ШТАММ Pseudomonas azotoformans ДЛЯ ОЧИСТКИ МОРСКИХ ВОДОЕМОВ И ПРИБРЕЖНОЙ ЗОНЫ МОРСКИХ ОБЪЕКТОВ ОТ НЕФТИ В УСЛОВИЯХ ВЫСОКИХ ШИРОТ

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения нового штамма бактерий, эффективного для очистки морских экосистем от загрязнений нефтью, в течение 3-10 суток в диапазоне температур от +1°С до +20°С.

Известен штамм Pseudomonas putida 36 (авт.св. SU 1076446 А1, 1984, бюл. №81), пригодный для очистки от нефти и нефтепродуктов пресной и морской воды (до 7,5% солености) в широком диапазоне температур (10-26°С).

Недостатком штамма является снижение эффективности очистки вод от нефти при температуре ниже +10°С и снижении уровня растворенного кислорода.

Известен штамм Mycobacterium flavescens (патент RU 2053296 C1, 1996, бюл. №3), обладающий высокой способностью к утилизации нефти и нефтепродуктов.

Недостатком штамма является его высокая чувствительность к температуре среды и насыщенности среды кислородом.

Известен штамм Mycobacterium species ЦКМ В 65-Б (патент RU 2129603 C1, 1999, бюл. №22), используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов в широком диапазоне температур (10-26°С).

Недостатком штамма является снижение эффективности очистки вод от нефти при температуре ниже +10°С и снижения уровня растворенного кислорода, что не позволяет ожидать эффективной очистки донных отложений от нефти.

Задача изобретения - получение штамма бактерий, обеспечивающего разрушение тяжелых парафинов и полиароматических соединений в загрязненных морских водоемов от нефти в диапазоне температур от +1°С до +20°С при низком содержании кислорода.

Штамм Pseudomonas azotoformans BKM B-2762D выделен в 2010 году из накопительной культуры проб загрязненного нефтью донного грунта солоновато-водного озера с глубины 1,0 м в зоне хронического нефтяного загрязнения путем высева водного разведения испытуемой пробы методом предельных разведений аликвоты по 100 мкл на поверхность агаризованной среды с жидкими алканами. Авторский номер КМ-161СА. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов, номер BKM B-2762D.

В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид не значится.

Штамм Pseudomonas azotoformans BKM B-2762D растет на агаризованной среде, содержащей жидкие алканы в качестве единственного источника углерода и характеризуется следующими морфологическими, культуральными и физиологическими признаками:

Грамотрицательные прямые подвижные палочки с полярно расположенными жгутиками.

Колонии на питательном агаре округлой формы с ровными краями, выпуклые, прозрачные, белесые с желтоватым оттенком.

Консистенция слизистая.

Выделяет в среду дифундирующий флюоресцирующий желто-зеленый пигмент.

Аэроб, факультиативный анаэроб, способен к денитрификации.

Оксидазоположительный, каталазоположительный, хемоорганотроф.

Режим хранения штамма - длительное хранение в лиофилизированной форме в плотно запаянных стеклянных ампулах.

Кратковременное хранение (для подготовки биомассы с целевым использованием) - периодические пересевы - 1 раз в 2 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды следующего состава: на 1000 мл воды - пептон 15 г, NaCl - 15; NaNO₃ - 2,0 г; KH₂PO₄ - 1,0 г; KCl - 0,5 г; MgSO₄×5H₂O - 0,5 г; агар микробиологический - 20,0; в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1°С.

Среда для культивирования следующего состава: на 1000 мл воды: NaNO₃ - 3,0; KH₂PO₄ - 1,0; KCl - 0,5; MgSO₄5H₂O - 0,5; FeSO₄ - 0,01; NaCl - 15; пептон ферментативный - 20,0; дрожжевой экстракт (дрожжевой автолизат) - 1,0; алканы (или сырая нефть) - 10,0; рН 6,0-7,0; культивирование при 15-25°С на качалке при 220 об/мин, 3 суток.

Способность штамма к биодеструкции нефтяных углеводородов в водной и почвенной средах изучали в лабораторных опытах, результаты приведены в примерах ниже.

Пример 1. Изучение нефтеокисляющих свойств штамма в водной среде. Биомассу штамма Pseudomonas azotoformans BKM B-2762D для проведения опытов нарабатывали на предварительно простерилизованной питательной среде, содержащей морскую воду 1000 мл (соленость 1,8%), пептон 15 г, NaNO₃ - 2,0 г; KH₂PO₄ - 1,0 г; KCl - 0,5 г; MgSO₄×5H₂O - 0,5 г, жидкие алканы 10 мг. Чистую культуру вносили в колбы, содержащие 100 мл стерильной питательной среды со скошенного агара на конце петли, колбы устанавливали на шейкер при 220 об/мин и проводили наработку биомассы в течение 3 суток при температуре +15°С. Титр клеток в готовом препарате составлял 10¹⁰ на 1 мл.

Затем в предварительно простерилизованную морскую воду, взятую в количестве 100 мл, вносили 5 мл нефти, добавляли 1 мл готового препарата и оставляли на 10 суток при температуре +1°С -+5°С для деструкции. Колбы периодически встряхивали. В контрольные колбы препарат не вносили. Через 30 суток проводили анализ нефтяных фракций в опытных колбах.

Краткое описание чертежей.

Фиг. 1 представляет собой график разрушения нафтеновых углеводородов нефти штаммом Pseudomonas azotoformans BKM B-2762D.

Фиг. 2 представляет собой график динамики снижения концентрации нефти в почве в результате обработки суспензией Pseudomonas azotoformans BKM B-2762D.

Как видно на Фиг. 1, исследуемый штамм эффективен для разрушения нафтеновой фракции нефти без принудительной аэрации, о чем говорит значительное снижение массовой доли алкановых соединений в диапазоне длины их цепи от 11 до 40 атомов.

Оценка концентрации полиароматических соединений: таблица 1 показала, что сумма ПАУ в опыте снижается почти в 10 раз, причем массовая доля приоритетных ксенобиотиков снижается более чем в 12 раз.

Массовая доля растворенных углеводородов за 10 суток снижается с 5,26 до 0,15 мг/дм³.

Полученные результаты позволили сделать вывод о перспективности полученного штамма для очистки морских вод от нефти как на поверхности, так и в массе донных отложений, поскольку штамм проявляет активность при ограничении доступа кислорода (без режима принудительного аэрирования).

Для проверки возможности очистки от нефтяного загрязнения береговой зоны мы поставили следующий опыт.

Пример 2. Очистка от нефти поверхности почвы береговой зоны морского объекта

Почвы береговой зоны приморских объектов, загрязненных нефтью, отличаются высоким содержанием солей. Для опыта были взяты пробы с берега загрязненного приморского объекта. Концентрация нефти в почве составила 167 мг/г. Почву по мере подсыхания увлажняли морской водой с уровнем солености 1,8%.

Обработку почвы проводили суспензией рабочего, 1% раствора биопрепарата, из расчета 10 мл рабочего раствора на 100 г почвы трехкратно в течение опыта с периодичностью 1 раз в 2 недели. Опыт длился 2 месяца при температуре +10°С -+20°С.

Результаты опыта по динамике снижения концентрации загрязнения почвы представлены на Фиг. 2.

За два месяца уровень загрязнения почвы снизился до 4 мг нефти на 1 г почвы. Полученные данные позволяют рекомендовать полученный штамм для проведения очистки береговой зоны приморских объектов от нефти.