Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ СБОРА ОПЛОДОТВОРЕННЫХ ЯИЦ (in vitro) ОТ ВОЗБУДИТЕЛЯ Fasciola hepatica ПРИ ЖИЗНИ

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, а более конкретно к паразитологии ( = гельминтологии) к «Способу сбора при жизни паразита оплодотворенных яиц (in vitro) от возбудителя паразитарного зооноза Fasciola hepatica», и предназначено для использования при паразитологических лабораторных или/и полевых исследованиях гельминтологических сборов (при жизни паразита в искусственной среде и при температуре, свойственной жвачным), оплодотворенных яиц от возбудителя паразитарного зооноза: Fasciola hepatica, который необходим при решении фундаментальных и прикладных научных задач в области эпизоотологии, терапии и профилактики фасциолеза домашних или/и диких животных.

Известно, что в качестве возбудителей фасциолеза домашних и диких животных зарегистрированы во многих странах и на континентах земного шара, следующие виды фасциол: Fasciola hepatica L., 1758; F. gigantica Cobbold, 1885; F. jacksoni Cobbold, 1869; F. halli Sinitsin, 1933; F. californica Sinitsin, 1933; F. indica Warma, 1953 [Демидов H.B. - 1, Kapape M.B., Абрамова В.Ф., Пасечник B.E. - 2, Singh K.P., Srivastava V.K., Prasad Α., Pandey A.P. - 7].

В Российской Федерации, в странах бывшего СССР и других странах мира отмечены первые 2 вида фасциол, которые в прошлом и настоящем были причиной огромных экономических убытков в животноводческих хозяйствах (США - только в штате Северная Дакота ежегодные потери из-за фасциолеза овец и крупного рогатого скота оценивались в 7 млн 650 тыс) [1].

Известно, что во всех странах мира фасциолез и в настоящее время является причиной прямого и косвенного ущерба, который складывается из резкого снижения всех видов продуктивности животных, выбраковки ценных мясных продуктов и даже гибели животных.

Известно, что падеж домашних животных от фасциолеза был особенно велик до применения эффективных антигельминтиков (до 20-30-х годов прошлого столетия), позволивших резко сократить смертность [Демидов Н.В. - 1]. Однако гибель ценных животных от фасциолеза, в том числе редких и исчезающих видов животных (индийских слонов), отмечают и в настоящее время [Singh К.Р., Srivastava V.K., Prasad Α., Pandey Α.Ρ. - 7].

Известно, что обеспеченность продуктами питания и, в частности, белками животного происхождения (молоко, мясо и др.) населения Российской Федерации является одной из приоритетных задач правительства нашей страны в ближайшие годы.

Поэтому для ученых ветеринарной медицины России продолжает оставаться актуальным вопрос по обеспечению профилактики болезней, в том числе и инвазионных (фасциолез, трихоцефалез и др.), которые способствуют возникновению бактериальных и вирусных заболеваний (туберкулез (Tuberculosis), лейкоз крупного рогатого скота, грипп и африканская чума (African fever) свиней, ящур крупного рогатого скота (Aphthae epizooticae), бешенство (Rabies) и др.), домашних (крупный рогатый скот, овцы, козы, верблюды, северные олени, яки, одомашненные лоси, лошади) и диких животных (кабаны, олени; редких и исчезающих видов: зубры, бизоны и др.).

Известно, что для получения сборов яиц исследователи получали яйца гельминтов следующими способами:

1) разрушая женские половые органы гельминтов [Пасечник В.Е. - 4,5];

2) флотации, седиментации, комбинированными [Котельников Г.А. - 3].

Эти способы имеют следующие недостатки:

получение культуры яиц 1-м способом неприемлемо, так как при этом способе сбора яиц Fasciola hepatica:

а) получение до 100% оплодотворенных яиц невозможно, так как наряду с оплодотворенными яйцами Fasciola hepatica, попадают и неоплодотворенные, что создает большие трудности при лабораторных и полевых исследованиях;

б) полученный сбор очень сильно загрязнен остатками тканей разрушенных женских половых органов Fasciola hepatica, что в процессе опыта вызывает развитие бактериальной микрофлоры и гниение яиц Fasciola hepatica.

Сборы яиц фасциол, применяя способы флотации и комбинированные, имеют следующие недостатки:

а) известно [по Котельникову Г.А. - 3], что некоторые солевые растворы действуют негативно на яйца фасциол и вызывают их деформацию (стандартизированная методика флотации с раствором нитрата свинца (азотнокислого свинца) по Г.А. Котельникову и В.М. Хренову; модификация комбинированного метода по Вишняускасу А. (1965): раствор сульфата цинка; модификация комбинированного метода по Сковронскому Р.В. (1962): раствор тиосульфата натрия с плотностью 1,28), что неприемлемо для проведения исследований в лаборатории и даже в полевых условиях, так как искажаются результаты: развитие мирацидиев в яйцах фасциол;

б) широко используемый способ флотации с насыщенным раствором хлорида натрия (поваренной соли), абсолютно не пригоден для сбора яиц фасциол, так как плотность раствора 1,18-1,20, а удельный вес яиц фасциол: 1,31-1,35;

в) неизвестен вид, подвид, раса, штамм фасциол.

Получение сборов яиц фасциол способом седиментации при спонтанно зараженных фасциолезом животных более приемлем для проведения опытов в полевых условиях, однако:

а) при проведении исследований в лабораторных условиях он нас не удовлетворяет, так как сбор яиц Fasciola sp. при этом способе получается сильно засоренным остатками пищевых масс, даже при тщательном отмывании экскрементов животных спонтанно зараженных фасциолезом;

б) при этом способе неизвестен вид (Fasciola hepatica, Fasciola gigantica) возбудителя инвазии, что может иметь большое значение при проведении профилактических и лечебных мероприятий в зоне распространения других видов фасциол (Fasciola gigantica, подвидов, штамм, рас) в Российской Федерации (это относится к южным областям: Астраханская и др.);

в) этот способ сбора яиц требует больших затрат времени и труда при исследовании большого количества фекалий с целью сбора достаточно большого количества яиц фасциол, поскольку экспериментаторам иногда требуется до нескольких тысяч яиц для проведения лабораторных или/и полевых исследований.

Очевидно, что исследователю по этой причине получить максимально большое количество (известными способами сбора яиц фасциол: путем разрушения женских половых органов гельминтов, флотации, седиментации, комбинированными) - до 100% оплодотворенных яйц и именно только от идентифицированного (а известен вид только при способе сбора яиц путем разрушения женских половых органов паразита, то есть после гибели фасциолы) возбудителя паразитарного зооноза Fasciola hepatica, для проведения экспериментов в полевых или/и лабораторных условиях, крайне сложно и практически невозможно.

Целью изобретения является использование впервые разработанного нами «Способа сбора при жизни паразита оплодотворенных яиц (in vitro) от возбудителя паразитарного зооноза Fasciola hepatica» для экспериментов с получением сборов яиц в максимально стерильных условиях, т.е. без загрязнений кусочками тканей Fasciola hepatica и без занесения секундарной микрофлоры из разрушенных тканей фасциол и внешней среды и, самое главное, получить предлагаемым способом при жизни паразита максимальное количество - до 100% оплодотворенных яиц от возбудителя паразитарного зооноза: Fasciola hepatica L., 1758.

1. Поставленная цель достигается тем, что при проведении сбора яиц от Fasciola hepatica применяют разработанный нами впервые «Способ сбора при жизни паразита оплодотворенных яиц (in vitro) от возбудителя паразитарного зооноза Fasciola hepatica», заключающийся в отборе из желчных протоков печени, при исследовании гельминтологическими методами на вскрытии спонтанно зараженных фасциолезом домашних или/и диких животных, только половозрелых, живых гельминтов Fasciola hepatica в отдельные пробирки с отфильтрованной и отцентрифугированной желчью 1:1 разбавленной изотоническим раствором (0,9%) хлорида натрия и экспозицией пробирок при t=38,2-39,5°C (если фасциолы от крупного рогатого скота) и при t=39-40,5°C (если фасциолы) от овец и коз, в течение 5 часов в условиях термостата, и последующего тщательного отмывания яиц в изотоническом растворе (0,9%) хлорида натрия, отличающийся от известного способа сбора яиц вскрытием ( = разрушением) гельминтов, тем, что:

для сбора яиц берутся только половозрелые, живые Fasciola hepatica, полученные при вскрытии диких животных в заповедниках, охотничьих хозяйствах, или/и на мясокомбинатах, убойных пунктах, или/и в частных хозяйствах (крестьянских, фермерских и др.), при убое домашних животных;

Fasciola hepatica не разрушаются для сбора яиц, а происходит, при жизни паразита, естественное, активное продуцирование (=откладка) оплодотворенных яиц в искусственной среде (в отдельных для каждого паразита пробирках с отфильтрованной и отцентифугированной желчью 1:1 разбавленной изотоническим раствором (0,9%) хлорида натрия) и при температуре свойственной жвачным (t=38-39°C - если Fasciola hepatica от крупного рогатого скота и t=39-40°C - если Fasciola hepatica от овец или/и коз) в условиях термостата и при экспозиции 5 часов; в сборе практически нет: неоплодотворенных яиц, частиц разрушенных тканей Fasciola hepatica, секундарной бактериальной микрофлоры.

2. Способ сбора оплодотворенных яиц (in vitro) по п. 1, отличающийся от известных способов сбора яиц гельминтов: флотации, седиментации, комбинированных, тем, что:

нет необходимости в дефинитивных хозяевах паразита - зараженных спонтанно фасциолезом домашних или/и диких животных;

нет необходимости в различных солевых растворах (некоторые из них деформируют яйца фасциол: модификация комбинированного метода по Вишняускасу А. (1965): раствор сульфата цинка; модификация комбинированного метода по Скворонскому Р.В. (1962): раствор тиосульфата натрия, что было неприемлемо при проведении исследований в лаборатории и даже в полевых условиях, так как искажались результаты);

нет необходимости в исследовании большого количества проб фекалий от спонтанно зараженных фасциолезом домашних или /и диких животных для получения большого количества оплодотворенных яиц фасциол;

нет необходимости в сепарировании яиц Fasciola hepatica от других видов яиц гельминтов: стронгилят, Capillaria sp., Trichuris sp., ооцист эймерий, криптоспоридий;

отсутствует засоренность сбора яиц Fasciola hepatica остатками пищевых масс (непереваренного корма).

Способ сбора оплодотворенных яиц (in vitro) по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что: живые, половозрелые Fasciola hepatica при жизни паразита откладывают в указанный выше раствор до 100% оплодотворенные яйца фасциол (в отличие от способа сбора яиц, когда разрушают ( = убивают) гельминтов), при необходимости можно получить до нескольких тысяч яиц и от известного вида: Fasciola hepatica, Fasciola gigantica и др., или подвида, расы, штамма (в отличие от известных способов сбора яиц гельминтов: флотации, седиментации, комбинированного, когда вид, или подвид, раса, штамм фасциол неизвестен), который необходим для исследований в условиях лаборатории или/и полевых экспериментов, при решении фундаментальных и прикладных задач в области эпизоотологии, терапии и профилактики фасциолеза домашних или/и диких животных.

Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с прототипом (известными способами сбора яиц фасциол: флотации, седиментации, комбинированными, путем разрушения гельминтов - женских половых органов) показывает, что эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «новизна».

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, не выявлены в других технических решениях, и поэтому они обеспечивают заявляемому техническому решению соответствие критерию «существенные отличия»

Примеры конкретного выполнения предлагаемого способа.

Пример 1. В Республике Молдова от 24 голов (12 крупного и 12 мелкого рогатого скота - овец) спонтанно зараженного фасциолезом собирали известными способами сбора: флотации - с раствором нитрата натрия, NaNO₃ (натриевой селитры), седиментации, комбинированным -модификация по А. Вишняускасу, [3] (контроль) яйца фасциол и одновременно предлагаемым «Способом сбора при жизни паразита оплодотворенных яиц (in vitro) от возбудителя паразитарного зооноза Fasciola hepatica» (опыт): собранные на мясокомбинатах при исследовании гельминтологическим методом по К.И. Скрябину [6] из желчных ходов печени 450 экземпляров живых, половозрелых Fasciola hepatica в отдельные пробирки с отфильтрованной желчью 1:1 разбавленной изотоническим раствором (0,9%) хлорида натрия и экспозицией пробирок при t=38-39°C (если Fasciola hepatica от крупного рогатого скота) и при t=39-40°C (если Fasciola hepatica от овец или/и коз) в условиях термостата в течение 5 часов, и последующего тщательного отмывания яиц в изотоническом растворе (0,9%) хлорида натрия.

Через 5 часов рабочего времени был подведен итог эксперимента и в результате выяснилось, что предлагаемый «Способ сбора при жизни паразита оплодотворенных яиц (in vitro) от возбудителя паразитарного зооноза Fasciola hepatica» отличается от известных способов сбора яиц (флотации, седиментации, комбинированного) тем, что:

нет необходимости в дефинитивных хозяевах паразита Fasciola hepatica - в зараженных фасциолезом домашних и/или диких животных;

нет необходимости в приготовлении различных солевых растворов, которые часто отсутствуют в широкой продаже или имеют ограничения (аммиачная селитра и др.), так как могут быть использованы в целях проведения террористических актов, многие из этих химических реактивов продаются по очень высоким ценам, так как основная часть этих солей производятся за рубежом Российской Федерации, и, следовательно, сборы яиц фасциол указанными выше способами могут быть весьма затратными;

яйца фасциол в некоторых солевых растворах были сильно деформированными (способ сбора яиц гельминтов: комбинированным), что может сказаться на результатах экспериментов в полевых условиях, а в лабораторных условиях эти деформированные яйца фасциол для проведения наших экспериментов были абсолютно непригодны;

в сборах яиц фасциол известными способами (флотации, седиментации, комбинированными) были в очень большом количестве яйца гельминтов других родов и видов: стронгилят, трихоцефалов, дикроцелиев, парамфистумов и др., и ооцист эймерий, криптоспоридий, что значительно затрудняло проведения опыта;

при сборе яиц предлагаемым способом известен вид Fasciola hepatica, а при применении способов сборов яиц флотации, седиментации, комбинированного, вид неизвестен, так как животные в южных районах Российской Федерации (Астраханской области и др.) могут быть заражены и другими видами фасциол: Fasciola gigantica, или подвидами: расами, штаммами, что имеет большое значение при проведении профилактических и терапевтических мероприятий;

при использовании известного способа сбора яиц (седиментации) - стандартизированная методика последовательных промываний (наиболее приемлемый способ), оказалось что за 5 часов рабочего времени:

а) нам удалось собрать 940 яиц (контроль), а применяя предлагаемый «Способ сбора при жизни паразита оплодотворенных яиц (in vitro) от возбудителя паразитарного зооноза Fasciola hepatica» - 5990 яиц (опыт);

б) в сборах яиц было очень много яиц других видов гельминтов: Trichuris sp., подотряда Strongylata: Nematodirus sp., Oesophagostomum sp., Dicrocoelium lanceatum, Moniezia sp., Strongyloides papillosus, Paramphistomum sp., и ооцист эймерий и криптоспоридий, что существенно снижало производительность эксперимента, так как много времени уходило на сепарирование из сборов яиц фасциол этих включений;

в) в сборах яиц было большое количество непереваренного корма, который необходимо было отмывать в течение всего периода проведения эксперимента - 5 часов;

г) способ трудоемок: сложно отыскать яйца фасциол в осадке;

д) неизвестен вид фасциол (Fasciola hepatica, Fasciola gigantica и др.).

Подводя итог результатам мы выяснили, что известные способы сбора яиц фасциол (флотации, седиментации, комбинированные) могут использоваться при устранении вышеназванных недостатков только в полевых условиях, а что касается лабораторных экспериментов они нас полностью неудовлетворяют.

Следовательно, данный пример убедительно показывает преимущество предлагаемого «Способа сбора при жизни паразита оплодотворенных яиц (in vitro) от возбудителя паразитарного зооноза Fasciola hepatica» по сравнению с известными способами сбора яиц фасциол: флотации, седиментации, комбинированного.

Пример 2. При исследовании на вскрытии на мясокомбинатах, в фермерских, крестьянских хозяйствах, из желчных ходов печени домашних животных (коз, овец, крупного рогатого скота), в России (Московской области), в Республике Молдова, были собраны в количестве 600 экземпляров Fasciola hepatica, которые были использованы для проведения сборов яиц по двум способам.

1-й (опыт) по предлагаемому способу (300 экземпляров), т.е. путем индивидуального (в отдельную пробирку) сбора яиц от каждого живого, половозрелого паразита (живые, половозрелые Fasciola hepatica естественно, произвольно откладывают ( = продуцируют) яйца в пробирки с отфильтрованной и отцентрифугированной желчью 1:1 разбавленной изотоническим раствором (0,9%) хлорида натрия и экспозицией их в термостате при t=38-39°C (если F. hepatica от крупного рогатого скота) и при t=39-40°C (если F. hepatica от овец и коз) в течение 5-ти часов, и последующего тщательного отмывания яиц в изотоническом растворе (0,9%) хлорида натрия;

и 2-й (контроль) известным способом сбора яиц путем секционирования ( = разрушения) паразитов (300 экземпляров): Fasciola hepatica, которые были собраны подряд (половозрелые и неполовозрелые F. hepatica) при гельминтологических вскрытиях желчных ходов печени.

В последующем отбирали подряд по 1500 яиц фасциол в опыте и контроле и культивировали в термостате при t=25-30°C (оптимальная температура для развития мирацидиев) и просматривали под микроскопом, чтобы сравнить наш способ сбора яиц (1-й - опыт) и известный способ - путем разрушения паразита: Fasciola hepatica (2-й - контроль).

В результате выяснилось, что в культуре яиц по известному Способу (2-й - контроль) развилось за 12 дней (до стадии мирацидия) только 49% (735 из 1500) яиц, а при предлагаемом нами «Способе (опыт) сбора при жизни паразита оплодотворенных яиц (in vitro) от возбудителя паразитарного зооноза Fasciola hepatica», яйца в количестве 1500 до 100% случаев были живыми и развивались за 12 дней до стадии мирацидия.

Таким образом, результаты культивирования яиц собранных по разработанному нами способу (1-й - опыт) подтвердили данные, полученные при использовании предлагаемого «Способа сбора при жизни паразита оплодотворенных яиц (in vitro) от возбудителя паразитарного зооноза Fasciola hepatica» от домашних или/и диких животных, которые были выявлены нами впервые.

Использование предлагаемого «Способа сбора при жизни паразита оплодотворенных яиц (in vitro) от возбудителя паразитарного зооноза Fasciola hepatica» от домашних или/и диких животных, по сравнению с известными способами: седиментации, флотации, комбинированными; сбора яиц путем разрушения гельминтов, имеет следующие преимущества:

нет необходимости в дефинитивных хозяевах паразита - в зараженных фасциолезом домашних (крупный рогатый скот, овцы, козы, верблюды, лошади и др.) или/и диких (олени, кабаны, архары, слоны и др.) животных, без наличия которых (и желательно в большом количестве и с большой интенсивностью инвазии!) ни один исследователь не может провести эксперименты;

известен вид фасциол: Fasciola hepatica (в отличие от известных способов сбора яиц: седиментации, флотации, комбинированного, когда неизвестен вид фасциол: Fasciola hepatica L., 1758, F. gigantica Cobbold, 1885, F. jacksoni Cobbold, 1869, F. indica Warma, 1953, или раса, штамм);

сокращает время и снижает трудоемкость исследований за счет исключения: необходимости сепарирования яиц Fasciola hepatica от других видов яиц родов и видов гельминтов: стронгилят: Nematodirus sp., Oesophagostomum sp.; Capillaria sp., трихоцефалов: Trichuris ( = Trichocephalus) sp., и ооцист эймерий, криптоспоридий (в отличие от известных способов сбора яиц фасциол: флотации, седиментации, комбинированных, при применении которых необходимо очищать сборы от большого количества других видов яиц гельминтов и ооцист простейших);

необходимости вскрытия ( = разрушения) возбудителя паразитарного зооноза Fasciola hepatica (в отличие от способа сбора яиц: разрушения гельминтов);

необходимости проведения многократного сбора яиц фасциол (тем более, что исследователь не может определить при использовании известных способов сборов яиц: флотации, седиментации, комбинированных - с каким видом, или расой, штаммом оперирует!) седиментационными и комбинированными методами исследования большого количества фекалий от дефинитивных хозяев фасциол - спонтанно зараженных домашних (крупный рогатый скот, овцы, козы, верблюды, лошади, северные олени, одомашненные лоси и др.) или/и диких (олени, кабаны, архары, зубры, бизоны и др.) животных, что затрудняет и удлиняет время работы лаборантов и научных сотрудников, особенно при слабой интенсивности инвазии и дает больше экономического эффекта при рациональном использовании труда научных сотрудников;

исключает: загрязненность сбора яиц обрывками частиц тканей от разрушенных Fasciola hepatica, загнивание и развитие секундарной бактериальной инфекции в сборе яиц полученного предлагаемым нами способом.

«Способ сбора при жизни паразита оплодотворенных яиц (in vitro) от возбудителя паразитарного зооноза Fasciola hepatica» от домашних или/и диких животных легко осуществим в лабораторных условиях;

предлагаемый способ обеспечивает до 100% сбор оплодотворенных яиц, полученных при жизни паразита, естественным путем, при произвольной откладке яиц живыми, половозрелыми возбудителями паразитарного зооноза Fasciola hepatica, в искусственной среде и при температуре свойственной жвачным, в пробирки с отфильтрованной и отцентрифугированной желчью 1:1 разбавленной изотоническим раствором (0,9%) хлорида натрия (solutio Natrii chlorati isotonica) и экспозицией пробирок при t=38-39°C (если Fasciola hepatica от крупного рогатого скота) и при t=39-40°C (если Fasciola hepatica от овец или/и коз) в условиях термостата в течение 5 часов, и последующего тщательного отмывания яиц в изотоническом растворе (0,9%) хлорида натрия, который необходим для исследований в условиях лаборатории или/и полевых экспериментов, при решении фундаментальных и прикладных научных задач в области эпизоотологии, терапии и профилактики фасциолеза домашних или/и диких животных.

Источники информации

1. Демидов Н.В. Трематодозы. Фасциолезы // В кн.: Гельминтозы жвачных животных. Под ред., проф., Е.Е. Шумаковича. - М. - Изд. «Колос». - 1968. - С.48-79.

2. Караре М.В., Абрамова В.Ф., Пасечник В.Е. Фасциолез овец и меры борьбы с ним в условиях Молдавии // В кн.: Повышение продуктивности животных в условиях интенсификации производства. - Кишинев. - Изд. «Штиинца». - 1982. - С.105-110.

3. Котельников Г.А. Гельминтологические исследования животных и окружающей среды // Справочник. - М: Колос, 1984. - 208 с.

4. Пасечник В.Е. Перекрестное заражение трихоцефалами приотарных собак и овец в Молдавии // Бюл. Всесоюзного института гельминтологии. - М. - 1984. - Вып. - 37. - С.57.

5. Пасечник В.Е. Дисс. … кандидата ветеринарных наук. - М. - ВИГИС. - 2000. - С.124-125.

6. Скрябин К.И. Метод полных гельминтологических вскрытий позвоночных, включая человека // Изд. 1-го Московского государственного университета. - М. - 1928. - 36 с.

7. Singh К.Р., Srivastava V.К., Prasad Α., Pandey A.P. Pathology due to Fasciola jacksoni in Indian elephants (Elephas indicus) // Indian Journal of Animal Sciences. - 1994. - 64 (8). - P. 802-804.