Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ СОЧЕТАННЫХ ПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ У ЖЕНЩИН

Способ прогнозирования риска развития сочетанных пролиферативных заболеваний репродуктивной системы у женщин

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано в гинекологии для прогнозирования риска развития сочетанных пролиферативных заболеваний репродуктивной системы, включающих сочетания миомы матки с эндометриозом и гиперпластическими процессами эндометрия.

Несмотря на многолетнюю историю изучения проблемы пролиферативных заболеваний и доброкачественных опухолей матки в последние десятилетия во всем мире отмечается рост частоты встречаемости миомы матки, эндометриоза и гиперпластических процессов эндометрия, причем многие авторы отмечают высокую частоту (до 85%) сочетания этих болезней. Об этом свидетельствуют схожий преморбидный фон, идентичные клинические проявления, а также некоторые клинико-патогенетические особенности миомы, эндометриоза и гиперпластических процессов эндометрия. При сочетании пролиферативных заболеваний нарушаются многие функции репродуктивной системы, являясь частой причиной как первичного, так и вторичного бесплодия, выраженного болевого синдрома, нарушения функции соседних органов, анемии как следствие кровотечения, осложнения беременности, родов и послеродового периода, что в совокупности приводит к временной, а нередко и длительной потери трудоспособности. Несмотря на значительное количество работ, посвященных изучению преморбидного фона, патогенеза, диагностике и лечению изолированных форм пролиферативных заболеваний матки, актуальным является изучение сочетания миомы матки с эндометриозом и гиперпластическими процессами эндометрия, так как многие вопросы остаются неуточненными, трактовка полученных результатов неоднозначной и тактика ведения больных противоречивой. До настоящего времени нет четких критериев, позволяющих прогнозировать повышенный риск развития сочетанных пролиферативных заболеваний репродуктивной системы [Адамян Л.В. Эндометриозы. /Л.В Адамян., В.И. Кулаков., E.H. Андреева /Руководство для врачей. М.: Медицина. - 2006. - 416 с.].

Пролиферативные заболевания матки относятся к мультифакториальным заболеваниям, которые развиваются в результате комплексного действия генов, гормонов, факторов роста, цитокинов при воздействии неблагоприятных факторов окружающей среды [Аксенович, Т. И. Картирование генов, детерминирующих распространенные болезни человека /Т. И. Аксенович //Медицинская генетика. - 2006. - Т. 5, №2. - С. 11-15.]. В настоящее время во всем мире идет активное молекулярно-генетическое исследование пролиферативных заболеваний матки с использованием различных методов.

Цитокины являются посредниками межклеточных взаимодействий, регулируют кроветворение, иммунный ответ, клеточный цикл, участвуют во многих физиологических и патологических процессах. Цитокины редко, если вообще действуют в одиночку. Как правило, наблюдаемый конечный эффект является результатом комплексного действия цитокинов, иногда обладающих антагонистическими свойствами. В последние годы большое внимание уделяется роли цитокинов в патогенезе пролиферативных процессов матки. К цитокинам относят хемокины, интерлейкины, факторы некроза опухоли.

Нарушение продукции цитокинов, как их гипо- и гиперпродукция, а также нарушение процесса их рецепции способны приводить к различным заболеваниям. Развивающийся при заболеваниях цитокиновый дисбаланс, в свою очередь, способен выступать фактором, отягощающим их течение [Uterine cavity matrix metalloproteinases and cytokines in patients with leiomyoma, adenomyosis or endometrial polyp /Inagaki N., Ung L., Otani T., Ikeo T. //Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 2003. Vol.111, №2. P. 197-203.].

Известен метод для диагностики и прогнозирования онкологических заболеваний, основанный на изучении соматических мутаций в гене многофункционального опухолевого супрессора (MTS) в случае неоплазий человека. Патент США №2164419, 27.03.2001. «Ген MTS, Мутации данного гена и способы диагностики злокачественных опухолей с использованием последовательности гена MTS» (Мириад Дженетикс, инк. (US) и др). Изобретение относится к мутациям гена MTS в зародышевой линии и использованию данных мутаций для диагностики предрасположенности к таким формам рака, как меланома, окулярная меланома, лейкоз, астроцитома, глиобластома, лимфома, глиома, лимфома Ходжкина, множественная миелома, саркома, миосаркома, хлоангиосаркома, чешуеклеточная карцинома, хронический лимфоидный лимфолейкоз, а также опухоли поджелудочной железы, яичников, матки, семенников, почек, желудка, ободочной и прямой кишки. Изобретение также имеет отношение к терапии тех неоплазий человека, при которых произошла мутация в гене MTS, включая генотерапию, заменяющую белковую терапию и использование миметиков. Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств диагностики и терапии опухолей.

Недостаток метода заключается в сложности анализа, его длительности и дороговизне.

За прототип выбран патент РФ №2466390 по заявке №2011105301/15, 20.08.2012, «Способ прогнозирования развития рака тела матки при патологических процессах эндометрия у женщин репродуктивного возраста» (Сидорова И.С. Унанян А.Л. (RU), Власов Р.С. (RU) и др.), где предложен способ прогнозирования развития рака тела матки, включающий определение клинических признаков и проведения метил-чувствительной полимеразной цепной реакции (МЧ-ПЦР) генов MLH1, RASSF1, GSTP1, р16, RAR-b, CDX1, и расчет коэффициента вероятности развития рака тела матки. При величине р больше 0,6 прогнозируют высокую вероятность развития рака тела матки, при р, равном 0,3-0,59, - умеренную вероятность развития рака, при р ниже 0,29 - низкую вероятность развития рака.

Недостаток прототипа заключается в том, что он повышает точность прогнозирования развития рака тела матки при уже имеющихся патологических процессах эндометрия у женщин репродуктивного возраста и не дает возможность спрогнозировать склонность пациенток к сочетанию пролиферативных заболеваний репродуктивной системы.

Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов диагностики, а именно создание способа прогнозирования пролиферативных заболеваний репродуктивной системы по сочетаниям генетических полиморфизмов: -403 А RANTES, G MCP-1,+1931 A MIP 1β, -590 C IL-4 и -403 А RANTES,+1931 A MIP 1β, -801 G SDF1, -511 C IL-1B.

Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки риска развития сочетания пролиферативных заболеваний репродуктивной системы у женщин русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья России.

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования сочетания пролиферативных заболеваний репродуктивной системы, включающий:

- выделение ДНК из периферической венозной крови;

- типирование генетических полиморфизмов гена регулятора активности нормальной экспрессии и секреции Т-клеток (-403 G/А RANTES), макрофагального воспалительного протеина -1β (+1931 A/T MIP 1β), фактора стромальных клеток (-801 G/A SDF1), интерлейкин-1 (-511 C/T IL-1B), моноцитарного хемоаттарактанта протеина -1 (C/G MCP-1), интерлейкина-4 (-590 С/T IL-4);

- анализ сочетаний полиморфизмов гена регулятора активности нормальной экспрессии и секреции Т-клеток (-403 А RANTES), макрофагального воспалительного протеина -1β (+1931 A MIP 1β), фактора стромальных клеток (-801 G SDF1), интерлейкин-1 (-511 C IL-1B), моноцитарного хемоаттарактанта протеина -1 (G MCP-1), интерлейкина-4 (-590 С IL-4);

- прогнозирование повышенного риска развития сочетания пролиферативных заболеваний репродуктивной системы таких как миома матки с эндометриозом и гиперпластическими процессами эндометрия в случае выявления сочетаний -403 А RANTES, G MCP-1,+1931 A MIP 1β, -590 C IL-4 или сочетаний -403 А RANTES,+1931 A MIP 1β, -801 G SDF1, -511 C IL-1B.

Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза развития пролиферативных заболеваний по наличию сочетаний аллеля -403 А гена регулятора активности нормальной экспрессии и секреции Т-клеток (полиморфизм -403 А RANTES), аллеля+1931 A гена макрофагального воспалительного протеина -1β (полиморфизм+1931 A MIP 1β), аллеля -801 G гена фактора стромальных клеток (полиморфизм -801 G SDF1), аллеля -511 C гена интерлейкин-1 (полиморфизм -511 C IL-1B), аллеля G гена моноцитарного хемоаттарактанта протеина -1 (полиморфизм G MCP-1), аллеля 590 C гена интерлейкина-4 (полиморфизм С IL-4).

Изобретение характеризуется следующими графическими материалами:

Фиг. 1. Дискриминация аллелей по локусу -590 C/T IL-4, где - гомозиготы по аллелю -590С, - гомозиготы по аллелю -590 Т, - гетерозиготы -590 СТ, - отрицательный контроль.

Фиг.2. Дискриминация аллелей по локусу -801G/A SDF-1, где - гомозиготы по аллелю -801 A, - гомозиготы по аллелю -801 AG, - гетерозиготы -801 G, - отрицательный контроль.

Фиг. 3. Электрофоретическое разделение продуктов рестрикции гена IL-1 В -511, где 1, 9 - гомозиготы -511ТТ; 2, 3, 5, 7, 8- гетерозиготы -511СТ, 4, 6,- гомозиготы -511СС.

Способ осуществляют следующим образом

ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови пациентки методом фенольно-хлороформной экстракции в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4ºС, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37ºС в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -200С.

Выделенную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров.

Молекулярно-генетический анализ проводят методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на амплификаторах IQ5 (BioRad) и ТП4-ПЦР-01-«ТЕРЦИК».

На амплификаторе IQ5 (Bio-Rad) проводят анализ полиморфизмов генов +1931 А/Т MIP-1, C/G МСP-1, -801 G/A SDF-1, -403 G/A RANTES, -590 C/T IL-4 методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров и специфических зондов с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей. Реакционная смесь объемом 25 мкл включает: 6,7 мМ трис-НСl (рН=8,8), 2,5 мМ MgCl₂, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 5 пкмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации выполняют 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров и денатурация.

На амплификаторе ТП4-ПЦР-01-«ТЕРЦИК» проводят анализ полиморфизма гена -511 С/Т IL-1B методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров. Реакцию проводят в 12,5 мкл общего объема смеси, содержащей 33,5 мМ трис-НСl (рН=8,8), 1,25 мМ MgCl₂, 0,5 мкг геномной ДНК, по 5 пМ каждого праймера, по 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации выполняют 32 цикла амплификации по схеме: денатурация, отжиг праймеров и элонгация. Затем пробы выдерживают 5 мин при 72°С и охлаждают. Продукты амплификации анализируют в 2%-ном агарозном геле, окрашенным бромистым этидием, в течение 30 минут при 160V. В качестве электрофорезного буфера используют 1×TAE (трис-ацетатный буфер). Затем пробы идентифицируют в проходящем УФ-свете.

Генотипирование осуществляют методом дискриминации аллелей с использованием Tag Man зондов. При проведении ПЦР в амплификаторе с флюоресцентной детекцией (амплификатор IQ5) генотипирование осуществляют методом Tag Man зондов по данным величин ОЕФ (относительная единица флуоресценции) каждого зонда.

Две полосы, вертикальная и горизонтальная, делят график на четыре секции: одна для каждого гомозиготного состояния, одна для гетерозиготного состояния и секция без реакции. Присвоение генотипов неизвестным образцам определяется вычерчиванием ОЕФ для одного флуорофора на оси x относительно ОЕФ для другого флуорофора на оси y на диаграмме дискриминации аллелей.

• Если значения ОЕФ неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и правее вертикальной полосы, генотип гетерозиготен (GA).

• Если значения ОЕФ неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и левее вертикальной полосы, генотип гомозиготен по аллелю 2 (RFU аллелю 2 отложены по оси y).

• Если значения ОЕФ неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и правее вертикальной, генотип гомозиготен по аллелю 1 (RFU аллеля 1 отложены по оси x).

• Если значения ОЕФ неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и левее вертикальной, определение генотипа невозможно (в данном случае неопределенный образец - отрицательный контроль)

Генотипирование ДНК-маркеров по локусу -511 С/T IL-1В производят методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) продуктов ПЦР-амплификации специфических участков генома (фиг.3) с использованием соответствующих ферментов рестрикции производства фирмы «Сибэнзим» (Новосибирск).

После инкубации рестрикционной смеси в течение 16 часов при температуре 37°С проводят разделение фрагментов ДНК с помощью горизонтального электрофореза на электрофоретических ячейках производства фирмы «Хеликон» (Россия). В зависимости от размера разделяемых фрагментов ДНК используют агарозный гель 2-3% концентрации, приготовленный на основе ТВЕ-буфера, окрашенный раствором бромистого этидия (0,01%). Визуализацию фореграмм осуществляют в темном боксе с трансиллюминатором фирмы UVP (Швеция).

Проводят контроль качества генотипирования с использованием положительных контрольных образцов ДНК с разными генотипами и отрицательного контрольного образца, в котором вместо ДНК к реакционной смеси добавляют воду.

Формирование базы данных и статистические расчеты осуществляют с использованием программы «STATISTICA 6.0» [Endometrial hyperplasia: a review /Brun J.L., Descat E., Boubli В., Dallay D. //J. Gynecol. Obstet. Biol. Reprod. (Paris). Пер. с франц., 2006. Vol.35, №6. P. 542-550].

Изучение роли комбинаций генетических вариантов полиморфных маркеров генов цитокинов в формирование пролиферативных процессов матки проводят с помощью программного обеспечения APSampler [http:sources.redhat.com/cygwin/], использующего метод Монте-Карло марковских цепей и байесовсовскую непараметрическую статистику [Favorov A. V. A Gibbs sampler for identification of symmetrically structured, spaced DNA motifs with improved estimation of the signal length /A. V. Favorov, M. S. Gelfand, A. V. Gerasimova [et al.] //Вioinformatics. - 2005. - Vol.21, №10. - Р. 2240-2245].

Оценку уровня статистической значимости полученных результатов проводят с использованием поправки Бонферрони (р_cor), т.е. поправки, минимизирующей вероятность получения ложноположительных результатов [Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. https://sites.google.com/site/oyurebrova/book" \t "_blank /О.Ю. Реброва//М.: МедиаСфера. - 2006 г. - 312 с.].

Возможность использования предложенного способа для оценки риска развития пролиферативных заболеваний матки подтверждает анализ результатов наблюдений 713 больных с различными пролиферативными процессами репродуктивной системы, такими как миома матки, эндометриоз, гиперпластические процессы эндометрия. Среди 713 обследуемых у 78 женщин наблюдается сочетание миомы матки, эндометриоза, гиперпластических процессов эндометрия. Группа популяционного контроля составила 500 человек. Пациенты включались в соответствующую группу больных только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью клинических, лабораторно-инструментальных методов обследования и подтвержденного результата гистологического исследования.

В исследуемую группу включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья России и не имеющие родства между собой.

Установлено, что сочетание молекулярно-генетических маркеров -403 А RANTES, G MCP-1,+1931 A MIP 1β, -590 C IL-4 встречается у 28,07% пациенток, что в 3,5 раза чаще, чем в контрольной группе (8,08%, р=0,000007, p_cor=0,05, OR=4,43 95%CI 2,21 - 8,92). Также у больных с сочетанными пролиферативными заболеваниями репродуктивной системы (миома матки, эндометриоз, гиперпластические процессы эндометрия) встречается комбинация генетических вариантов -403 А RANTES,+1931 A MIP 1β, -801 G SDF1, -511 C IL-1B (50,72%) в 2,1 раза чаще по сравнению с контролем (24,45%, р=0,000007, p_cor=0,05, OR=3,18, 95%CI 1,78 - 5,67).

Конкретные примеры.

Пример 1.

Пациентке М. русской национальности, уроженке Центрального Черноземья России, был проведен забор периферической венозной крови, выделение ДНК из периферической венозной крови; типирование генов+1931 А/Т MIP-1, C/G MCP-1, -801 G/A SDF-1, -403 G/A RANTES, -590 C/T IL-4 методом полимеразной цепной реакции.

Выявлено, что в связи с наличием сочетания аллелей-403 А RANTES, G MCP-1,+1931 A MIP 1β, -590 C IL-4, пациентку можно отнести в группу риска (OR=4,43).

Пример 2.

Пациентке К. русской национальности, уроженке Центрального Черноземья России, был проведен забор периферической венозной крови, выделение ДНК из периферической венозной крови; типирование генов -403 G/А RANTES,+1931 A/T MIP 1β, -801 G/A SDF1, -511 C/T IL-1B. Выявлено, что в связи с наличием сочетания аллелей-403 А RANTES,+1931 A MIP 1β, -801 G SDF1, -511 C IL-1B, пациентку можно отнести в группу риска (OR=3,18).

Контроль качества генотипирования с использованием положительных контрольных образцов ДНК с разными генотипами и отрицательного контрольного образца, в котором вместо ДНК к реакционной смеси добавляют воду, показал практически полное совпадение результатов исследования (98,5%) и отсутствие контаминации отрицательного контрольного образца.

Таким образом, полученные данные подтверждают, что сочетания аллелей -403 А RANTES, G MCP-1,+1931 A MIP 1β, -590 C IL-4 или сочетания аллелей -403 А RANTES,+1931 A MIP 1β, -801 G SDF1, -511 C IL-1B являются факторами риска развития миомы матки в сочетании с эндометриозом и гиперпластическими процессами эндометрия (OR=4,43 и OR=3,18, соответственно).

Применение данного способа позволит сформировать группу больных с повышенным риском развития сочетанных пролиферативных заболеваний репродуктивной системы, эти знания помогут разобраться врачу в конкретной клинической ситуации, вовремя назначить адекватную терапию, что послужит профилактикой дальнейшего прогрессирования/рецидивирования заболевания и улучшит качество жизни пациента в целом.