Результат интеллектуальной деятельности: ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КОНСОРЦИУМА АЗОТФИКСИРУЮЩИХ И ФОСФАТМОБИЛИЗУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Изобретение относится к области создания биопрепаратов на основе индивидуальных микроорганизмов и их сочетаний (консорциумов) и может быть использовано в микробиологии и сельском хозяйстве.

Известна питательная среда для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, карбонат кальция, сахарозу и воду [1]. Недостатком данной питательной среды является относительно низкая скорость роста на ней азотфиксирующих микроорганизмов, а также практическое отсутствие роста фосфатмобилизующих микроорганизмов, что также делает ее малопригодной для выращивания их консорциума.

Известна также питательная среда для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу и воду (т.н. среда Берка) [2]. Недостатком данной питательной среды также является сравнительно низкая скорость роста как азотфиксирующих, так и фосфатмобилизующих микроорганизмов, и, следовательно, их консорциума в целом.

Наиболее близким к заявляемому объекту по совокупности признаков и достигаемому техническому эффекту является питательная среда для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу, минеральную добавку - вермикулит и воду [3]. Недостатком данной питательной среды, которая в связи с только что отмеченным обстоятельством выбрана в качестве объекта-прототипа, также является сравнительно низкая скорость роста как азотфиксирующих, так и фосфатмобилизующих микроорганизмов.

Цель настоящего изобретения - увеличение скорости роста как азотфиксирующих, так и фосфатмобилизующих микроорганизмов на питательной среде в процессе культивирования консорциума на их основе.

Декларируемая цель достигается тем, что в питательной среде для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащую дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу, минеральную добавку и воду, в качестве минеральной добавки используется нановермикулит при следующем соотношении ингредиентов (г/л):

В результате использования данной питательной смеси скорость роста азотфиксирующих микроорганизмов повышается в 1.5-2.0 раза по сравнению с таковой для питательной среды-прототипа [3]; скорость же роста фосфатмобилизующих микроорганизмов возрастает на 30-40%.

До настоящего времени в литературе не была кем-либо описана питательная среда для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая вышеуказанную совокупность ингредиентов вообще и нановермикулит в частности; более того, и само применение последнего в составе питательных сред для выращивания микроорганизмов неизвестно вообще. Данное обстоятельство позволяет сделать заключение о том, что заявляемый объект соответствует первому из установленных патентным законодательством РФ критериальных признаков изобретения «новизна». Сопоставление известных признаков питательной среды-прототипа [3] и отличительных признаков, характеризующих заявляемый объект (а именно - замена содержащегося в питательной среде-прототипе вермикулита на нановермикулит), не позволяет предсказать априори появления у него новых по сравнению с прототипом свойств, а именно указанного выше увеличения скорости роста как азотфиксирующих, так и фосфатмобилизующих микроорганизмов, входящих в состав вышеуказанного консорциума (причем - в разной степени). Отмеченный факт, по нашему мнению, свидетельствует о том, что заявляемый объект явным образом не следует из известного в данной отрасли техники уровня и тем самым соответствует второму из установленных законодательством РФ критериальных признаков изобретения «изобретательский уровень». Предлагаемая питательная среда достаточно легко может быть получена в промышленном масштабе, ее применение для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов не требует какого-либо специального и дорогостоящего оборудования, энергозатрат и т.п.; в связи с этим несомненно, что заявляемый объект соответствует и третьему из установленных законодательством РФ критериальных признаков изобретения «промышленная применимость».

Заявляемая на предмет изобретения питательная среда для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1 (приготовление нанобентонита)

Природный вермикулит, добытый из Татарского месторождения (Красноярский край, РФ), измельчают в муку и смешивают с дистиллированной или деионизированной (обессоленной) водой из расчета 20 г вермикулита на 100 мл воды. Полученную смесь обрабатывают ультразвуком в ультразвуковом диспергаторе УЗУ-0,25 мощностью 80 Вт при частоте 18.5 кГц с амплитудой колебаний ультразвукового волновода 5 мкм в течение (5-20) мин при комнатной температуре, в результате чего получается водно-вермикулитовая суспензия с размерами частиц вермикулита от 5 до 100 нм. Приготовленную таким образом суспензию нановермикулита далее используют в качестве одного из компонентов питательной среды для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов.

Приготавливают питательную среду для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов состава, г/л:

Пример 2

Составляют консорциум азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов с соотношением 1:1 по количеству колониеобразующих единиц на основе коллекционных (депонированных) штаммов поименованных микроорганизмов (Pseudomonas brassicacearum, Регистрационный номер в ВКПМ В-10388) и (Sphingobacterium multivorum, Регистрационный номер в ВКПМ В-10385) соответственно. Для этого предварительно выращивают азотфиксирующие микроорганизмы на агаризованной среде Эшби, а фосфатмобилизующие - на агаризованной среде Муромцева, после чего обе эти культуры высеваются на питательную среду указанного выше состава. Выращивание ведут в течение того периода времени, в котором имеет место прирост их численности (5.5 сут), после чего этот процесс прекращают. Для определения численности микроорганизмов сразу же проводят посев консорциума на агаризованные питательные среды (среда Эшби в случае азотфиксирующих и среда Муромцева в случае фосфатмобилизующих) и определяют среднюю скорость их роста в (млнт^-1·сут^-1) как частное от деления числа микроорганизмов (в миллионах единиц) на массу питательной среды (в г) и время выращивания (в сут.). Итоговые результаты по определению скорости роста азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов для вышеуказанной питательной среды представлены в Таблице 1.

Пример 3

Выполняют по общей технологической схеме Примера 2, но для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Вода дистиллированная до 1 л

Результаты по определению скорости роста микроорганизмов для рассматриваемого случая приведены в Таблице 1.

Пример 4

Осуществляют, как и Пример 2, но для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Данные о скорости роста обоих поименованных микроорганизмов для данного случая см. в Таблице 1.

Пример 5 (сравнительный)

Осуществляют по той же схеме, что и Пример 2, но для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов приготавливают питательную среду состава, г/л:

Результаты по определению скорости роста вышеуказанных микроорганизмов для этого случая даны в Таблице 1.

Пример 6 (сравнительный)

Проводят, как и Пример 2, но для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов применяют питательную среду состава, г/л:

Показатели скорости роста микроорганизмов для данного случая представлены в Таблице 1.

Пример 7 (сравнительный)

Выполняют, как и Пример 2, но для культивирования консорциума микроорганизмов применяют питательную среду состава, г/л:

Сведения о скорости роста азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов для данного случая показаны в Таблице 1.

Пример 8 (сравнительный)

Осуществляют по той же схеме, что и Пример 2, но культивирование консорциума вышеуказанных микроорганизмов осуществляют на питательной среде состава, г/л:

Показатели скорости роста обоих этих микроорганизмов для отмеченного случая даны в Таблице 1.

Пример 9 (сравнительный)

Проводят так же, как и Пример 2, но для культивирования консорциума микроорганизмов берут питательную среду состава, г/л:

Значения скорости роста микроорганизмов для этого случая приведены в Таблице 1.

Пример 10 (сравнительный)

Осуществляют таким же образом, как и Пример 2, но культивирование консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов осуществляют на питательной среде состава, г/л:

Данные о скорости роста каждого из вышеуказанных микроорганизмов для рассматриваемого случая представлены в Таблице 1.

Пример 11 (по прототипу [3])

Выполняют по той же технологической схеме, что и Пример 2, но для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Данные о скорости роста микроорганизмов для этого случая приведены в Таблице 1.

Пример 12 (по прототипу [3])

Осуществляют таким же образом, что и Пример 2, но для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов применяют питательную среду состава, г/л:

Результаты по определению скорости роста поименованных выше микроорганизмов для данного случая см. в Таблице 1.

Пример 13 (по аналогу [2])

Выполняют по той же технологической схеме, что и Пример 2, но для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Данные по скорости роста микроорганизмов для рассматриваемого случая показаны в Таблице 1.

Пример 14 (по аналогу [I])

Выполняют по той же технологической схеме, что и Пример 1, но для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Данные по скорости роста микроорганизмов для указанного случая также представлены в Таблице 1

Как следует из приведенных в Таблице 1 данных, использование заявляемой питательной среды, содержащей нановермикулит в количестве (0.6-1.3) г/л, позволяет весьма значительно увеличить скорости роста как азотфиксирующих {Pseudomonas brassicacearurri), так и фосфатмобилизующих {Sphingobacterium multivorum) микроорганизмов в рамках их консорциума по сравнению с таковыми для питательной среды-прототипа [3] и тем более - сред-аналогов [1] и [2]. Отметим, что заявляемые количества нановермикулита в питательной смеси являются существенными: при превышении указанного верхнего заявляемого предела (1.3 г/л) дальнейшего увеличения скорости роста как тех, так и других микроорганизмов уже не наблюдается (и, более того, имеет место даже некоторое ее снижение), при уменьшении же ниже указанного нижнего заявляемого предела (0.6 г/л) имеет место снижение скорости роста.

Аналогичные результаты были получены и на других культурах азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов (в частности, Azotobacter chroococcum, Регистрационный номер в ВКПМ В-10387 и Achromobacter xylosoxidans, Регистрационный номер в ВКПМ В-10386).

ЛИТЕРАТУРА

[1] Руководство к практическим занятиям по микробиологии. 3-е издание переработанное, под ред. Н.С. Егорова. М.: Издательство Московского университета. 1995. С.204.

[2] Патент РФ 2.177.466 (2001), МПК C05F 11/08, C12N 1/20.

[3] Заявка на изобретение РФ №2012145905 от 26.10.2012, МПК C12N 1/00, C12N 1/20, C12N 1/22 (прототип).