нм), что ограничивает применение известного метода. Прежде всего, из-за снижения эффективности фотосенсибилизатора ввиду агломерации мелких частиц астралена в вязкой белковой среде и соответственно снижения способности фотосенсибилизатора к инактивации патогенов, а также с техническими сложностями последующего отделения твердофазного фотосенсибилизатора с размером частиц в десятки и сотни нанометров от биологической жидкости. Также недостатком данного способа является невысокая эффективность генерации синглетного кислорода Астраленом по сравнению с фуллереном [Квантовая электроника, 2008, Т.38, №3, С.280-285].

Наиболее близким по техническому решению является способ инактивации вирусов в биологической жидкости (аллантоисной жидкости куриного яйца) [«Оптический журнал, 2009, стр.97-107]. Указанный способ заключается в смешивании биологической жидкости в присутствии кислорода с углеродным фотосенсибилизатором, представляющим собой фуллерен, нанесенный на твердофазный носитель при одновременном облучении смеси оптическим излучением.

Однако данный способ имеет существенные недостатки, заключающиеся прежде всего в том, что твердофазный фотосенсибилизатор содержит большое количество фуллерена. Высокое содержание фуллерена удорожает стоимость фотосенсибилизатора. Следующим недостатком данного способа является низкая эффективность инактивации вирусов, которая, с одной стороны, проявляется в увеличении длительности процесса инактивации (до 4 часов), а с другой стороны, предполагает использование высокого содержания фотосенсибилизатора.

Сущность изобретения.

Целью изобретения является увеличение эффективности процесса фотодинамической инактивации патогенов в биологических жидкостях с использованием твердофазного фотосенсибилизатора на основе фуллерена.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе инактивации патогенов используют твердофазный фотосенсибилизатор, содержащий фуллерен от 0.01 вес.% до 3.0 вес.% на 1 г твердофазного носителя, реакционную среду дополнительно обогащают молекулярным кислородом при перемешивании с последующим отделением фотосенсибилизатора от реакционной среды.

Твердофазные носители могут быть выполнены в виде пластин, мембран, волокон, частиц и тому подобное. Носителями могут являться любые не растворимые в воде сорбенты органического происхождения, прежде всего сшитый полистирол. Также носителями могут являться матрицы неорганической природы, прежде всего силикагель.

Для нанесения фуллерена на поверхность носителя используются различные известные технологии. Так, нанесение фуллерена на поверхность носителя может осуществляться вакуумным напылением до слоя фуллерена различной толщины.

Нанесение фуллерена может осуществляться также из раствора фуллерена в органических растворителях, таких как толуол, хлористый метилен, гексан, и др., с последующим тщательным удалением растворителя из пор и с поверхности носителя многократным промыванием этиловым спиртом и вакуумированием при температуре 80°С в течение 3-4 часов до полного удаления растворителя. Также могут использоваться и любые другие комбинированные методы нанесения фуллерена на поверхность носителя.

Авторами было показано, что выбор способа нанесения фуллерена на поверхность носителя практически не влияет на эффективность полученного фотосенсибилизатора и его инактивирующую способность и определяется конструкционными особенностями носителя: пластины, мембраны, частицы, волокна и прочее. Так, например, если носитель используется в виде пластины, фуллерен наносят вакуумным напылением. На пористые мембраны, частицы, тонкие волокна целесообразнее наносить слой фуллерена путем пропитки их раствором фуллерена в органическом растворителе с последующей обработкой этиловым спиртом и высушиванием в вакууме. Полученные фотосенсибилизаторы, представляющие собой носители органической или неорганической природы с нанесенным на них слоем фуллерена, стерилизуются обработкой этиловым спиртом, автоклавированием или любой другой техникой, применяемой для стерилизации медицинского инвентаря. Фотосенсибилизатор помещается в стерильный бюкс и хранится в темноте для последующего использования.

В качестве источника освещения можно использовать ртутную лампу ДРШ-500 с водяным фильтром (L=10 см) и световым фильтром СЗС-26, светодиодные осветители и другие осветительные приборы со спектром излучения в видимой области.

Дополнительное обогащение реакционной смеси молекулярным кислородом проводят, пропуская стерильный кислород над поверхностью реакционной среды. Для этого используют герметичные термостатируемые емкости с крышкой, снабженной входным и выходным отверстием для кислорода и замещаемого им воздуха. Термостатируемая емкость помещается на перемешивающую платформу, что способствует осуществлению массообмена между верхним и последующими слоями жидкости. Такое техническое решение позволяет производить дополнительное обогащение реакционной среды кислородом, не вызывая вспенивания биологической жидкости.

После процесса фотодинамической инактивации патогенов в биологической жидкости отработанный фотосенсибилизатор отделяют от реакционной среды путем фильтрации, седиментации, центрифугирования или сочетания перечисленных процедур.

Регенерацию твердофазного фотосенсибилизатора на основе фуллерена осуществляют путем последовательной обработки его 0.05 М едким натром, дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод, 0.05 М соляной кислотой и дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод. После этого фотосенсибилизатор сушат в вакуумном термошкафу при температуре 70°С до постоянного веса в течение 4 часов. После процедуры регенерации фотосенсибилизатор может использоваться процессе инактивации патогенов.

Преимуществом заявляемого способа инактивации патогенов относительно наиболее близкого технического решения является более высокая эффективность инактивации, обеспечиваемая совокупностью существенных признаков.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения.

Процесс инактивации патогенов проводится в термостатируемой емкости с крышкой, снабженной входным и выходным отверстием для кислорода и замещаемого им воздуха. Термостатируемая емкость помещается на перемешивающую платформу.

В термостатируемую емкость заливают 200 мл 10% раствора альбумина, содержащего 7.5 Log вируса гриппа, в качестве модельного раствора. Затем в сосуд помещают 2 г твердофазного фотосенсибилизатора, представляющего собой частицы силикагеля размером 20 мкм с нанесенным на него фуллереном в количестве 2,0 вес.% на массу твердофазного носителя, предварительно смоченного 20 мл физиологического раствора. Полученную суспензию тщательно перемешивают на перемешивающем устройстве в течение 15 мин при температуре 15°С. Затем емкость закрывают крышкой с входным и выходным отверстием и с помощью гибкого шланга на поверхность жидкости подают стерильный кислород при постоянном перемешивании. Через 15 мин включают освещение реакционной емкости. В качестве осветительного прибора используют ртутную лампу ДРШ-500 с водяным фильтром (L=10 см) и тепловым фильтром СЗС-26. Поток света направляется на поверхность реакционной смеси с помощью стеклянной призмы с ребром 10 см. Термостатируемый сосуд обеспечивает проведение процесса инактивации в температурном режиме 0-37°С, гарантирующем сохранение белков биологических жидкостей в нативном состоянии.

В результате спектральный диапазон освещения составляет 400-850 нм. Плотность мощности на образце W=60-65 мВт/см². рН реакционной смеси 6.8.

Затем отключают освещение и останавливают перемешивающее устройство. Процесс инактивации проводят в течение 30 мин.

Осадок фотосенсибилизатора отделяют от реакционной смеси на центрифуге при 4000 об/мин. Отбирают пробы из надосадочной жидкости и анализируют остаточную инфекционность раствора. Анализ исходной и остаточной инфекционности раствора проводили стандартными методами.

Исходная инфекционность 10,0% раствора альбумина - 7.5 Log.

Остаточная инфекционность 10,0% раствора альбумина - 0.0 Log.

Регенерацию твердофазного фуллеренсодержащего фотосенсибилизатора проводят следующим образом. Осадок фотосенсибилизатора в количестве 2 г после центрифугирования помещают в термостойкий стакан и заливают 100 мл 0.05 М раствора едкого натрия. Стакан помещают на магнитную мешалку и перемешивают суспензию в течение 3 часов. Затем фотосенсибилизатор отделяют на центрифуге при 4000 об/мин. Надосадочную щелочную жидкость сливают и осадок заливают 3-5 раз дистиллированной водой. Процедуру проводят на магнитной мешалке и с использованием центрифуги. Затем осадок фотосенсибилизатора заливают 0.05 М соляной кислотой 3-5 раз. Процедуру проводят на магнитной мешалке и с использованием центрифуги. Затем осадок фотосенсибилизатора промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод.

После этого фотосенсибилизатор сушат в вакуумном термошкафу при температуре 70°С до постоянного веса в течение 4 часов. После процедуры регенерации фотосенсибилизатор может использоваться в процессе инактивации патогенов.