Результат интеллектуальной деятельности: МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО ПРОТИВ ИНТЕРЛЕЙКИНА-6 ЧЕЛОВЕКА И ГИБРИДОМА, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ ДАННОЕ МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к антителам, связывающим интерлейкин-6 и блокирующих его биологическую активность, а также к технологии их получения.

Интерлейкин-6 (ИЛ-6) представляет собой цитокин, продуцируемый многими типами клеток, стимулирующий пролиферацию активированных антигеном В-лимфоцитов и Т-лимфоцитов, усиливающий активность Т-киллеров, стимулирующий гранулоцитарный росток кроветворения, синтез в печени большинства белков острой фазы воспаления, рост кератиноцитов и нервных клеток (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. С-Пб, 2008). Вместе с тем, при ряде заболеваний, таких как ревматоидный артрит, остеопороз, болезнь Альцгеймлера, инфаркт миокарда, ряд онкологических заболеваний (почечно-клеточная карцинома, рак предстательной железы и мочевого пузыря, злокачественные заболевания, связанные с пролиферацией В-клеток, в частности множественная миелома, хронический лимфоцитарный лейкоз) и другие, наблюдается повышение уровня продукции ИЛ-6. Так как ИЛ-6 участвует в патогенезе многих из перечисленных выше заболеваний, связывание избытка ИЛ-6 и/или блокирование его биологической активности представляются перспективными для их лечения.

ИЛ-6 может связываться с рецептором ИЛ-6, экспрессируемым на активируемых митогеном В-клетках, Т-клетках, периферических моноцитах и некоторых опухолях (Ishimi Y. et al., Immunology 145:3297-3303 (1990)). Рецептор ИЛ-6 имеет по меньшей мере две различные формы и состоит из альфа-цепи, называемой gp80, которая ответственна за связывание с IL-6, и из бета-цепи, называемой gp130, которая необходима для передачи сигнала (Adebanjo О. et al., Cell Biology 142:1347-1356 (1998) и Poli V. et al., EMBO 13:1189-1196 (1994)).

Известны по меньшей мере две главные биологические функции ИЛ-6: опосредование белков острой фазы воспаления и действие в качестве фактора дифференцировки и активации (Avvisti G. et al., Baillieres Clinical Hematology 8:815-829 (1995) и Poli V. et al., EMBO 13:1189-1196 (1994)). Известно, что белки острой фазы регулируют иммунные ответы, опосредуют воспалительные процессы и играют определенную роль в ремоделировании ткани. ИЛ-6, в качестве фактора дифференцировки и активации, индуцирует дифференцировку В-клеток и секрецию антител, индуцирует дифференцировку Т-клеток в цитотоксические Т-клетки, активирует факторы передачи клеточных сигналов и стимулирует гемопоэз (Ishimi Y. et al., J. Immunology 145:3297-3303 (1990)). Очевидно, что ИЛ-6 участвует во многих важных функциях организма и в протекающих в нем процессах. В результате этого физиологические процессы, включая метаболизм костной ткани, опухолевую трансформацию и иммунные и воспалительные ответы, могут усиливаться, подавляться или предотвращаться путем модификации биологической активности ИЛ-6 in vivo под действием специфического антитела (Adebanjo О. et al., J. Cell Biology 142:1347-1356 (1998)).

Было показано, что антитело против ИЛ-6 может ингибировать in vivo рост опухолей предстательной железы (Smith Р.С. & Keller E.T. The Prostate in press & Okatomo M. et al., Cancer Research 57:141-146 (1997) и карциномы почек (Weissglas M. et al., The Journal of Urology 153:554-557 (1995)). Помимо прямого влияния на рост опухоли, блокирование продуцирования ИЛ-6 может также ингибировать деградацию костей и кахексию при раке.

Были получены мышиные, крысиные и кроличьи моноклональные антитела, а также химерные и гуманизированные антитела к ИЛ-6 человека, в частности, нейтрализующие его биологическую активность, однако ни одно из них в настоящее время не внедрено в клиническую практику. Так, известны мышиные моноклональные антитела против ИЛ-6, например CLB-8, которое обладает высокой аффинностью ((Brakenhoff et al., J. Immunol. (1990) p.145-561); US 5618700, 1988). Однако, мышиное антитело является в высокой степени иммуногенным для человека, а поэтому оно имеет ограниченное терапевтическое применение.

В патенте США №5856135, 1999 описаны реконструированные человеческие антитела против человеческого ИЛ-6, происходящие от мышиного моноклонального антитела SK2, в котором гипервариабельные области (CDR) из вариабельной области мышиного антитела SK2 были перенесены в вариабельную область человеческого антитела и присоединены к константной области человеческого антитела. Недостатком данных антител также является их иммуногенность для человека.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является химерное (мышь-человек) антитело CLB8 к ИЛ-6 человека и технология его получения (RU2318829, 2008). Антитело CLB8 нейтрализует 50% активности ИЛ-6 человека (измеренной по пролиферации клеток В-клеточной миеломы мыши, индуцированной ИЛ-6 человека) при молярном соотношении антитело/ИЛ-6, равном 1,8.

Задачей настоящего изобретения являлось расширение спектра антител к ИЛ-6 человека с целью получения антител, обладающих более высокой способностью к ингибированию биологической активности ИЛ-6 человека, на основе которых можно создать антитела, пригодные для клинического применения, т.е. химерные и гуманизированные антитела.

Технический результат был достигнут получением мышиного моноклонального антитела (авторское название антитела 6ИЛ-9), специфично и с высокой аффинностью связывающегося с ИЛ-6 человека и ингибирующего его биологическую активность, а также получением гибридомы мышей 6ИЛ-9, продуцирующей данное моноклональное антитело.

Было установлено, что полученное антитело связывается с ИЛ-6 человека специфично и с высокой аффинностью и ингибирует его биологическую активность.

Полученное моноклональное антитело против ИЛ-6 человека содержит гипервариабельные участки тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO 5-7 и гипервариабельные участки легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO 8-10.

Указанные гипервариальные участки могут, в частности, входить в последовательности вариабельной области тяжелой цепи по SEQ ID NO 3 и последовательности вариабельной области легкой цепи по SEQ ID NO 4.

Анализ последовательностей гипервариабельных участков (участков CDR) вариабельных частей легкой и тяжелой цепей полученного моноклонального антитела 6ИЛ-9 показал, что они существенно отличаются от аналогичных участков CDR всех известных моноклональных антител к ИЛ-6 человека, включая RU 2318829, 2008.

Как правило, указанное моноклональное антитело против интерлейкина-6 человека получают с помощью ДНК, содержащей последовательности нуклеотидов по SEQ ID NO 1 и SEQ ID NO 2. Данная ДНК экспрессируется в клетках мышиной гибридомы, штамм которой (авторское наименование штамма - 6ИЛ-9), был депонирован в Российской коллекции клеточных культур под номером РККК(П) 751 Д.

Родословная штамма: Родительские клетки гибридомы SP2/0, антиген - интерлей-кин-6 человека, сливающий агент - ПЭГ/ДМСО, система селекции гибридных клеток -HAT, кратность клонирования - 4, процент позитивных клонов - 100%.

Культуральные свойства: культивирование в матрасах, посевная доза 200000 клеток/мл, кратность рассева 1:3, требует фидерных макрофагов при разморозке.

Стандартные условия выращивания: среда RPMI-1640, 10% фетальной сыворотки, 37°С, 5% CO₂.

Характеристика культивирования гибридомы в организме животного: Мыши Balb/c или F2 (Balb/c×DBA) 1,5-2,0×106 клеток, 14-20 дней, перевиваемая.

Штамм продуцирует моноклональное антитело 6ИЛ-9 к интерлейкину-6 человека. Изотип IgG1, каппа. Антитело, специфически связываясь, нейтрализует биологическую активность интерлейкина-6 человека в тесте на клеточной линии В 9. 50% нейтрализация ИЛ-6 человека наблюдается при молярном соотношении антигена и антитела 1 к 1,48.

Моноклональное антитело 6ИЛ-9 накапливается в асцитной жидкости в концентрации не менее 1,0 мг/мл. Стабильность продукции антител сохраняется на протяжении 25 пассажей в культуре и 5 пассажей на животных.

Способ криоконсервирования: фетальная сыворотка с 10% DMSO, заморозка до -70°С со скоростью 1°С/мин, далее помещение в жидкий азот, жизнеспособность после размораживания и отмывки от криоконсерванта 80% (с трипановым синим).

Изобретение поясняется следующими чертежами и последовательностями.

На фиг.1 показан электрофорез очищенного антитела 6ИЛ-9 в полиакриламидном геле 4-20% полиакриламидный гель с ДДС-Na, где дорожки:

1 - антитело 6ИЛ-9 (1 мкг/мл) 5 мкл, нативные условия;

2 - белки-маркеры молекулярного веса 97, 66, 45, 30, 20, 14 кДа;

3 - антитело 6ИЛ-9 (1 мкг/мл) 5 мкл, восстановленные условия.

На фиг.2 показано связывание антитела 6ИЛ-9 с интерлейкином-6 (ИЛ-6) человека в иммуноблоте (электрофорез в 4-20% полиакриламидном геле с Na ДДС, иммуноблот с антителом ИЛ-6-9). Дорожки:

1 - ИЛ-6 человека (5 мкг), восстановленные условия;

2 - ИЛ-6 человека (5 мкг), нативные условия;

3 - маркеры молекулярного веса, окраска Кумасси R250.

На фиг.3 показано определение изоэлектрической точки антитела 6ИЛ-9 (изофокусирование в полиакриламидном геле Pharmalyte 3-10). Использованы следующие обозначения:

1 - маркеры изоэлектрической точки;

2 - антитело 6ИЛ-9 (1 мкг/мкл) 5 мкл;

3 - антитело 6ИЛ-9 (1 мкг/мкл) 15 мкл.

Перечень последовательностей:

Seq ID NO:1 Последовательность нуклеотидов, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи моноклонального антитела 6ИЛ-9

Seq ID NO:2 Последовательность нуклеотидов, кодирующая вариабельную область легкой цепи антитела 6ИЛ-9

Seq ID NO:3 Последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела 6ИЛ-9

Seq ID NO:4 Последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи моноклонального антитела 6ИЛ-9

Seq ID NO:5 Последовательность аминокислот участка CDRH-1 моноклонального антитела 6ИЛ-9

Seq ID NO:6 Последовательность аминокислотучастка CDRH-2 моноклонального антитела 6ИЛ-9

Seq ID NO:7 Последовательность аминокислот участка CDRH-3 моноклонального антитела 6ИЛ-9

Seq ID NO:8 Последовательность аминокислот участка CDRL-1 моноклонального антитела 6ИЛ-9

Seq ID NO:9 Последовательность аминокислот участка CDRL-2 моноклонального антитела 6ИЛ-9

Seq ID NO:10 Последовательность аминокислот участка CDRL-3 моноклонального антитела 6ИЛ-9

Существо изобретения демонстрируется следующими примерами.

Пример 1. Иммунизация мышей и получение гибридомы

Мышей линии Balb/c иммунизировали очищенным рекомбинантным ИЛ-6 человека, для чего 15 мкг ИЛ-6 в объеме 50 мкл смешивали с 50 мкл полного адъюванта Фрейнда и вводили в подушечки лап задних конечностей. Через 30 дней и через 51 день производили вторую и третью иммунизации, отличавшиеся от первой заменой полного адъюванта Фрейнда на неполный. Еще через 21 день проводили бустирование внутривенным введением ИЛ-6 в дозе 10 мкг/мышь, через 4 дня после бустирования животных забивали и из их селезенок и периферических лимфоузлов выделяли лимфоциты. Слияние полученных лимфоцитов с клетками миеломы Sp2/0 проводили с помощью полиэтиленгликоля по стандартной методике. После селекции на селективной питательной среде, содержащей HAT, из 5300 ячеек с растущими клетками отбирали образцы культуральной жидкости для скрининга антител к ИЛ-6 человека с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. Полученные три позитивных клона подвергали дальнейшему клонированию и размножению. В результате нескольких циклов выращивания и скрининга был отобран клон гибридных клеток 6ИЛ-9, стабильно секретирующих высокоаффинное антитело 6ИЛ-9 к ИЛ-6 человека.

Пример 2. Очистка моноклонального антитела и его свойства

Антитело 6ИЛ-9 из асцитной жидкости мышей линии Balb/c внутрибрюшинно привитой гибридомой 6ИЛ-9 выделяли с помощью гель-проникающей и ионообменной хроматографии для его дальнейшей характеризации.

По результатам электрофореза в 4-20% полиакриламидном геле с ДДС натрия молекулярный вес антитела 6ИЛ-9 в нативных (невосстановленных) условиях соответствует ожидаемому для нативного IgG мыши (160 кДа), в восстановленных условиях антитело диссоциирует на тяжелую (52 кДа) и легкую (28 кДа) цепи (фиг.1). Для изучения связывания ИЛ-6 антителом 6ИЛ-9 препарат ИЛ-6 человека подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле в тех же условиях. После окончания электрофореза материал переносили на нитроцеллюлозу, которую инкубировали с раствором антитела 6ИЛ-9, а затем с антителами козы против иммуноглобулинов мыши, конъюгированными с пероксидазой хрена. Дорожку с белками-маркерами молекулярного веса окрашивали Кумасси (фиг.2). Антитело 6ИЛ-9 взаимодействует в иммуноблоте с рекомбинантным ИЛ-6, который в восстановленных условиях обладает молекулярным весом в 18 кД, а в невосстановленных условиях представлен двумя полосами с молекулярными весами 18 кД и 40 кД, что соответствует мономеру и димеру ИЛ-6 человека.

С помощью иммуноферментного набора фирмы Sigma ISO-2 kit 072K4849 был установлен изотип тяжелой цепи антитела 6ИЛ-9 - G1 и легкой цепи - λ. С помощью иммуноферментного анализа было установлено, что антитело 6ИЛ-9 не связывается с белками сыворотки крови и селезенки мышей, а также с белками сыворотки крови человека и растворимыми белками гомогената культивируемых клеток яичников китайского хомячка (СНО). Изоэлектрическая точка находится в диапазоне рН 6,4-6,8 (фиг.3).

Константа диссоциации по ИЛ-6 человека, определенная с помощью иммуноферментного анализа и вычисленная по Скэтчарду, составляет 1×10^-10 М.

Пример 3. Ингибирование антителом 6ИЛ-9 биологической активности ИЛ-6 и определение 1С50%

Антитела 6ИЛ-9 в серийных разведениях в диапазоне от 1,25×10^-7 М до 1,25×10^-12 М инкубировали с 8,4×10^-12 М ИЛ-6 человека в течение 2 часов, после чего по 100 мкл смеси антитело-ИЛ-6 вносили к клеткам В9 (по 5×10³ клеток в среде RPMI 1640 на пробу, контроль - клетки без ИЛ-6 и с ИЛ-6 без антитела). Клетки культивировали в течение 72 часов при 37ºС и 5% СО₂, за 6 часов до окончания культивирования к клеткам добавляли Н-тимидин. Пролиферацию клеток, индуцированную ИЛ-6, оценивали по включению в кислотонерастворимый остаток Н-тимидина и выражали числом импульсов в минуту, а ингибирование биологической активности ИЛ-6 выражали в процентах подавления включения Н-тимидина (табл.1).

Из приведенных данных следует, что 50% ингибирование активности ИЛ-6 наступает при молярном соотношении 6ИЛ-9/ИЛ-6, равном 1,48, что указывает на высокую нейтрализующую активность антитела 6ИЛ-9.

Пример 4. Синтез и секвенирование кДНК, кодирующих вариабельные части легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела 6ИЛ-9

Из клеток гибридомы 6ИЛ-9 выделяли РНК, на матрице которой с помощью наборов синтетических праймеров (Immunogenetics Information System http://www.imgt.org) были амплифицированы фрагменты генов, кодирующие вариабельные области тяжелой (VH) и легкой (VL) цепей антитела. Полученные фрагменты генов были клонированы в вектор pALTA (Евроген) и сиквенированы с внешних праймеров (М13). Последовательности фрагментов генов, кодирующих VH и VL, представлены на SEQ ID No:1 и SEQ ID No:2, вычисленные аминокислотные последовательности VH и VL представлены на SEQ ID No 3 и SEQ ID No 4. Анализ последовательностей аминокислот вариабельных областей тяжелой и легкой цепей моноклонального антитела 6ИЛ-9 производили по методу Кэбота (Kabat E.A., Wu, T.T., Perry, H., Gottesman, K. and Foeller, C. (1991) Sequences of Proteins oflm-munological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No.91-3242), что позволило выделить участки CDR, определяющие комплементарность антитела антигену (табл.2).

Последовательности аминокислот Seq ID NO:5-10 с помощью программы BLAST (National Center for Biotechnology Information http://www.ncbi.rilm.nih.gov) сравнивали с последовательностями вариабельных областей тяжелых и легких цепей известных моноклональных антител к ИЛ-6 человека. Участков гомологии не обнаружено.

Гибридома 6ИЛ-9 была помещена в Российскую коллекцию клеточных культур под номером РККК(П)751 Д.