Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ МИКРОВОДОРОСЛИ Chlorella vulgaris, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОД СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ И СПИРТОВЫХ ПРОИЗВОДСТВ

Область применения

Изобретение относится к фотобиотехнологии и представляет собой новый штамм микроводоросли Chlorella vulgaris 711-54, предназначенный для очистки сточных вод сельскохозяйственных и спиртовых производств с попутным получением сырья для производства кормовых добавок.

Уровень техники

Безопасная утилизация жидкого навоза, помета и сточных вод, поступающих от производственных зон содержания и выращивания скота и птицы, а также из перерабатывающих цехов, - актуальная проблема, сдерживающая развитие сельскохозяйственного производства. Стоки животноводства отличаются высокой концентрацией органических веществ и биогенных минеральных элементов (Mulbry W., Kondrad S., Pizarro C., Kebede-Westhead E. Treatment of Dairy Manure Effluent Using Freshwater Algae: Algal Productivity and Recovery of Manure Nutrients Using Pilot-Scale Algal Turf Scrubbers. Bioresour. Technol. 2008, V.99, p.8137-8142; Афанасьев А. Анализ технологий переработки навоза и помета. Вестник ВНИИМЖ. 2012, т.4, стр.28-35).

Методология использования фотосинтезирующих микроорганизмов для очистки сточных вод разрабатывается уже более полувека (Oswald WJ., Gotaas Н.В. Photosynthesis in Sewage Treatment. Trans. Am. Soc. Civ. Eng. 1957, V.122, p.73-105), но исследования в области глубокой переработки отходов и очистки стоков животноводства с применением интенсивных культур фотоавтотрофных микроорганизмов в закрытых системах (фотобиореакторах) стали проводиться относительно недавно. Микроводорослям присуща высокая скорость роста и поглощения биогенных элементов (Sivakumar G., Xu J., Thompson R.W., Yang Y., Randol-Smith P., Weathers P.J. Integrated Green Algal Technology for Bioremediation and Biofuel. Bioresour. Technol. 2012, V.109, p.1-9). При этом микроводоросли обеспечивают так называемую фотосинтетическую аэрацию, выделяя в результате фотосинтеза кислород, эффективно окисляющий органические молекулы, а также поддерживающий рост гетеротрофных бактерий, также интенсивно утилизирующих органические компоненты отходов (Muñoz R., Guieysse В. Algal-Bacterial Processes for the Treatment of Hazardous Contaminants: A Review. Water Res. 2006, V.40, p.2799-2815). Кроме того, снижаются затраты энергии на очистку, поскольку частично либо полностью устраняется потребность в аэрации и механическом перемешивании (Mallick N. Biotechnological Potential of Immobilized Algae for Wastewater N, P and Metal Removal: A Review. BioMetals. 2002, V.15, p.377-390).

Способность микроводорослей к синтезу широкого спектра ценных соединений является важной составляющей при использовании этих микроорганизмов для биологической очистки сточных вод. К таким соединениям относятся липиды, содержащие незаменимые полиненасыщенные жирные кислоты, а также каротиноиды с витаминной и антиоксидантной активностью. Обогащенная липидами и углеводами биомасса микроводорослей, в том числе полученная при культивировании на стоках (Park J.B.K., Craggs R.J., Shilton A.N. Wastewater Treatment High Rate Algal Ponds for Biofuel Production. Bioresour. Technol. 2011, V.102, p.35-42), также может быть переработана в различные виды биотоплива, такие как биодизель, метан, биоводород и др. (Georgianna D.R., Mayfield S.P. Exploiting Diversity and Synthetic Biology for the Production of Algal Biofuels. Nature. 2012, V.488, p.329-335). Таким образом, использование микроводорослей обеспечивает более глубокую переработку отходов животноводства с попутным получением продуктов с более высокой добавленной стоимостью.

Эффективность изъятия биогенных элементов микроводорослями во многом определяется скоростью их роста (Olguín E.J. Phycoremediation: Key Issues for Cost-Effective Nutrient Removal Processes. Biotechnol. Adv. 2003, V.22, p.81-91), поэтому особого внимания в контексте очистки животноводческих стоков заслуживают быстрорастущие штаммы микроводорослей. Не менее важны такие характеристики, как способность к миксотрофному росту, толерантность к неблагоприятным факторам, высокая скорость оседания клеток, содержание ценных веществ в биомассе. Многочисленными исследователями показано, что одноклеточные зеленые водоросли (Chlorophyta) обладают наивысшей среди изученных микроводорослей толерантностью к условиям культивирования на эвтрофных сточных водах (Aslan S., Kapdan I.K. Batch Kinetics of Nitrogen and Phosphorus Removal from Synthetic Wastewater by Algae. Ecol. Eng. 2006, V.28, p.64-70).

Известно, что в пределах одного рода наблюдается существенная гетерогенность по толерантности к высоким концентрациям N, P и органических компонентов стоков. В одном из исследований Chlorella vulgaris оказалась более эффективной, чем Chlorella kessleri (Travieso L., Benitez F., Dupeiron R. Sewage Treatment Using Immobilied Microalgae. Bioresour. Technol. 1992, V.40, p.183-187), в другом случае Scenedesmus obliquus показал лучшие результаты по сравнению с С. vulgaris (Ruiz-Marin A., Mendoza-Espinosa L.G., Stephenson Т. Growth and Nutrient Removal in Free and Immobilized Green Algae in Batch and Semi-Continuous Cultures Treating Real Wastewater. Bioresour. Technol. 2010, V.101, p.58-64). Эффективные продуценты липидов и углеводородов, такие как Botriococcus braunii, также демонстрируют хороший рост на животноводческих стоках с высоким содержанием нитратного азота (Hoffmann J.P. Wastewater Treatment with Suspended and Nonsuspended Algae. J. Phycol. 2002, V.34, p.757-763).

Известен термофильный штамм водоросли Chlorella vulgaris N для получения биомассы (патент RU 2005777). Недостатком штамма Chlorella vulgaris N является узкий температурный спектр (42°C), приспособленность к условиям жаркого климата, например, Средней Азии и культивирование в специальных аппаратах промышленного типа (стеклотрубных установках).

Известен способ биологической очистки сточных вод рыбообрабатывающих предприятий с использованием штамма Chlorella kessleri IPPA С-112 (патент RU 2064454). Сущность способа заключается в обработке сточных вод микроводорослями Chlorella kessleri IPPA C-112 с целью формирования альгоценоза. Отработанная биомасса альгоценоза может быть использована для получения кормовой продукции для сельскохозяйственных животных. Недостатком этого способа является узкий спектр очистки - только сточных вод рыбообрабатывающих предприятий - и неполная очистка от микроорганизмов.

Известен штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris ИФР N С-111, обладающий высокой продуктивностью и отвечающий требованиям промышленного культивирования (а.с. SU 1751981). Недостатком штамма Chlorella vulgaris ИФР N С-111 является сезонность в развитии (с мая по декабрь), требовательность к составу питательной среды, стойкий цикл развития клеток, узкий спектр температуры культивирования (26-36°C).

Известен способ для биологической очистки водных растворов. Способ заключается в обработке водных растворов штаммом микроводоросли Chlorella vulgaris ИФР N С-Ш при нагрузке 10⁷-10⁹ кл./л. Изобретение позволяет очищать водные растворы от примесей различного происхождения. Изобретение предназначено для очистки водных растворов бытовых и промышленных сточных вод. Недостатком данного способа является то, что он не предполагает дальнейшего использования биомассы микроводорослей.

Наиболее близким аналогом предлагаемого изобретения (прототипом) является штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris BIN (патент RU 2192459), обладающий широким спектром температуры культивирования (20-40°C), нетребовательного к питательной среде и способного к высокой степени очистки различных категорий сточных вод. Использование этого штамма показало высокую пластичность в отношении очистки различных категорий сточных вод. Недостатками прототипа являются накопление биомассы культурой Chlorella vulgaris BIN 60-65 г сухого веса/м² в сутки, что ниже показателей предлагаемого изобретения практически в 3 раза, более низкая степень очистки сточных вод по нитратам и аммонийному азоту - до 91 % за 3 суток, в отличие от которого у заявленного штамма она составляет около 100% за 2,5 суток, степень очистки по ХПК у прототипа составляет 81 %, что также ниже аналогичных показателей у предлагаемого изобретения на 11-13%.

Раскрытие изобретения

Задача изобретения - получение штамма микроводоросли для очистки сточных вод сельскохозяйственных и спиртовых производств с попутным получением сырья для производства кормовых добавок, характеризующегося высокой степенью очистки сточных вод, продуктивностью и значительным содержанием ценных соединений в биомассе.

Техническим результатом настоящего изобретения является получение штамма микроводоросли, способного к активному росту на средах, близких к сточным водам птицефабрик и спиртовых производств, обладающего высокой способностью к извлечению биогенных элементов из сточных вод, а также к деструкции содержащихся в сточных водах органических загрязнителей.

Поставленная задача была решена получением штамма микроводоросли Chlorella vulgaris 711-54, названного авторами изобретения Chlorella vulgaris 711-54 и выделенного из опресненных ванн острова Костьян Ругозергской губы Кандалашского залива Белого моря. Выделенный штамм Chlorella vulgaris 711-54 был депонирован в Российской Коллекции Микроводорослей при учреждении Российской Академии Наук Институте Физиологии Растений им. К.А. Тимирязева (IPPAS) с присвоенным идентификатором IPPAS C-2015.

Сущность изобретения заключается в том, что для достижения цели используют зеленую микроводоросль Chlorella vulgaris штамм 711-54, выделенный и идентифицированный авторами заявки, сиквенс которого зарегистрирован в международной базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) под номером KF006337. В результате полученный штамм характеризуется способностью расти на средах, близких по составу к сточным водам птицефабрик и спиртовых производств, высокой способностью к извлечению биогенных элементов из сточных вод, а также к деструкции содержащихся в сточных водах органических загрязнителей. При этом биомасса микроводоросли Chlorella vulgaris шт. 711-54 содержит значительное количество ценных соединений. Для выращивания используют модельную среду (вытяжка из куриного помета), сточные воды птицефабрик или сточные воды спиртовых производств. Инокулят вносят в среду при конечной концентрации хлорофилла в смеси 8-16 мкг/мл, культивирование проводят в фотобиореакторе при постоянном освещении с интенсивностью 50-120 мкЕ ФАР м^-2 с^-1 с помощью светодиодов при постоянном барботировании среды атмосферным воздухом, при скорости барботажа - 0,2-0,4 л/мин при температуре 25-27°C. После этого отделяют биомассу от среды центрифугированием. В результате получают накопление биомассы 160-180 г сухого веса/м² в сутки; степень очистки модельной среды по нитратам и аммонийному азоту - до 99-100% за 2,5 суток; ХПК (окисляемость) - допустимая нагрузка до 2400-2500 мг/л.

Краткое описание чертежей

На Фиг.1 представлен жирнокислотный состав липидов клеток (биомассы) микроводоросли Chlorella vulgaris 711-54 после трех суток культивирования на модельной среде, содержащей водную вытяжку из куриного помета. На диаграмме показано процентное содержание основных жирных кислот липидов клеток микроводоросли.

На Фиг.2 приводится частичная последовательность нуклеотидов гена 18S pРНК микроводоросли Chlorella vulgaris 711-54.

На Фиг.3 показана кинетика изъятия нитрата клетками микроводоросли Chlorella vulgaris 711-54 при полунепрерывном культивировании методом отбора-долива на модельной среде, содержащей водную вытяжку из куриного помета (показано три цикла длительностью по 3 сут каждый, моменты долива среды показаны стрелками).

На Фиг.4 показана характерная кинетика изъятия нитрата клетками микроводоросли Chlorella vulgaris 711-54 при полунепрерывном культивировании методом отбора-долива на модельной среде, содержащей послеспиртовую барду.

Осуществление изобретения

Штамм Chlorella vulgaris 711-54 выделен из опресненных ванн острова Костьян Ругозергской губы Кандалакшского залива Белого моря. Отселектирован в результате скрининга по толерантности к высоким концентрациям загрязнителей в сточных водах.

Способ выделения - интенсивное культивирование на среде BG-11.

Морфологические признаки

Клетки шаровидной или слабоэллипсоидной формы, размером от 2 до 3 мкм. Хроматофор чашевидный, окраска зеленая, клетки не осаждаются, в суспензии распределены равномерно.

Физиологические свойства штамма

Оптимальные условия культивирования:

Для культивирования используют жидкую питательную среду BG-11 следующего состава:

K₂HPO₄ - 0,04 г/л,

NaNO₃ - 1,5 г/л,

MgSO₄·7H₂O - 0,075 г/л,

CaCl₂·2H₂O - 0,037 г/л,

лимонная кислота - 0,006 г/л,

FeSO₄·7H₂O - 0,006 г/л,

Na₂CO₃ - 0,2 г/л,

ЭДТА - 0,001 г/л,

раствор FeSO₄·7H₂O (7,45 г/л) + ЭДТА (5,57 г/л) - 1 мл/л,

раствор микроэлементов (H₃BO₃ - 2,86 г/л, MnCl₂·4H₂O - 1,86 г/л, ZnSO₄·7H₂O - 0,22 г/л, CuSO₄·5H₂O - 0,08 г/л, Na₂MoO₄·7H₂O - 0,39 г/л, Co(NO₃)₂·6H₂O - 0,05 г/л) - 1 мл/л,

pH - 7,1-7,2,

содержание CO₂ в ГВС - 2%,

скорость барботажа 0,3 л/мин,

температура 27°C,

освещение круглосуточное,

освещенность: 5-12 Вт/м², 50-120 мкмоль квантов ФАР на м² в сек,

тип ламп: люминесцентные либо белые светодиодные.

Продуктивность в оптимальных условиях культивирования:

по накоплению биомассы (сухой вес, мг/мл в сутки): 250;

скорость роста 0,2-0,3 млн/мл в сутки;

выход полезного продукта (липиды) 20-30 мг/сутки на мг биомассы.

Для данной культуры отсутствует сезонность, отмечается высокая бактерицидность, не выявлен автолиз, характерная слабая агглютинация.

Характеристика роста культуры при доочистке сточных вод:

Состав биомассы (Фиг.1, Табл.1).

Биотехнологическая характеристика штамма

Штамм Chlorella vulgaris 711-54 обладает следующими ценными биотехнологическими характеристиками: интенсивный рост на сточных водах спиртовых производств и птицеводческих ферм с эффективным изъятием биогенных элементов; биомасса, обогащенная нейтральными липидами и каротиноидами, пригодная для производства кормовых добавок.

Генотипирование

Выделение ДНК

Для выделения ДНК отбирали 5-10 мг биомассы культуры микроводоросли. Выделение ДНК проводили методом фенол-хлороформной экстракции. Перед выделением проводили трехкратное замораживание образцов при -4°C с последующим оттаиванием. Это было необходимо для разрушения прочных клеточных стенок водорослей. Образцы инкубировали в течение часа в 300 мкл TE буфера (10 mM Tris-Cl (pH 7.5), 1 mM EDTA), содержащего 10 мг/мл лизоцима при 37°C. Затем добавляли 2% додецилсульфата натрия и инкубировали в течение часа при 40°C и интенсивном перемешивании. Далее добавляли 1 М NaCl и оставляли на ночь на льду для высаливания белков. После чего проводили процедуру фенол-хлороформной экстракции. Чистоту образцов ДНК оценивали методом электрофореза в 1,5% агарозном геле. Полученные образцы ДНК хранили в TE-буфере при -4°C.

Множественное выравнивание

Проведено множественное выравнивание известных нуклеотидных последовательностей Chlorella для участка генов 18S рибосомальной РНК (далее pРНК), включающих в себя последовательности ITS1, ITS2 с использованием программы ClustalW. На основании полученного выравнивания определены консервативные области данного участка и к ним подобраны олигонуклеотидные праймеры:

For 5′-TGGCTCATTAAATCAGTTATAG-3′,

Rev 5′-CCAAGAATTTCACCTCTGACA-3′.

С использованием полученной пары праймеров проведена ПЦР амплификация соответствующих участков геномной ДНК исследуемых изолятов. Продукты ПЦР очищены с использованием набора для очистки Cleanup Standard (Евроген, Россия) и отсеквенированы с использованием автоматического секвенатора. Для культуры получена последовательность нуклеотидов как смысловой, так и антисмысловой цепи ДНК (Фиг.2).

При помощи программы BLAST в базе данных GenBank был проведен поиск ближайших гомологов исследуемых последовательностей. Наибольшее сходство наблюдалось с последовательностями генов 18S pРНК водорослей из родов Chlorella. При помощи полученного множественного выравнивания в программе ClustalW было построено филогенетическое дерево.

Филогенетический анализ

В результате анализа полученного в работе множественного выравнивания имеющуюся последовательность можно отнести к роду Chlorella.

В результате проведенного филогенетического анализа установлена видовая принадлежность исследуемого изолята. Изолят 54 идентифицирован как Chlorella vulgaris Beyerinck 1890 и получил идентификатор 711-54; после депонирования в Российской Коллекции Микроводорослей при учреждении Российской Академии Наук Институте Физиологии Растений им. К.А. Тимирязева (IPPAS) ему присвоен идентификатор IPPAS C-2015.

Полученный сиквенс зарегистрирован в международной базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) под номером KF006337.

Следующие материалы иллюстрируют достижение цели.

Накопление биомассы у культуры Chlorella vulgaris штамм 711-54 на модельной среде составляет 160-180 г сухого веса/м² в сутки, что превышает показатели прототипа практически в 3 раза; степень очистки модельной среды по нитратам и аммонийному азоту - до 99-100% за 2,5-3 суток (Фиг.3), что на 10% выше, чем у прототипа; ХПК (окисляемость) - допустимая нагрузка для промышленных сточных вод до 20000-22000 мг/л, что соответствует показателям прототипа; степень очистки по ХПК составляет 92-93% (Фиг.4), что превышает аналогичные показатели у прототипа на 11-13%.

Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris 711-54 успешно прошел предварительное тестирование и этап пробного культивирования в экспериментальных и полупромышленных фотобиореакторах объемом до 50 л. Таким образом, можно считать степень готовности штамма к масштабированию культуры для промышленного применения высокой.

В результате получен штамм микроводоросли Chlorella vulgaris 711-54, депонированный в Российской Коллекции Микроводорослей при учреждении Российской Академии Наук Институте Физиологии Растений им. К.А. Тимирязева (IPPAS) с присвоенным идентификатором IPPAS C-2015, который обладает более высокими показателями степени очистки сточных вод сельскохозяйственных и спиртовых производств и большей продуктивностью по сравнению с известными аналогами.