Результат интеллектуальной деятельности: N-(4-АЦЕТОКСИБЕНЗОИЛ)ГЛИЦИНАТ КАЛИЯ, ОБЛАДАЮЩИЙ ЦЕРЕБРОПРОТЕКТИВНЫМ ДЕЙСТВИЕМ

Изобретение относится к новым водорастворимым производным глицина (аминоуксусная кислота) с О-ацилированной 4-гидроксибензойной кислотой - калиевая соль N-(4-ацетоксибензоил)глицина - и его применению как церебропротективного средства.

Разработка эффективных путей профилактики и лечения нарушений мозгового кровообращения относится к числу приоритетных проблем современной медицины. Это обусловлено возрастающей в последние годы тенденцией к повышению частоты хронических цереброваскулярных расстройств, а также высокой медико-социальной и экономической значимостью данного вида патологии, сопровождающейся высоким уровнем смертности и инвалидизации населения, высокой стоимостью терапии и реабилитационных мероприятий (Мирзоян Р.С, 1995; Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001; Евзельман М.А., 2003; Одинак М.М., Вознюк И.А., Янышевский С.Н., 2005).

Глицин (аминоуксусная кислота, CAS 56-40-6) как средство, повышающее умственную работоспособность и уменьшающее психоэмоциональное напряжение [Машковский, М.Д. Лекарственные средства: пособие для врачей. - Т.2. - М.: Новая волна. - 2002. - С.124]. Важная физиологическая роль гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) в регуляции функциональной активности ЦНС определяет перспективность создания на ее основе нейропсихотропных лекарственных средств. Однако в силу ряда физико-химических свойств препараты, в частности ГАМК (CAS 56-12-2, аминалон, гаммалон), обладают низкой биодоступностью, что является причиной их невысокой эффективности. Низкая биодоступность незамещенных аминокислот, в том числе линейной ГАМК, объясняется их высокой полярностью - при физиологических значениях pН такие вещества существуют в виде биполярных ионов, вследствие чего плохо проникают через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). На сегодняшний день в медицинской практике успешно применяются линейные аналоги ГАМК: γ-амино-β-фенилмасляная кислота (СAS 1078-21-3, фенибут) как ноотропный препарат и транквилизатор, γ-амино-β-(n-хлорфенил)масляная кислота (баклофен) как центральный миорелаксант, N-никотиноил-γ-аминомасляная кислота (пикамилон) как ноотроп и средство, улучшающее мозговое кровообращение и др. Широко используются и циклические аналоги ГАМК: 2-оксо-1-пирролидинацетамид (пирацетам) - родоначальник группы ноотропов, N-карбамоил-метил-4-фенил-2-пирролидон (фенотропил) - ноотроп с нейропротекторным и нейромодулирующим действием [Сравнительное экспериментальное изучение ноотропных свойств аналога ГАМК фенибута и его метилового эфира / Багметова В.В., Бородкина Л.Е., Тюренков И.Н., Берестовицкая В.М., Васильева О.С. // Фундаментальные исследования. - 2011. - №10 (часть 3), - стр.467-471] и др.

N-(4-ацетоксибензоил)глицин (CID 840150) в медицине не используется.

Цель изобретения заключается в получении высокоэффективного водорастворимого производного глицина и 4-гидроксибензойной кислоты, сочетающего основные эффекты, присущие церебропротективным средствам и превосходящие таковые у фенибута и глицина.

Сущность изобретения заключается в синтезе N-(4-ацетоксибензоил)глицината калия формулы

и использования его в качестве церебропротективного средства.

Для оценки церебропротективного действия N-(4-ацетоксибензоил)глицината калия при недостаточности мозгового кровообращения использовалась модель одномоментной необратимой билатеральной окклюзии общих сонных артерий [Мирзоян Р. С. Методические рекомендации по доклиническому изучению лекарственных средств для лечения нарушений мозгового кровообращения и мигрени // Руководство по доклиническому изучению лекарственных средств / Под. ред. А.Н. Миронова Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.]. О церебропротективном действии N-(4-ацетоксибензоил)глицината калия судили по снижению летальности животных на фоне окклюзии ОСА и уменьшению у них выраженности неврологического и поведенческого дефицита. Регистрацию выживаемости и выраженности неврологического дефицита у животных осуществляли на 6, 12, 24, 48 и 72 час после операции. Неврологический статус животных определялся по шкале McGrow в модификации И.В. Ганнушкиной. При наличии у животных нескольких симптомов неврологического дефицита тяжесть состояния определялась как сумма соответствующих балов. Дополнительно для оценки поведения животных, а также когнитивных функций использовались стандартные психофармакологические тесты: «Открытое поле» (ОП), «условная реакция пассивного избегания» (УРПИ) и «тест экстраполяционного избавления» (ТЭИ), исследование животных в которых проводилось через 72 часа после окклюзии ОСА.

Пример 1. Калиевая соль N-(4-гидроксибензоил)глицина

В реактор, снабженный мешалкой, помещают глицин и 50 мл ДМФА. По каплям приливают хлорангидрид 4-ацетоксибензойной кислоты в течение 1,5 часа. Реакцию проводят при охлаждении 1,5 часа. Затем, полученную реакционную смесь перемешивают еще 2,5 часа (при охлаждении), контролируя pН среды (pН>7). Для поддержания среды добавляют 6 н. раствор гидроксида калия. Полученную смесь выливают в лед и подкисляют хлороводородной кислотой до pН=5, выпавшие кристаллы N-(4-ацетоксибензоил)глицина отфильтровывают и сушат. Выход 73%. Т_пл=194-197°C, Rf 0,569 (бутанол-1). М+237 (хроматомасс-спектрометр «Saturn-2100», Varian). Затем полученный N-(4-ацетоксибензоил)глицин смешивают с этилатом калия (мольное соотношение 1:1) и кипятят в среде бензола в течение 60 минут. После охлаждения продукт отделяют фильтрованием, промывают небольшим количеством спиртового раствора гидроокиси калия и сушат. Получают белое кристаллическое вещество (выход 87%) с температурой плавления 203-205°C. Найдено: C 47.89; H 3.65; K 14.18; N 5.07. Вычислено, %: C 47.99; H 3.66; K 14.20; N 5.09; О 29.06.

Пример 2.

Модель одномоментной необратимой билатеральной окклюзии общих сонных артерий (ОСА) (таблицы 1 и 2)

Эксперименты проведены на половозрелых беспородных крысах-самцах 180-200 г 3,5-4-месячного возраста. Все животные были доставлены из питомника ФГУП "НИИ ГТП" ФМБА России. В ходе исследования были сформированы 5 групп по 20 животных в каждой: 1) ЛО (ложнооперированные) крысы - с данной группой животных выполнялись все манипуляции, как и с группой контроль-ишемия, однако после подведения лигатур под общие сонные артерии они не затягивались; 2) контроль-ишемия - крысы, которым выполняли двустороннюю окклюзию общих сонных артерий (ОСА) и получавшие физиологический раствор; 3) ишемия+N-(4-ацетоксибензоил)глицинат калия - животные с двусторонней ОСА, получавшие N-(4-ацетоксибензоил)глицинат калия в дозе 9 мг/кг; 4) ишемия+фенибут - животные с двусторонней ОСА, получавшие соединение фенибут в дозе 25 мг/кг; 5) ишемия+глицин - животные с двусторонней ОСА, получавшие глицин в дозе 10 мг/кг. Патентуемое соединение и препараты сравнения (фенибут, глицин) вводились внутрибрюшинно за 30 минут до наложения лигатур на общие сонные артерии и через 2 часа после проведения операции.

Пример 3. Тест «открытое поле» (ОП) [Хаунина Р.А., Лапин И.П. 1976 г., Воронина Т.А. 1982] предназначен для изучения поведения грызунов в новых условиях и позволяет оценить: выраженность и динамику отдельных поведенческих элементов; уровень эмоционально-поведенческой реактивности животного; стратегию исследовательского/оборонительного поведения; симптомы неврологического дефицита. Тестируемое животное помещается в центр круглой белой арены хвостом к экспериментатору. Визуальный контроль за поведением животного проводили в течение 3-х минут, фиксировались следующие показатели: число пересеченных секторов, количество стоек (учитывали и закрытые и открытые стойки), количество обследованных отверстий-норок [Воронина Т.А., Островская Р.У., 2000]. Об ориентировочно-исследовательской активности судили по сумме стоек и заглядываний в отверстия, а по количеству пересеченных секторов - о спонтанной двигательной активности.

Пример 4. Методика оценки условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) является базисной моделью для выявления специфической ноотропной активности веществ [Воронина Т.А., Островская Р.У., 2000]. Она используется для оценки влияния веществ на формирование, сохранение и воспроизведение памятного следа в норме и в условиях его нарушения.

Данная методика выполнялась следующим образом.

1) Формирование рефлекса пассивного избегания - крысу помещали в освещенный отсек (лампа мощность 100 Вт) в центральную зону, хвостом к отверстию в темный отсек, обследовав светлый отсек крыса переходила в темный, через электрический пол которого подавался ток 40 В, 3 импульса по 1 с с интервалом 0,5 с, тем самым животные получало электроболевое раздражение. За животным наблюдали в течение 3-х минут, если оно вновь заходило в темный отсек электроболевое раздражение наносили повторно, крысы которые не заходили - из эксперимента исключались. Фиксировались следующие показатели: латентный период (ЛП) первого захода в темный отсек (время от момента помещения животного в середину площадки до первого захода в темный отсек) и количество заходов в него.

2) Контроль выработки рефлекса - все животные повторно не должны заходить в темный отсек установки, зашедшие животные исключались из эксперимента.

3) Воспроизведение навыка пассивного избегания - на данном этапе в отличие от этапа обучения, если животное заходило в темный отсек, то электроболевое раздражение не наносили. Регистрировались аналогичные показатели, что и при обучении, плюс общее время, проведенное в темном отсеке.

Пример 5. Тест экстраполяционного избавления (ТЭИ) предназначен для изучения когнитивных функций грызунов в условиях аверсивной среды и позволяет оценить: индивидуальные различия когнитивного стиля решения задачи (поиска пути активного избавления из аверсивной среды). Фиксировался ЛП подныривания (время от момента погружения животного в воду до подныривания под края цилиндра). Также как и тест, УРПИ методика включает в себя этап обучения навыка (выработка рефлекса избавления) и этапа его воспроизведения через 24 часа. Животные, не решающие задачу за время наблюдения на этапе обучения, исключаются из опыта.

Необратимая окклюзия общих сонных артерий вызывала выраженное нарушение мозгового кровообращения, которое приводило к гибели животных. Введение N-(4-ацетоксибензоил)глицината калия в дозе 9 мг/кг к достоверно уменьшало гибель крыс после перевязки сонных артерий по сравнению с группой негативного контроля (контроль-ишемия) (таблица 1). Оказываемое им защитное действие превосходило таковое у фенибута, глицина.

При оценке неврологического дефицита у животных, которые получали патентуемое соединение на фоне окклюзии общих сонных артерий, было установлено, что превентивное введение данного соединения достоверно препятствовало возникновению выраженных нарушений локомоторной и ориентировочно-исследовательской активности животных, в большей степени устраняло нарушения памяти, вызванные необратимой окклюзией общих сонных артерий (рис.1, 2).

Пример 6. Определение острой токсичности (таблица 3)

Острую суточную токсичность при однократном введении изучали на мышах-самках массой 25-30 г. Соединение в изотоническом растворе хлорида натрия вводили животным внутрибрюшинно в различных возрастающих дозах однократно. Наблюдение за животными проводили в течение суток, отмечая количество погибших животных. Расчет ЛД₅₀ проводили по методу Литчфилда и Уилкоксона.

Таким образом, введение N-(4-ацетоксибензоил)глицината калия в дозе 9 мг/кг к достоверно уменьшало гибель крыс после перевязки сонных артерий по сравнению с группой негативного контроля (контроль-ишемия). Оказываемое им защитное действие превосходило таковое у фенибута, глицина. Так выживаемость животных после ОСА, получавших N-(4-ацетоксибензоил)глицинат калия, составила 85% (через 72 часа), в то время как этот же показатель у животных, получавших фенибут и глицин, составлял 50 и 45% соответственно. К тому же суммарный балл неврологического дефицита у животных, получавших патентуемое соединение, был наименьшим. Исследования острой токсичности заявляемого производного показали, что по классификации опасности (вредности) веществ N-(4-ацетоксибензоил)глицинат калия при внутрибрюшинном введении мышам относится к классу малотоксичных соединений [Саноцкий И.В. Критерий вредности в гигиене и токсикологии при оценке опасности химических соединений / И.В. Саноцкий, И.П. Уланова. - М.: Медицина, 1975, - 328 с.].