Результат интеллектуальной деятельности: ПРОДУКТЫ СЛИЯНИЯ АМИНИРОВАННЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ

Изобретение относится к продукту слияния, который включает, по меньшей мере, полисахариды T1 и T2, причем моносахариды, из которых образованы полисахариды T1 и T2, частично или полностью соединены друг с другом альфа-1,4-гликозидными связями, и по меньшей мере один из полисахаридов Т1 и/или T2 имеет по меньшей мере одну аминогруппу, и Т1 и T2 посредством по меньшей мере одного связывающего элемента Z связаны химическими ковалентными связями друг с другом.

Сверх того, соединение относится к фармацевтической композиции, содержащей данный продукт слияния, причем данную фармацевтическую композицию можно применять для профилактики срастания и образования рубцов, а также для прекращения кровотечений или в качестве синовиальной жидкости. Сверх того, данные фармацевтические композиции предусмотрены для лечения и профилактики в области заживления ран.

Сверх того, данное изобретение относится к применению продукта слияния в качестве покрытий для ран, имплантатов, а также в качестве добавок для гелей для волос, моющих средств и средств для ухода, фиксаторов для волос, оттеночных средств и средств для ухода, имплантационных материалов, костного цемента, в качестве матрицы для эпителизации и заселения гомологичными клетками, шовных материалов, протезов сосудов, катетеров сосудов, эндопротезов сосудов и центрально-венозных катетеров. Далее, данное изобретение относится к способу получения продукта слияния.

В медицинской области полимерные материалы получили применение в разнообразных областях. Полимерные материалы, например, применяют в качестве имплантатов, шовных материалов, протезов сосудов, катетеров сосудов или также в качестве изолирующих материалов для электрических проводов. При этом применяемые полимерные материалы часто состоят в постоянном контакте с тканями человеческого тела. Конечно, уже вскоре после имплантации начинается комплексный конфликт физиологических защитных систем организма носителя имплантата с инородным телом. Конфликт может вести к отторжению имплантированного инородного материала, а при неблагоприятном развитии - к тяжелым воспалительным реакциям. Кроме того, имплантаты могут инфицироваться бактериями, что может привести из-за распространения бактерий в крови к угрожающему жизни заражению крови. Указанные осложнения делают необходимым оставлять некоторые имплантаты в теле так ненадолго, как только возможно. Данные проблемы приводят к применению полимерных материалов, которые имеют только небольшие поверхности контакта для иммунологического конфликта. Другую трудность представляет активизация свертывания крови теми имплантатами, у которых есть контакт с циркулирующей кровью, такими как протезы сосудов, эндопротезы сосудов или центрально-венозные катетеры. Из-за контактной активизации возникающие в имплантатах сгустки могут закупоривать катетеры и эндопротезы сосудов и делать из-за этого их непригодными. Также сгустки крови часто могут быть причиной дальнейшего бактериального заражения. С данными осложнениями стараются бороться с помощью покрытия соприкасающейся с кровью поверхности имплантата препятствующими свертыванию веществами, как, например, гепарин. Некоторые имплантаты, как, например, эндопротезы сосудов, предотвращают данное образование сгустков крови с помощью препятствования свертыванию крови посредством дополнительного применения препятствующих свертыванию медикаментов, таких как фенпрокоумон, клопидогрел, ацетилсалициловая кислота или гепарин. Такая системная антикоагуляция равным образом связана со значительным риском кровотечения. В большинстве центральных артериальных и центральных венозных катетеров применяют пластичные полимерные соединения, такие как поливинилхлорид, или полиуретановые соединения. В данных катетерах, предназначенных для длительного контакта с циркулирующей кровью, с помощью покрытия, содержащего препятствующие свертыванию вещества, и/или с помощью соответствующей шлифовки поверхности противодействуют прилипанию свернувшихся тел. В случае покрытия данных полимерных материалов гепарином предусмотрены различные способы присоединения сильно отрицательно заряженных молекул гепарина с образованием химических ковалентных связей. При всех покрытиях с гепарином предпочтительны такие способы, при которых препятствующие свертыванию части молекул гепарина остаются свободными. Однако идеальное соединение концевых альдегидных групп молекул гепарина из-за отсутствия подходящих функциональных групп в материале катетера возможно только с повышенными издержками. Полимерные материалы являются по существу биологически практически инертными. Имплантаты из данных полимерных материалов распознаются как инородное тело и отторгаются быстрее, чем покрываются в теле эпителием и становятся анатомически удобными, как, например, в случае имплантатов биологического происхождения.

В US 2005/828800 описаны соединения, полученные восстановительным аминированием гидроксиалкилцеллюлозы. Представленные в указанной работе соединения представляют собой твердые вещества, состоящие из соединенных бета-гликозидными связями элементов ангидридной глюкозы. Данные соединения являются для соответствующих изобретению целей совершенно непригодными по причине их физико-химических свойств. Специальное введение дополнительных заместителей через внедрение аминогрупп не описано. Кроме того, полученные восстановительным аминированием гидроксиалкилцеллюлозы с бета-гликозидными связями имеют большое сходство с хитозаном. Аминированные целлюлозы по сравнению с хитозаном являются разветвленными, и аминогруппы мономерного глюкозамина не ацетилированы, как, например, в случае хитозана, до 40%. Однако оба соединения представляют собой водонерастворимые поли-бета-1,4-глюкозамины. Высшие млекопитающие не могут расщеплять свойственными телу ферментами ни связанные бета-гликозидными связями хитозаны, ни аминированные гидроксиалкилцеллюлозы. Следует исходить из того, что аминированные гидроксиалкилцеллюлозы имеют значительно более высокий аллергический потенциал, чем соединения хитозана. Другие эластичные пластичные полимеры, такие как полиметилметакрилаты, применяют в хирургии, например, в качестве костного цемента с вышеописанным риском аллергической реакции вплоть до аллергического шока.

Поэтому существует потребность предоставить в распоряжение пригодные соединения, которые решают проблемы, соответствующие уровню техники. В частности, задача данного изобретения состоит в том, чтобы предоставить биологически расщепляемые соединения, которые можно применять как полимерные основы или добавки предпочтительно для медицинских изделий и которые, кроме того, можно легко объединять с лекарственными активными веществами и/или флуоресцентными маркерами.

Неожиданно в данной работе было обнаружено, что имеющиеся в уровне техники проблемы можно решить с помощью продукта слияния, который включает по меньшей мере два полисахарида, у которых элементы моносахаридов соединены друг с другом альфа-1,4-гликозидной связью и которые имеют по меньшей мере одну аминогруппу.

Поэтому объектом данного изобретения является продукт слияния, который включает, по меньшей мере, полисахариды Т1 и T2, причем

a) моносахариды, из которых образованы полисахариды Т1 и T2, частично или полностью соединены друг с другом альфа-1,4-гликозидной связью, и

b) по меньшей мере один из полисахаридов Т1 и/или T2 имеет по меньшей мере одну аминогруппу, и

c) Т1 и T2 с помощью по меньшей мере одного связывающего элемента Z соединены друг с другом химической ковалентной связью, и

d) Т1 и/или T2 содержат m групп -(L-A), причем

- A представляет собой лекарственное действующее вещество и/или флуоресцентный маркер,

- L представляет собой второй связывающий элемент, с помощью которого Т1 и/или T2 соединены с A ковалентной связью, и

- m представляет собой целое число, которое равно 0 или по меньшей мере 1.

Продукт слияния по изобретению включает по меньшей мере два полисахарида Т1 и T2, которые образованы из моносахаридов, которые частично или полностью соединены друг с другом альфа-1,4-гликозидной связью. Сверх того, по меньшей мере один из полисахаридов, который имеется в продукте слияния, содержит по меньшей мере одну аминогруппу.

Аминированные полисахариды представляют собой идеальные исходные соединения для дальнейших реакций соединения с, например, лекарственными действующими веществами или также для соединения полисахаридов Т1 и T2.

Предпочтительно полисахариды Т1 и/или T2 образованы из гексоз, в частности альдогексоз, которые могут быть необязательно замещены. Таким образом, элементы моносахаридов, из которых состоят Т1 и T2, могут быть частично или полностью замещены, и один или несколько радикалов предпочтительно выбирают из группы, состоящей из радикалов карбоновых кислот, сложных эфиров карбоновых кислот, замещенных или незамещенных алкильных радикалов с от 1 до 4 атомов углерода, амидов карбоновых кислот, сульфоновых кислот, амидов сульфоновых кислот и гидросульфатов, а также их смесей. Особенно предпочтительно элементы моносахаридов имеют, по меньшей мере частично, радикалы, выбранные из группы, состоящей из карбоксиметила, карбоксиэтила, гидроксиэтила, гидроксиметила, карбоновой кислоты, амида, сульфонамидов, солей карбоновой кислоты, солей сульфоновой кислоты, серной кислоты, сульфатов, гидросульфатов и амида серной кислоты, а также их смесей.

Пригодные полисахариды Т1 и T2, которые применяют для получения продуктов слияния по изобретению, предпочтительно независимо друг от друга выбирают из группы необязательно аминированных полисахаридов, которая состоит из следующих веществ: амилоза, амилопектин, ацеманан, арабиногалактаны, галактоманнаны, альгиновая кислота, производные альгиновой кислоты, соли альгиновой кислоты, галактоглюкоманнаны, ксантаны, карраген, гуаровая камедь, гуммиарабик, арабиногалактаны, крахмалы и модифицированные крахмалы. С точки зрения стоимости, а также на основе биологической совместимости полисахариды Т1 и T2 независимо друг от друга, в частности, выбирают из необязательно аминированных полисахаридов из группы, состоящей из гидроксиалкилкрахмалов, этерифицированных крахмалов, карбоксиалкилкрахмалов, гидроксиалкилкарбоксиалкилкрахмалов, гидроксиэтилкрахмала, карбоксиметилкрахмала и гидроксиэтилкарбоксиметилкрахмала.

В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения продукт слияния по изобретению содержит полисахариды Т1 и T2, которые независимо друг от друга выбирают из группы, состоящей из аминированного гидроксиэтилкрахмала, аминированного карбоксиметилкрахмала, аминированного карбоксиметилкрахмала, аминированного гидроксиэтилкарбоксиметилкрахмала и аминированного гидроксиалкилкрахмала.

В следующем предпочтительном варианте осуществления полисахариды Т1 и T2 продукта слияния по изобретению отличаются друг от друга.

В следующем предпочтительном варианте осуществления необязательно аминированные полисахариды Т1 и/или T2 растворимы в воде при 20°С, предпочтительно Т1 и/или T2 имеют растворимость в воде при 20°С по меньшей мере 1 г/л, предпочтительно 10 г/л, в частности 50 г/л.

Полисахариды Т1 и/или T2 имеют по меньшей мере одну аминогруппу. В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере одну аминогруппу имеют как полисахарид Т1, так и полисахарид T2.

В качестве аминогрупп полисахариды Т1 и/или T2 могут иметь как первичные, вторичные, так и третичные аминогруппы. Однако предпочтительно полисахариды Т1 и/или T2 имеют по меньшей мере одну -NH₂ группу.

Специалистам известны способы введения аминогруппы в полисахариды. В предпочтительном варианте осуществления аминогруппы вводят восстановительным аминированием полисахаридов Т1 и/или T2. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления полисахариды Т1 и/или T2 имеют аминогруппы, которые введены с помощью восстановительного аминирования полисахаридов Т1 и/или T2. Данные полисахариды Т1 и/или T2 отличаются тем, что альдегидные группы полисахаридов Т1 или T2 преобразуются в аминогруппы, предпочтительно -NH₂ группы.

Полисахариды Т1 и T2, из которых образован продукт слияния, имеют моносахариды, которые частично или полностью альфа-1,4-гликозидными связями соединены друг с другом. Альфа-1,4-гликозидной связью соединенные моносахариды способствуют значительно лучшей биологической способности полисахаридов к расщеплению. В предпочтительном варианте осуществления моносахариды, из которых образованы полисахариды Т1 и T2, независимо друг от друга, по меньшей мере на 20%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, особенно предпочтительно по меньшей мере на 90% соединены альфа-1,4-гликозидной связью друг с другом по отношению к общему числу моносахаридов.

Молекулярная масса полисахаридов Т1 и T2 варьируется в зависимости от области применения. Предпочтительно средняя молекулярная масса полисахаридов Т1 и/или T2 находится в интервале от 20000 до 800000 дальтон, предпочтительно от 25000 до 500000 дальтон, в частности от 30000 до 200000 дальтон.

В качестве особенно предпочтительных полисахаридов Т1 и/или T2 отмечают модифицированные крахмалы, в частности гидроксиэтилкрахмал, со степенью замещения DS от 0,2 до 0,8, предпочтительно от 0,3 до 0,8, причем модифицированные крахмалы или, соответственно, гидроксиэтилкрахмал являются необязательно аминированными.

Степень замещения DS определяют как отношение общего числа замещенных мономерных элементов к общему числу мономерных элементов.

В качестве лекарственных веществ A принимают во внимание все лекарственные вещества, которые могут быть присоединены через связывающий элемент L к вышеописанным полисахаридам Т1 и/или T2.

Продукты слияния по изобретению могут быть необязательно соединены с лекарственными средствами или флуоресцентными маркерами. Предпочтительно лекарственное действующее вещество выбирают из группы, состоящей из антибиотиков, антимикробных действующих веществ, цитостатических средств, химиотерапевтических средств, антигенов, олигонуклеотидов, медиаторов, искусственных метаболических питательных сред и цитотоксических веществ.

В особенно предпочтительном варианте осуществления лекарственное действующее вещество A выбирают из группы глюкозамингликанов или производных глюкозамингликанов.

В частности, для медицинских продуктов применение лекарственных действующих веществ A проявило себя как выгодная модификация продуктов слияния.

В особенно предпочтительном варианте осуществления лекарственное действующее вещество A выбирают из группы, состоящей из гепарина и сульфата гепарина, а также гиалуроновой кислоты, в частности гепарина или сульфата гепарина, с менее чем 6 элементами сахарида.

Особенно предпочтительно лекарственное средство A, в частности гепарин или производные гепарина, посредством восстановительного аминирования может быть соединено с полисахаридами Т1 и/или T2, которые уже соединены друг с другом с помощью Z.

Полисахариды Т1 и/или T2 имеют предпочтительно m групп (L-A), причем m представляет собой целое число, которое по меньшей мере равно 1, предпочтительно от 1 до 1000, в частности от 1 до 100, предпочтительнее от 2 до 100 и, в частности, от 3 до 20.

Флуоресцентный маркер предпочтительно выбирают из группы, состоящей из флуоресцинизотиоцианата (FITC), фикоэритрина, родамида и 2-аминопиридина.

Наряду с чисто лекарственными действующими веществами можно применять также флуоресцентные маркеры, например флуоресцинизотиоцианат в соединении с полисахаридами Т1 и/или T2. Маркировка флуоресцентными маркерами может служить в медицинской области для того, чтобы делать данные продукты слияния особенно заметными в теле. С применением продуктов слияния по изобретению в косметической области можно получать, например, излучающие УФ-лучи света гели для волос, фиксаторы или тонирующие средства. Полисахариды Т1 и T2 соединены друг с другом по меньшей мере одним связывающим элементом Z с помощью химической ковалентной связи. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения связывающий элемент Z представляет собой функциональную группу, которую выбирают из групп сложных эфиров карбоновых кислот, амидов карбоновых кислот, уретанов, простых эфиров и аминов, или включает по меньшей одну подобную функциональную группу. В частности, предпочтительно, чтобы ковалентная химическая связь между Т1 и T2 через связывающий элемент Z являлась обратимой и следовательно без затруднений, например с помощью ферментов, снова расщепляемой.

Второй связывающий элемент L, с помощью которого Т1 и/или T2 ковалентной связью соединены с А, соответствует в своей функции и варианте осуществления первому связывающему элементу Z. Для связывающего элемента L особенно предпочтительно, чтобы он без затруднений, например под действием ферментов, мог снова расщепляться, вследствие чего происходило бы высвобождение лекарственных средств и/или флуоресцентных маркеров. Образование связывающего элемента Z или L может происходить с помощью описанного в уровне техники способа образования сложных эфиров карбоновых кислот, амидов карбоновых кислот, уретанов, простых эфиров и аминов.

Если как Т1, так и T2 имеют аминогруппы, соединение происходит предпочтительно с помощью алифатического диальдегида, например глутарового альдегида.

В следующем варианте осуществления данного изобретения соединение по изобретению может быть получено посредством реакции по меньшей мере одной свободной

гидроксильной группы (-OH)

исходного полисахарида Т1 с одной свободной

изоцианатной группой (-NCO),

карбоксильной группой (-COOH),

группой галогенида карбоновой кислоты (-CO-A, где A=Cl, Br или I),

алкиленкарбоксильной группой (-(CH₂)_q-COOH, где q=1-10),

сложноэфирной группой (-COOR, где R = органический радикал),

эпоксигруппой

или нуклеофильной концевой группой

исходного полисахарида T2 с образованием связывающего элемента Z, причем полисахарид Т1 и/или полисахарид T2 соединены с m радикалами -(L-A).

В следующем варианте осуществления данного изобретения соединение по изобретению может быть получено посредством реакции по меньшей мере одной свободной

аминогруппы (-NH₂) исходного полисахарида Т1 со свободной

изоцианатной группой (-NCO),

карбоксильной группой (-COOH),

группой галогенида карбоновой кислоты (-CO-A, где A=Cl, Br или I),

алкиленкарбоксильной группой (-(CH₂)_q-COOH, где q=1-10),

сложноэфирной группой (-COOR, где R = органический радикал),

эпоксигруппой

или нуклеофильной концевой группой

исходного полисахарида T2 с образованием связывающего элемента Z, причем полисахарид Т1 и/или полисахарид T2 соединены с m радикалами -(L-A).

Далее, в одном предпочтительном варианте осуществления соединение по изобретению может быть получено посредством реакции по меньшей мере одной свободной

изоцианатной группы (-NCO),

карбоксильной группы (-COOH),

группы галогенида карбоновой кислоты (-CO-A, где A=Cl, Br или I),

алкиленкарбоксильной группы (-(CH₂)_q-COOH, где q=1-10),

сложноэфирной группы (-COOR, где R = органический радикал),

эпоксигруппы

или нуклеофильной концевой группы

исходного полисахарида Т1 со свободной

аминогруппой (-NH₂)

исходного полисахарида T2 с образованием связывающего элемента Z, причем полисахарид Т1 и/или полисахарид T2 соединены с m радикалами -(L-A).

Особенно предпочтительные соединения по изобретению могут быть получены посредством реакции по меньшей мере одной свободной

гидроксильной группы (-OH) или

аминогруппы (-NH₂)

исходного полисахарида Т1 с одной свободной

изоцианатной группой (-NCO),

карбоксильной группой (-COOH),

группой галогенида карбоновой кислоты (-CO-A, где A=Cl, Br или I),

алкиленкарбоксильной группой (-(CH₂)_q-COOH, где q=1-10),

сложноэфирной группой (-COOR, где R = органический радикал),

эпоксигруппой

или нуклеофильной концевой группой

исходного полисахарида T2 с образованием связывающего элемента Z, причем полисахарид Т1 и/или полисахарид T2 соединены с m радикалами -(L-A).

В рамках данного изобретения нуклеофильные концевые группы предпочтительно выбирают из галогенидов и тозилатов.

Далее, соединения могут быть получены посредством реакции диамина общей формулы I:

причем R¹ выбирают из

соединенных одинарной связью

линейных или разветвленных, предельных или непредельных, алифатических или алициклических углеводородных радикалов, имеющих от 1 до 22 атомов углерода;

арильных, арил-C₁-C₄-алкильных и арил-C₂-C₆-алкенильных групп, имеющих от 5 до 12 атомов углерода в арильном радикале, которые необязательно могут быть замещены C₁-C₆-алкильными и/или C₂-C₆-алкоксильными группами; или

гетероарильных, гетероарил-C₁-C₄-алкильных и гетероарил-С₂-С₆-алкенильных групп, имеющих от 3 до 8 атомов углерода в гетероарильном радикале и один или два гетероатома, которые выбирают из N, O и S, и которые могут быть замещены C₁-C₆-алкильными и/или C₂-C₆-алкоксильными группами,

с одной свободной функциональной группой исходного полисахарида Т1 и по меньшей мере одной свободной функциональной группой исходного полисахарида T2, которые независимо друг от друга выбирают из

изоцианатной группы (-NCO),

карбоксильной группы (-COOH),

группы галогенида карбоновой кислоты (-CO-A, где A=Cl, Br или I),

алкиленкарбоксильной группы (-(CH₂)_q-COOH, где q=1-10),

сложноэфирной группы (-COOR, где R = органический радикал),

эпоксигруппы

или нуклеофильной концевой группы,

с образованием связывающего элемента Z, причем полисахарид Т1 и/или полисахарид T2 соединены с m радикалами -(L-A).

Пригодными диаминами, например, являются 1,2-диаминоэтан, 1,2- или 1,3-диаминопропан, 1,2-, 1,3- или 1,4-диаминобутан, 1,5-диаминопентан, 2,2-диметил-1,3-диаминопропан, гексаметилендиамин, 1,7-диаминогептан, 1,8-диаминооктан, триметил-1,6-диаминогексан, 1,9-диаминононан, 1,10-диаминодекан, 1,12-диаминододекан, 1,2-диаминоциклогексан, 1,4-диаминоциклогексан, 1,3-циклогексан-бис(метиламин), 1,2-фенилендиамин, 1,3-фенилендиамин, 1,4-фенилендиамин, 4,4'-этилендианилин, 4,4'-метилендианилин, 4,4'-диаминостильбен, 4,4'-тиодианилин, 4-аминофенилдисульфид, 2,6-диаминопиридин, 2,3-диаминопиридин, 3,4-диаминопиридин, 2,4-диаминопиримидин, 4,5-диаминопиримидин, 4,6-диаминопиримидин.

Сверх того, в следующем варианте осуществления данного изобретения соединения по изобретению могут быть получены посредством реакции диолов общей формулы II:

причем R² выбирают из

линейных или разветвленных, предельных или непредельных, алифатических или алициклических углеводородных радикалов, имеющих от 2 до 22 атомов углерода;

арильных, арил-C₁-C₄-алкильных и арил-C₂-C₆-алкенильных групп, имеющих от 5 до 12 атомов углерода в арильном радикале, которые необязательно могут быть замещены C₁-C₆-алкильными и/или C₂-C₆-алкоксильными группами; или

гетероарильных, гетероарил-C₁-C₄-алкильных и гетероарил-C₂-C₆-алкенильных групп, имеющих от 3 до 8 атомов углерода в гетероарильном радикале, и один или два гетероатома выбирают из N, O и S, которые могут быть замещены C₁-C₆-алкильными и/или C₂-C₆-алкоксильными группами;

с одной свободной функциональной группой исходного полисахарида Т1 и по меньшей мере одной свободной функциональной группой исходного полисахарида T2, которые независимо друг от друга выбирают из

изоцианатной группы (-NCO),

карбоксильной группы (-COOH),

группы галогенида карбоновой кислоты (-CO-A, где A=Cl, Br или I),

алкиленкарбоксильной группы (-(CH₂)_q-COOH, где q=1-10),

сложноэфирной группы (-COOR, где R = органический радикал),

эпоксигруппы

или нуклеофильной концевой группы,

с образованием связывающего элемента Z, причем коллоид P и/или средство транспортировки T соединены с m радикалами -(L-A).

Пригодными диолами являются, например, этиленгликоль, пропиленгликоль, бутиленгликоль и неопентилгликоль, пентандиол-1,5,3-метилпентандиол-1,5, бисфенол A, 1,2- или 1,4-циклогександиол, капролактондиол (продукт реакции капролактона и этиленгликоля), гидроксиалкилированные бисфенолы, триметилолпропан, триметилолэтан, пентаэритритол, гександиол-1,6, гептандиол-1,7, октандиол-1,8, бутандиол-1,4, 2-метилоктандиол-1,8, нонандиол-1,9, декандиол-1,10, циклогександиметилол, ди-, три- и тетраэтиленгликоль, ди-, три- и тетрапропиленгликоль, полиэтилен- и полипропиленгликоль со средней молекулярной массой от 150 до 15000.

В следующем варианте осуществления данного изобретения соединения по изобретению могут быть получены посредством реакции дикарбоновой кислоты общей формулы III:

причем R³ выбирают из

соединенных одинарной связью

линейных или разветвленных, предельных или непредельных, алифатических или алициклических углеводородных радикалов, имеющих от 1 до 22 атомов углерода;

арильных, арил-C₁-C₄-алкильных и арил-C₂-C₆-алкенильных групп, имеющих от 5 до 12 атомов углерода в арильном радикале, которые необязательно могут быть замещены C₁-C₆-алкильными и/или C₂-C₆-алкоксильными группами; или

гетероарильных, гетероарил-C₁-C₄-алкильных и гетероарил-C₂-C₆-алкенильных групп, имеющих от 3 до 8 атомов углерода в гетероарильном радикале и один или два гетероатома, которые выбирают из N, O и S, которые могут быть замещены C₁-C₆-алкильными и/или C₂-C₆-алкоксильными группами;

с одной свободной функциональной группой исходного полисахарида Т1 и по меньшей мере одной свободной функциональной группой исходного полисахарида T2, которую независимо друг от друга выбирают из

аминогруппы (-NH₂)

или гидроксильной группы (-OH),

с образованием связывающего элемента Z, причем полисахарид Т1 и/или полисахарид T2 соединены с m радикалами -(L-A).

Пригодными дикарбоновыми кислотами являются, например, щавелевая кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, глутаровая кислота, адипиновая кислота, пимелиновая кислота, азелаиновая кислота, себациновая кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, сорбиновая кислота, фталевая кислота, терефталевая кислота, изофталевая кислота или агарициновая кислота.

В частности, соединения по изобретению также могут быть получены посредством реакции галогенида дикарбоновой кислоты общей формулы IV:

причем A=Cl, Br или I, и R¹ выбирают из

связанных простой связью

линейных или разветвленных, предельных или непредельных, алифатических или алициклических углеводородных радикалов, имеющих от 1 до 22 атомов углерода;

арильных, арил-C₁-C₄-алкильных и арил-C₂-C₆-алкенильных групп, имеющих от 5 до 12 атомов углерода в арильном радикале, которые необязательно могут быть замещены C₁-C₆-алкильными и/или C₂-C₆-алкоксильными группами; или

гетероарильных, гетероарил-C₁-C₄-алкильных и гетероарил-C₂-C₆-алкенильных групп, имеющих от 3 до 8 атомов углерода в гетероарильном радикале и с одним или двумя гетероатомами, которые выбирают из N, O и S, которые могут быть замещены C₁-C₆-алкильными и/или C₂-C₆-алкоксильными группами;

с одной свободной функциональной группой исходного полисахарида Т1 и по меньшей мере одной свободной функциональной группой исходного полисахарида T2, которые независимо друг от друга выбирают из

аминогруппы (-NH₂)

или гидроксильной группы (-OH),

с образованием связывающего элемента Z, причем полисахарид Т1 и/или полисахарид T2 соединены с m радикалами -(L-A).

Сверх того, в одном следующем предпочтительном варианте осуществления соединения по изобретению могут быть получены посредством реакции сложного диэфира общей формулы V:

причем R' представляет собой С_1-10-алкильную группу, и R⁵ выбирают из

связанных простой связью

линейных или разветвленных, предельных или непредельных, алифатических или алициклических углеводородных радикалов, имеющих от 1 до 22 атомов углерода;

арильных, арил-С₁-С₄-алкильных и арил-С₂-С₆-алкенильных групп, имеющих от 5 до 12 атомов углерода в арильном радикале, которые необязательно могут быть замещены C₁-C₆-алкильными и/или C₂-C₆-алкоксильными группами; или

гетероарильных, гетероарил-C₁-C₄-алкильных и гетероарил-C₂-C₆-алкенильных групп, имеющих от 3 до 8 атомов углерода в гетероарильном радикале и один или два гетероатома, которые выбирают из N, O и S, которые могут быть замещены C₁-C₆-алкильными и/или C₂-C₆-алкоксильными группами,

с одной свободной функциональной группой исходного полисахарида Т1 и по меньшей мере одной свободной функциональной группой исходного полисахарида T2, которые независимо друг от друга выбирают из

аминогруппы (-NH₂)

или гидроксильной группы (-OH),

с образованием связывающего элемента Z, причем полисахарид Т1 и/или полисахарид T2 соединены с m радикалами -(L-A).

Далее, предпочтительно соединения по изобретению могут быть получены посредством реакции диизоцианата общей формулы VI:

причем R⁶ выбирают из

линейных или разветвленных, предельных или непредельных, алифатических или алициклических углеводородных радикалов, имеющих от 1 до 22 атомов углерода;

арильных, арил-С₁-С₄-алкильных и арил-С₂-С₆-алкенильных групп, имеющих от 5 до 12 атомов углерода в арильном радикале, которые необязательно могут быть замещены C₁-C₆-алкильными и/или C₂-C₆-алкоксильными группами; или

гетероарильных, гетероарил-C₁-C₄-алкильных и гетероарил-C₂-C₆-алкенильных групп, имеющих от 3 до 8 атомов углерода в гетероарильном радикале и один или два гетероатома, которые выбирают из N, O и S, которые могут быть замещены С₁-C₆-алкильными и/или C₂-C₆-алкоксильными группами;

с одной свободной функциональной группой исходного полисахарида Т1 и по меньшей мере одной свободной функциональной группой исходного полисахарида T2, которые независимо друг от друга выбирают из

аминогруппы (-NH₂)

или гидроксильной группы (-OH),

с образованием связывающего элемента Z, причем полисахарид Т1 и/или полисахарид T2 соединены с m радикалами -(L-A).

Пригодными диизоцианатами являются, например, толуилендиизоцианат, битолуилендиизоцианат, дианизидиндиизоцианат, тетраметилендиизоцианат, гексаметилендиизоцианат, м-фенилендиизоцианат, м-ксилилендиизоцианат, C₁-C₆ алкилбензолдиизоцианат, 1-хлорбензол-2,4-диизоцианат, циклогексилметандиизоцианат, 3,3'-диметоксидифенилметан-4,4'-диизоцианат, 1-нитробензол-2,4-диизоцианат, 1-алкоксибензол-2,4-диизоцианат, этилендиизоцианат, пропилендиизоцианат, циклогексилен-1,2-диизоцианат, 3,3'-дихлор-4,4'-бифенилендиизоцианат, дифенилендиизоцианат, 2-хлортриметилендиизоцианат, бутилен-1,2-диизоцианат, этилидендиизоцианат, дифенилметан-4,4'-диизоцианат, дифенилэтандиизоцианат, 1,5-нафталиндиизоцианат, циклогександиизоцианат и изофорондиизоцианат.

В частности, предпочтительно соединения по изобретению могут быть получены посредством реакции диэпоксида с одной свободной функциональной группой исходного полисахарида Т1 и по меньшей мере одной свободной функциональной группой исходного полисахарида T2, которые независимо друг от друга выбирают из

аминогруппы (-NH₂)

или гидроксильной группы (-OH),

с образованием связывающего элемента Z, причем полисахарид Т1 и/или полисахарид T2 соединены с m радикалами -(L-A).

В качестве пригодного диэпоксида подходят, в частности, 1,2,3,4-диэпоксибутан или 1,2,7,8-диэпоксиоктан, предпочтительно алифатические диэпоксиды, имеющие от 4 до 16 атомов углерода.

Как особенно предпочтительные продукты слияния, отмечают соединения Т1 и T2, полученные посредством восстановительного аминирования. Особенно предпочтительными являются продукты слияния по изобретению, которые могут быть получены посредством восстановительного аминирования свободной аминогруппы (-NH₂) имеющегося полисахарида Т1 с полисахаридом T2, который имеет по меньшей мере одну альдегидную или кетоновую группу, и при этом полисахариды Т1 и/или T2 соединены с m радикалами -(L-A).

Имеющие аминогруппы Т1 при этом предпочтительно выбирают из группы, состоящей из аминированных крахмалов, аминированных гидроксиалкилкрахмалов, аминированных гидроксиалкилкарбоксиалкилкрахмалов и аминированных карбоксиалкилкрахмалов. В частности, предпочтительны аминированные гидроксиалкилкрахмалы, которые, например, сами были получены восстановительным аминированием.

В предпочтительном варианте осуществления продукты слияния по изобретению могут быть получены посредством восстановительного аминирования свободной аминогруппы (-NH₂) полисахарида Т1 с полисахаридом T2, который имеет по меньшей мере одну альдегидную или кетоновую группу, и при этом полисахарид Т1 и/или полисахарид T2 соединены с m радикалами -(L-A).

В частности, предпочтительно имеющий аминогруппы полисахарид Т1 выбирают из группы, состоящей из аминированных крахмалов, аминированных гидроксиэтилкрахмалов, аминированных гидроксиалкилкрахмалов, аминированных гидроксиалкилкарбоксиалкилкрахмалов и аминированных карбоксиалкилкрахмалов. Лекарственное действующее вещество A представляет собой предпочтительно гепарин или производное гепарина.

В особенно предпочтительном варианте осуществления продукты слияния по изобретению получают таким образом, чтобы лекарственное действующее вещество представляло собой гепарин, m было равно по меньшей мере 1, и полисахарид Т1 и/или T2 представлял собой гидроксиэтилкрахмал, и связывающий элемент L представлял собой -NH- группу.

В предпочтительном варианте осуществления связывающий элемент L представляет собой функциональную группу, которую выбирают из групп сложного эфира карбоновой кислоты, амида карбоновой кислоты, уретана, простого эфира и амина, или включает одну из указанных групп.

В зависимости от области применения соединения полисахаридов Т1 и T2 также могут через связывающий элемент Z соединяться в большие блоки. Согласно способу по изобретению на соотношение данной реакции соединения можно влиять подходящим изменением используемого способа. Это может происходить, например, проще всего с помощью изменения соотношения применяемых полисахаридов Т1 и T2, а также применяемых подложек для соединения, а также с помощью изменения молекулярного веса применяемых полисахаридов Т1 и T2. Кроме того, условия проведения реакции, такие как воздействие температуры и катализаторы, также влияют на соотношение обеих реакций. Однако данное явление хорошо известно специалистам. В предпочтительном варианте осуществления продукт слияния, наряду с полисахаридами Т1 и T2, включает еще и дополнительные полисахариды. Однако в особенно предпочтительном варианте осуществления продукт слияния включает исключительно полисахариды Т1 и T2, которые при необходимости соединены с m группами (L-A).

Продукт слияния по изобретению может находиться в жидком состоянии, в виде гидрогеля, пленки или твердого вещества. В предпочтительном варианте осуществления продукт слияния по изобретению находится в виде полимерного твердого вещества и предпочтительно имеет среднюю молекулярную массу по меньшей мере 50000 дальтон, предпочтительно по меньшей мере 100000 дальтон, в частности от 120 до 2000000 дальтон.

Продукт слияния по изобретению может быть получен посредством соединения по меньшей мере полисахаридов Т1 и T2, причем моносахариды, из которых образованы полисахариды Т1 и T2, частично или полностью соединены друг с другом альфа-1,4-гликозидными связями, и по меньшей мере один из полисахаридов Т1 и/или T2 имеет по меньшей мере одну аминогруппу, по меньшей мере один связывающий элемент Z, которым Т1 и T2 химической ковалентной связью соединены друг с другом, и при этом Т1 и/или T2 содержат m групп (L-A).

Следующим объектом данного изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая продукт слияния по изобретению.

Фармацевтическую композицию, при этом, можно применять для профилактики срастания и образования рубцов. Неожиданно оказалось, что нанесение продуктов слияния по изобретению в виде гидрогеля может предотвращать образование рубцов и, в частности, способствует срастанию. Это, в частности, имеет большое значение при послеоперационном уходе за пациентами.

Кроме того, фармацевтическую композицию по изобретению можно применять для прекращения кровотечений, или данную фармацевтическую композицию можно применять в качестве синовиальной жидкости.

Кроме того, неожиданно оказалось, что продукты слияния по изобретению можно применять в лечении и профилактике при заживлении ран. Таким образом, предпочтительно, чтобы продукты слияния по изобретению применялись для покрытий для ран. Данное изделие может быть выполнено как гидрогель, твердое вещество или жидкость в покрытии для ран. Кроме того, продукты слияния по изобретению применяют как имплантаты. В частности, оснащение продуктов слияния гепарином, или производными гепарина, или также гиалуроновой кислотой показало, что данные продукты слияния, в частности в медицинских изделиях, которые находятся в контакте с тканями или биологическими жидкостями, демонстрируют выдающиеся качества. Продукты по изобретению можно также применять только как добавку к имплантатам или медицинским изделиям.

Следующим объектом данного изобретения является, кроме того, применение продуктов слияния по изобретению в качестве добавки или в производстве гелей для волос, моющих и ухаживающих средств, фиксаторов для волос, тонирующих и ухаживающих средств, материалов для имплантаций, костного цемента, матрицы для эпителизации и заселения гомологичными клетками, шовных материалов, протезов сосудов, катетеров сосудов, эндопротезов сосудов и центральных венозных катетеров.

Следующим объектом данного изобретения является способ получения продуктов слияния по изобретению.

Способ получения продуктов слияния осуществляют соединением по меньшей мере одного полисахарида Т1 с по меньшей мере одном полисахаридом T2 с образованием связывающего элемента Z, которым Т1 и T2 соединены с помощью ковалентной связи, и при этом Т1 и/или T2 содержат m групп (L-A), причем

- A представляет собой лекарственное действующее вещество и/или флуоресцентный маркер,

- L представляет собой второй связывающий элемент, которым Т1 и/или T2 соединены с помощью ковалентной связи с А, и m представляет собой целое число, которое равно 0 или по меньшей мере 1.

Для Т1, T2, A, Z, L и m имеют силу варианты, представленные в вышеописанных предпочтительных вариантах осуществления.

В предпочтительном варианте осуществления способа по изобретению полисахариды Т1 и/или T2 представляют собой аминированные гидроксиэтилкрахмалы и/или аминированные карбоксиметилкрахмалы.

В следующем предпочтительном варианте осуществления способа по изобретению к полисахаридам Т1 и/или T2 сначала присоединяют лекарственное действующее вещество A, и затем происходит образование связывающего элемента Z.

В особенно предпочтительном варианте осуществления способа по изобретению способ имеет следующие стадии:

a) восстановительное аминирование гидроксиэтилкрахмала,

b) соединение полученного на стадии a) аминированного гидроксиэтилкрахмала с гепарином посредством восстановительного аминирования,

c) соединение полученного на стадии b) продукта с гидроксиэтилкрахмалом с образованием связывающего элемента Z.

Особенно предпочтительно, если происходит соединение полисахаридов Т1 и/или T2, как было описано выше, с помощью второго связывающего элемента L с лекарственным действующим веществом A. Для образования связывающего элемента L с лекарственным действующим веществом A, предпочтительно гепарином, применяют предпочтительно бифункциональные и трифункциональные молекулы, которые имеют одинаковые или различные функциональные группы, которые могут реагировать как с функциональными группами гепарина, так и с функциональными группами полисахаридов. Однако при этом может происходить нежелательное соединение молекул гепарина с молекулами полисахарида (сшивание). Данные продукты реакции конкурируют с желаемыми соединениями между гепарином и полисахаридом Т1 и/или T2. Поэтому особенно пригодными являются биполифункциональные молекулы с различными функциональными группами, которые, с одной стороны, реагируют только с функциональными группами гепарина, а с другой стороны, реагируют только с функциональными группами, которые имеются в полисахариде. Это предполагает, как правило, соответствующее химическое изменение со стороны полисахарида (Т1 и/или T2), реже гепарина. Глубина полимеризации продуктов слияния по изобретению может явно повышаться при иммобилизации гепарина на пригодных несущих телах.

Для имеющихся в карбоксиметилкрахмале карбоксильных групп в качестве связывающего элемента применяют соединения, которые выбирают из группы, которая содержит, например, диэпоксиалканы, которые предпочтительно имеют от 4 до 16 атомов углерода, в частности 1,2,3,4-диэпоксибутан, 1,2,7,8-диэпоксиоктан, или возможно глутаровый альдегид. Диэпоксиалкан образует при значениях pH в кислой области, предпочтительно в области от 2 до 4, сложноэфирную связь, в то время как в щелочной области pH (pH>10) образуются простые эфирные связи. Глутаровый альдегид реагирует предпочтительно при значении pH ниже 4 с образованием сложноэфирных связей. Для образования сложноэфирных связей в полимерные крахмалы можно вводить карбоксиалкильные группы. Особенно предпочтительными являются карбоксиметилгидроксиэтилкрахмалы со средним содержанием карбоксиметильных групп DS от 0,03 до 0,1 и средним содержанием гидроксиэтильных групп DS от 0,2 до 0,3 и молекулярной массой от 30000 до 300000. При очень маленьких молекулах гепарина происходит соединение с от 1 до 4 элементами полисахарида, которое свободно позволяет находиться линейным молекулам гепарина на расстоянии от полисахарида.

В особенном варианте осуществления способа по изобретению аминогруппы вводят в гидроксиалкилкрахмал или карбоксиалкилкрахмал восстановительным аминированием. С введенными аминогруппами полисахарида можно, например, концевые альдегидные группы глюкозаминглюкана, как, например, гепарина или гиалуроновой кислоты, использовать таким образом, что радикал молекулы гепарина остается свободным. С помощью восстановительного аминирования введенные аминогруппы также пригодны для образования ковалентной связи с радикалами, с карбоксильными группами, концевыми альдегидными группами, группами галогенидов карбоновых кислот, карбоксиалкиленов или сложных эфиров.

Восстановительное аминирование соединенных альфа-1,4-гликозидной связью полисахаридов Т1 и/или T2 происходит предпочтительно с аммиаком, алкиламином, диалкиламином или гидроксидом аммония в присутствии катализатора восстановления. Восстановление происходит предпочтительно в атмосфере водорода при повышенном давлении и температуре. В качестве катализатора применяют, например, скелетный никелевый катализатор, кобальт-никелевый катализатор и/или рутениевый катализатор. Применяемые при восстановительном аминировании с водородом температуры варьируются в области от 80 до 250°С, предпочтительно от 100 до 200°С, а давление от 2 до 50 бар, предпочтительно от 5 до 20 бар. Аминированный полиалкилкрахмал, например гидроксиалкилкрахмал, может, например, реагировать с альдегидными группами лекарственного вещества, например гепарина или производного гепарина, с образованием имина. На следующей стадии имин восстанавливается до амина. Аминогруппа аминированного полисахарида реагирует затем с альдегидной группой лекарственного действующего вещества с образованием оснований Шиффа. Основания Шиффа с помощью пригодного восстановителя, выбранного из группы солесодержащих гидридов, тетрагидроалюмината лития, борана лития, борана натрия или цианоборана натрия, восстанавливают до амина. При этом должно учитываться, что аминированные полисахариды, например гидроксиалкилкрахмал, также имеют концевые альдегидные группы. Применение аминированных полисахаридов делает возможным следующий способ из двух стадий. При этом предусмотренный для встраивания глюкозаминглюкан на первой отдельной стадии окисляют до лактона, который на следующей стадии соединяется с аминогруппой аминированного гидроксиалкилкрахмала с образованием амида карбоновой кислоты. Предпочтительно применять способ Хасимото (Hashimoto et al., Kunststoffe, Kautschuk, Fasern, Vol. 9 (1992), Seite 1271 bis 1279).

В особенно предпочтительном варианте осуществления аминогруппы полисахаридов Т1 и/или T2 применяют для образования ковалентной связи, в частности с гепарином.

Изобретение подробно разъясняется с помощью последующих примеров, однако не ограничивается ими.

Примеры

Пример 1

200 г гидроксиэтилкрахмала с молекулярной массой 50000 и молярным замещением 0,3 вместе с 27% раствором гидроксида аммония и с 400 г никель/медь/хром катализатора с содержанием никеля 75%, содержанием меди 23% и содержанием хрома 2% помещают в автоклав. С подачей водорода в течение 12 часов поднимают давление ступенями 100 бар, 150 бар, 170 бар. Перед каждым повышением давления образец извлекают, подвергают диализу и лиофилизируют.

Температуру повышают до 220°С. Затем смесь извлекают, подвергают диализу и лиофилизируют. 200 мг гепарина растворяют в 5 мл PBS (phosphate buffered soline; фосфатный солевой буферный раствор), pH 7,5, и пипетируют в реактор. 200 мг восстановительно-аминированного гидроксиэтилкрахмала растворяют в 10 мл дистиллированной воды и осторожно добавляют. После этого добавляют при перемешивании 0,025 мг цианоборана натрия (NaBCNH₃). Чашку Петри осторожно встряхивают. Через 2 часа опять добавляют 0,025 мг цианоборана натрия и осторожно в течение этого времени встряхивают до тех пор, пока никакие пузырьки больше не поднимаются. Добавление борана натрия повторяют 4 раза таким же образом. После этого реакцию оставляют на более чем 72 часа; наконец соединяют с избытком PBS, pH 7,5, подвергают диализу и лиофилизируют.

200 мг реагента растворяют в 200 мл дистиллированной воды. рН смеси регулируют до 10 добавлением 1 Н NaOH/раствор ацетона (30/70) и встряхивают. В сосуд 0,2 мл 1,2,7,8-диэпоксиоктана пипетируют и встряхивают. Добавление 0,2 мл 1,2,7,8-диэпоксиоктана повторяют все 10 часов. После 46 часов раствор отделяют от дистиллированной воды, подвергают диализу и лиофилизируют. Реагент соединяют с 10 мл PBS; pH 7,5.

Пример 2

200 г гидроксиэтилкрахмала с молекулярной массой 50000 и молярным замещением 0,4 растворяют в 27% растворе гидроксида аммония.

Раствор с 400 г никель/медь/хром катализатора помещают в автоклав. С подачей водорода в течение 12 часов поднимают давление ступенями 100 бар, 150 бар, 170 бар. Перед каждым повышением давления образец извлекают, подвергают диализу и лиофилизируют. Температуру повышают до 270°С. Затем смесь извлекают, подвергают диализу и лиофилизируют. Извлеченный образец с 200 мг гепарина растворяют в 5 мл PBS (pH 7,5). 200 мг восстановительно-аминированного гидроксиэтилкрахмала растворяют в 10 мл дистиллированной воды и осторожно добавляют. После этого добавляют при перемешивании 0,025 мг цианоборана натрия (NaBCNH₃). Чашку Петри осторожно встряхивают. После 2 часов опять добавляют 0,025 мг цианоборана натрия и осторожно в течение этого времени встряхивают до тех пор, пока не прекратят подниматься пузырьки. Добавление борана натрия повторяют 4 раза таким же образом. После этого реагенты оставляют на более чем 24 часа. В конце реагенты соединяют с избытком PBS (pH 7,5), подвергают диализу и лиофилизируют.

200 мг карбоксиметилкрахмала со средним молярным замещением DS 0,4 соединяют с 200 мл реагента. рН смеси устанавливают равным 10 добавлением 1 Н NaOH/раствор ацетона (30/70) и встряхивают. В сосуд пипетируют 0,4 мл 1,2,7,8-диэпоксиоктана и встряхивают. После 12 часов раствор отделяют от дистиллированной воды, подвергают диализу и лиофилизируют. Реагент соединяют с 10 мл PBS; pH 7,5.

Пример 3

Соединение аминированного гидроксиэтилкрахмала с флуоресцентно маркированным гепарином с помощью восстановительного аминирования и соединение продуктов реакции друг с другом с помощью следующего восстановительного аминирования с глутаровым альдегидом

а) Взаимодействие гепарина (Hep) с флуоресцентным маркером 2-аминопиридином

К раствору 2-аминопиридина (31,7 г, 0,33 моль, 1000 экв.) и NaCNBH₃ (2,1 г, 0,033 моль, 100 экв.) в формамиде (50 мл) добавляют гепарин (5,0 г). Полученную суспензию перемешивают при 37°C в течение ночи, при этом постепенно образуется прозрачный раствор. Реакционный раствор выливают в EtOH (50 мл). Выпавшее в осадок твердое вещество фильтруют и высушивают. Получают флуоресцентно маркированный гепарин (HEP*) в виде слегка бежевого твердого вещества (1,3 г).

b) Аминирование гидроксиэтилкрахмала (HES)

HES 40 - -> HES 40--NH₂

HES 40 (5,1 г/молекулярная масса 40 кДа) растворяют в водном растворе гидроксида аммония (100 мл, 22%). Катализатор, состоящий из никеля (5,6 г, 325 mesh (10 mesh=2000 мкм)), хрома (0,15 г, 100 mesh) и меди (1,8 г, 1 микрон), добавляют к раствору. Смесь в атмосфере водорода при 120°С в автоклаве перемешивают 48 часов. После охлаждения до 20°C отфильтровывают катализатор и выливают фильтрат в этанол (20 мл). Выпавший осадок отфильтровывают, промывают небольшим количеством этанола в воде и высушивают. Получают аминированный HES в виде слегка голубоватого твердого вещества (1,2 г).

c) Восстановительное аминирование полученного на стадии b) HES с полученным на стадии a) флуоресцентно маркированным гепарином (HEP*)

HEP* (200 мг) растворяют в водном фосфатном буферном растворе (5 мл, pH 7,5) и прибавляют по каплям раствор аминированного гидроксиэтилкрахмала из стадии b) (200 мг) в дистиллированной воде (10 мл). К реакционному раствору с интервалом в 2 часа шесть раз добавляют NaCNBH₃ (каждый раз 0,025 мг, из водного исходного раствора). Реакционную смесь повторно перемешивают 2 ч при 20°С. Для дальнейшей очистки исходный продукт 24 часа подвергают диализу. После выпаривания воды полученный по представленной схеме реакции продукт слияния аминированного HES и флуоресцентно маркированного гепарина представляет собой бесцветное твердое вещество. Соединение демонстрирует как в водном растворе, так и в виде твердого вещества интенсивную желто-зеленую флуоресценцию при облучении УФ-светом с длиной волны 366 нм.

d) Восстановительное аминирование полученных на стадиях a), b) и c) молекул флуоресцентно маркированного гепарина-гидроксиэтилкрахмала с глутаровым альдегидом

Полученные на стадиях a), b) и c) флуоресцентно маркированный гепарин-гидроксиэтилкрахмал (0,5 мг) рстворяют в фосфатном буферном растворе (0,25 мл, pH 7,5) и смешивают с глутаровым альдегидом (0,25 мл, 25 масс.%) при 20°С. К реакционному раствору с интервалом в 2 ч 3 раза добавляют NaCNBH₃ (каждый раз 0,01 мг) и при взбалтывании растворяют. Смесь оставляют стоять на ночь. Образуется бежевый осадок. Реакционный продукт осаждают этиловым спиртом и выпаривают. Твердое вещество показывает желто-зеленую флуоресценцию при облучении УФ-светом с длиной волны 366 нм.

Пример 4

Соединение аминированного гидроксиэтилкрахмала с флуоресцентно маркированным гепарином и гиалуроновой кислотой с помощью восстановительного аминирования и соединение продуктов реакции друг с другом с помощью следующего восстановительного аминирования с глутаровым альдегидом

Гиалуроновую кислоту (2 мг) растворяют в водном фосфатном буферном растворе (1,5 мл, pH 7,5) и смешивают с растворенными в воде реакционными продуктами из стадий a), b) и c) примера 3. К реакционному раствору с интервалом 2 ч 2 раза добавляют NaCNBH₃ (каждый раз 0,01 мг) и растворяют взбалтыванием. Смесь оставляют на ночь.

После этого при перемешивании добавляют глутаровый альдегид (0,25 мл, 25 масс.%) при 20°С. К реакционному раствору с интервалом 2 ч два раза добавляют NaCNBH₃ (каждый раз 0,01 мг) и растворяют взбалтыванием. Смесь оставляют на ночь, затем подвергают диализу и лиофилизируют.

Пример 5

Соединение аминированного HES с CMS

2 масс. части аминированного HES, полученного восстановительным аминированием, как в примере 3, с 1 масс. частью CMS (карбоксиметилкрахмала), MW 100 кг/дальтон растворяют в водном фосфатном буферном растворе (pH 7,5). К реакционному раствору при перемешивании с интервалом 2 часа 4 раза добавляют NaCNBH₃ (0,025 мг) до образования бежевого твердого вещества. Реакционный продукт упаривают.

Реагенты, применяемые в примерах:

Гепарин, натриевая соль (из свиньи, porcine origin), pH 7, средний MW=12-15 кДа, производитель: Changzou Qianhong Bio-Pharma Co., Ltd., Jiangsu, China.

HES 40: гидроксиэтилкрахмал со средней молекулярной массой MW=40 кДа, степенью замещения DS=0,3; производитель: BBraun, Crissier, Schweiz.

Цианоборан натрия, NaCNBH₃, Acros Organics, New Jersey, USA.

Глутаровый альдегид (25 масс.%), Acros Organics, New Jersey, USA.

Гепарин, натриевая соль (из свиньи, porcine origin), pH 7, средняя MW=12-15 кДа, производитель: Changzou Qianhong Bio-Pharma Co., Ltd., Jiangsu, China.

HES40: гидроксиэтилкрахмал со средней молекулярной массой MW=40 кДа, степенью замещения DS=0,3; производитель: BBraun, Crissier, Schweiz.

Цианоборан натрия, NaCNBH₃, Acros Organics, New Jersey, USA.

Глутаровый альдегид (25 масс.%), Acros Organics, New Jersey, USA.

Гиалуроновая кислота из Streptococcus equi, Alfa Aesar, Ward Hill, Massachusetts, USA.