СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ СМЕСИ ДНК И БЕЛКОВ ИЗ ЭПИМАСТИГОТНЫХ ФОРМ Trypanosoma cruzi

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для экстрагирования биологически активных веществ.

Известно, что простейшее TRYPANOSOMA CRUZI ингибирует развитие некоторых форм рака (см., например, Противораковый антибиотик круцин. Раздел П. Действие круцина на злокачественные опухоли экспериментальных животных и человека. Под ред. проф. Л.Б. Левинсона и Н.Г. Клюевой. Изд-во Московского университета, 1968, стр. 146-256). Описано действие дефензина α-1 человека на трипомастиготы T. cruzi in vitro (см. КЛЕЩЕНКО Ю.Е., КАРПЕНКО Л.П., ВИЛЛАЛТА Ф. БЮЛЛЕТЕНЬ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЫ, Издательство РАМН, т. 149, №6, с. 670-672, 2010). Установлено, что дефензин α-1 проявляет трипаноцидное действие на T. cruzi и инициирует фрагментацию ДНК паразита, что приводит к гибели трипаносом и снижению инвазирования культивируемых опухолевых клеток человека.

В этой связи важным является выделение из Т. cruzi субстанций на предмет изучения их онкопротекторной активности. Ключевым в решении этого вопроса является разработка метода экстракции активных биополимеров из клеток трипаносом.

В области биотехнологии известны различные способы экстрагирования целевых продуктов. Так, описан способ экстрагирования биологически активных веществ путем дезинтеграции биомассы многократным замораживанием и оттаиванием (см. RU 2381276 С2, СИДДХАНТА и др., 10.02.2010). Способ включает гомогенизацию сырья с получением экстракта, вакуумную фильтрацию экстракта, замораживание фильтрата с образованием массы и оттаивания полученной массы. Для удаления оттаявшей жидкости осуществляют сжатие продукта, полученного на стадии замораживания-оттаивания, и последующий отжим. Повторяют стадию замораживание-оттаивание и сжатие-отжим продукта. Полученный продукт растворяют в воде и сушат распылением для получения тонкодисперсного порошка.

Известен способ получения аналога рекомбинантного интерферона-γ человека, включающий культивирование штамма-продуцента Escherichia coli MH-1/pIFD10, разрушение клеток ультразвуком, удаление клеточного дебриса и хроматографию на колонке с сорбентом (RU 2326944 С2, Мирошников и др., 20.06.2008).

Недостатком таких и подобных методов является то, что в экстракт при полном разрушении биомассы поступает большое количество балластных компонентов, а кроме этого часть компонентов может инактивироваться.

Более щадящим способом экстракции является обработка микробной биомассы ферментом, разрушающим клеточную стенку. В случае бактерий - это лизоцим, разрушающий основной структурный компонент пептидогликан (Янковский Д.С.и др. Использование метода полимеразной цепной реакции для идентификации бактериального состава мультикомпонентных пробиотиков. Современная педиатрия, 6(46)/2012, стр. 65-68 - ближайший аналог). Недостатком метода является то, что он применим только в случае получения лизата из бактерий.

Наиболее близким к патентуемому является способ выделения лизатов, обладающих противораковой активностью, из эпимастиготных форм Trypanosoma cruzi, выращенных на питательной среде NNN (автор ЦЭЦЭГСАГЖАН БАТМОНХ. Противораковая активность in vivo лизированных эпимастигот Trypanosoma cruzi различных генетических линий. Автореферат дисс. к.м.н., М.: 2005. с. 1-17). Этот способ включает получение лизатов путем обработки клеток эпимастиготных форм трипаносом дистиллированной водой, что приводит к лизису благодаря низкому осмотическому давлению, однако полученные лизаты характеризуются повышенным содержанием белкового компонента.

Настоящее изобретение направлено на разработку новой технологии выделения биополимеров из эпимастиготных форм Т. cruzi.

Способ выделения биополимеров из эпимастиготных форм Т. cruzi, включает следующие операции:

- получение биомассы культуры Trypanosoma cruzi в эпимастиготной форме из штамма TPAP/MX/2002/Albarrada («Бюллетень экспериментальной биологии и медицине», т. 156, №7, 2013, стр. 82-84) путем выращивания на жидкой питательной среде NNN при температуре 29(±0,5)°С;

- отмывку полученной биомассы и концентрирование ее до содержания не менее 6×10⁸ клеток в 1 мл;

- введение в полученную концентрированную биомассу дефензина α-1 человека - синтетический препарат с аминокислотной последовательностью ACYCRIPACI AGERRYGY CIYQGRLW AFCC с молекулярной массой пептида 3,4 кДа в концентрации 20 мкг/мл до конечной его концентрации 3,97 мкМ и выдержку до образования пор в дилипидных мембранах, которая составляет около 24 часов;

- встряхивание полученной взвеси на шейкере с последующей выдержкой при комнатной температуре в течение не менее 24 часов;

- центрифугирование полученной среды с выделением биополимера в жидкой фазе.

Способ может характеризоваться тем, что перед введением дефензин α-1 человека в количестве 20 мкг разводят в 4 мкл 99,5% раствора диметилсульфоксида с последующим добавлением 0,5 мл забуференного физиологического раствора (ЗФР) pH=7,2.

Технический результат изобретения состоит в получении экстракта из объекта, относящегося к представителям простейших, при этом экстрагирование биополимеров производят селективно без разрушения клеточной структуры, вследствие чего полученный экстракт характеризуется пониженным содержанием белкового компонента.

Отличие от ближайшего аналога состоит в том, что после выращивания исходной биомассы Т. cruzi она обрабатывается дефензином α-1 человека по рекомендуемому режиму с последующим выделением искомого биополимера в жидкой фазе. Для этого полученная путем культивирования биомасса Т. cruzi центрифугируется, промывается ЗФР, ресуспендируется и доводится до концентрации не менее 6×10⁸ клеток в 1 мл. Дефензин α-1 человека 20 мкг разводится в 4 мкл 99,5% раствора диметилсульфаксида и затем добавляется 0,5 мл ЗФР pH=7,2. Раствор дефензина добавляют к 1 мл биомассы до конечной его концентрации 3,97 мкМ, выдержку до образования пор в дилипидных мембранах, которая составляет около 24 часов. После встряхивания на шейкере взвесь оставляют на 24 часа при комнатной температуре, затем центрифугируют и получают искомый биополимер в жидкой фазе.

Полученный экстракт тестируют на содержание белка и нуклеиновой кислоты. Ниже приведены также аналогичные результаты для описанных в аналогах рутинных методов экстрагирования активного компонента.

Пример. Для получения биологически активной субстанции проводилось экстрагирование из Trypanosoma cruzi штамма TPAP/MX/2002/Albarrada. Сравнивали три метода экстракции: многократное замораживание и оттаивание, ультразвуковую дезинтеграцию биомассы и патентуемую обработку дефензином α-1 человека.

Культура Т. cruzi в эпимастиготной форме получена на жидкой питательной среде NNN модифицированной М681 при температуре 29°C. Полученная биомасса отмыта и сконцентрирована до 6,26×10⁸ клеток в 1 мл.

При получении экстракта путем замораживания и оттаивания биомассу помещали на 30 мин в морозильную камеру с температурой -70°C. Оттаивание проводили в паровой бане при температуре 37°C в течение 40 минут. Процедуру повторяли пятикратно.

Ультразвуковую дезинтеграцию культуры проводили в приборе Branson Digital Sonifler Model 250 при следующем режиме: амплитуда волн - 60% от максимальной проектной мощности прибора; количество пульсаций - 2; продолжительность пульсаций - 59 сек; интервал между пульсациями - 1 сек.

Получение экстракта проводили с использованием синтетического препарата дефензина α-1 человека с аминокислотной последовательностью: ACYCRIPACI AGERRYGY CIYQGRLW AFCC и молекулярной массой 3,4 кДа в рабочей концентрации 20 мкг/мл.

Процедуру экстрагирования осуществляли согласно описанной выше методике. После обработки биомассы материал микроскопировали. Установлено, что полная фрагментация клеток достигалась при обработке их ультразвуком, частичная - при замораживании и оттаивании. Обработка же дефензином изменяла только морфологию клеток. После такой обработки ширина амастигот увеличивалась более чем в три раза, с 0,84±0,13 до 3,31±0,67 мкм.

Пример. Для анализа содержания белка и ДНК использовали микроспектрофотометр NanoDrop 2000 с, Thermo Scientific с диапазоном длин волн 190-840 нм, предусматривающий методику пьедестального анализа, не требующего кювет и капилляров. Образец объемом 2 мкл наносили на неподвижный модуль прибора -пьедестал. Сверху на каплю опускали эмиссионный считывающий световой модуль прибора, в результате чего из образца формировался столбик жидкости. Прибор подсоединяли к компьютеру с установленным программным обеспечением The Thermo Software IQ program, с помощью которого анализировали полученные измерения.

Полученные экстракты сравнивались по содержанию в них белка и ДНК. При этом оказалось, что по уровню ДНК образцы существенно не отличались, в то время как по содержанию белка экстракт, полученный с использованием дефензина, имел более низкие показатели (23,58 мг/мл), чем экстракты, полученные двумя другими способами (30,25 мг/мл и 30,8 мг/мл). Если принять, что все экстракты содержали биологически активную субстанцию, то можно признать, что из трех образцов действие должно быть более выражено в том, где содержится меньшая доза белкового компонента, т.е. образец, полученный с использованием дефензина α-1 человека и подвергнутый селективной экстракции при фильтрации через поры в цитоплазматической мембране.

Таким образом, приведенные экспериментальные данные подтверждают, что патентуемый способ позволяет обеспечить достижение технического результата, а именно получить экстракт биополимера из эпимастиготных форм Trypanosoma cruzi с пониженным содержанием белкового компонента.