СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ НЕОАНГИОГЕНЕЗА В ИШЕМИЗИРОВАННОЙ СКЕЛЕТНОЙ МЫШЦЕ

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной хирургии и экспериментальной фармакологии, и может быть использовано для коррекции ишемии.

Известен способ коррекции ишемии скелетной мышцы дистантным ишемическим прекондиционированием RU 2438192 C1. Недостатком его является то, что метод не лишен потенциальной опасности ишемических эпизодов для патологически измененных тканей и применим преимущественно на здоровом организме.

Наиболее близким к заявленному решению является «Способ фармакологической коррекции ишемии конечности, в том числе при l-name индуцированном дефиците оксида азота» (RU 2426174 C1). Коррекция ишемии проводится рекомбинантным эритропоэтином. Преимуществом данного способа является то, что активация процесса прекондиционирования осуществляется фармакологическим препаратом. То есть отсутствует эпизод ишемии, который может оказывать повреждающее действие на ткань. Однако недостатком данного метода является то, что в качестве инициатора процесса прекондиционирования выбран эритропоэтин. Многочисленные исследователи склонны именно его рассматривать гуморальным агентом прекондиционирования. Однако это гормональный белковый препарат и существует ряд противопоказаний для его применения, а именно артериальная гипертензия, онкологические заболевания. Кроме того, известны методы активации процесса прекондиционирования непосредственной стимуляцией основного эффекторного звена АТФ зависимых калиевых каналов. Несомненно актуальным является исследование лекарственных препаратов, способных активировать различные этапы процесса прекондиционирования.

Техническим результатом изобретения является разработка эффективного способа стимуляции неоангиогенеза в ишемизированной скелетной мышце, включающего применение фармакологического препарата, нетоксичного, с минимальным количеством противопоказаний.

Технический результат достигается тем, что лабораторному животному моделируют ишемию скелетной мышцы на вторые сутки эксперимента, стимуляцию неоангиогенеза осуществляют внутрижелудочным введением дигидрокверцетина в суточной дозе 5,5 мг/кг каждые 46 часов первые 7 суток эксперимента.

Основным преимуществом предлагаемого способа является отсутствие побочных эффектов (кроме индивидуальной непереносимости) фармакологического агента, так как он относится к классу флавоноидов. Известно, что при предварительном пероральном применении препарат в условиях тяжелой гипобарической гипоксии оказывал как антиоксидантный, так и антигипоксический эффект на организм. Подобные свойства препарата, вероятно, связаны с тем, что дигидрокверцетин, благодаря гидрофобному характеру строения, способен проникать в гидрофобную область мембран и тем самым значительно снижать подвижность липидов. Таким образом, данный препарат стабилизирует мембраны в условиях окислительного стресса и выступает в качестве структурного антиоксиданта. Кроме того, известно, что флавоноиды способны шунтировать работу НАДН-дегидрогеназы, принимая электроны с НАДН и передавая их на следующий - третий комплекс цепи митохондрий, нормализуя процессы окислительного фосфорилирования (Лукьянова Л. Д., 2011). Исходя из полученных результатов, можно предположить, что дигидрокверцетин способен активировать процесс прекондиционирования, одним из эффектов которого является неоангиогенез. Препарат вводится каждые 46 часов, учитывая то, что к этому времени эффект прекондиционирования ослабевает, первые 7 суток эксперимента, так как именно на данном этапе наиболее эффективна активация неоангиогенеза в ишемизированной мышце.

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ СЛЕДУЮЩИМ ОБРАЗОМ

Опыты проводят на белых крысах линии Wistar массой 220-250 г.

Ишемия моделируется на вторые сутки на мышцах правой голени крысы оперативным удалением участка магистральных сосудов, включающего бедренную, подколенную, переднюю и заднюю большеберцовые артерии.

При оценке состояния микроциркуляторного русла в ишемизированной мышце учитывается уровень микроциркуляции в ней и данные морфологического исследования.

Уровень микроциркуляции в мышцах голени определяется при помощи оборудования производства компании Biopac systems: полиграфа MP 100 с модулем лазерной доплеровской флоуметрии LDF100C и инвазивного игольчатого датчика TSD144. Регистрация и обработка результатов лазерной доплеровской флоуметрии (ЛДФ) производится с помощью программы AcqKnowledge версии 4.2., значения микроциркуляции выражают в перфузионных единицах (ПЕ). Запись уровня микроциркуляции осуществляют в пяти точках (середина длины мышцы, точки на 3-5 мм выше и ниже, латеральнее и медиальнее первой).

Регистрация уровня микроциркуляции проводится в группе интактных животных и в группах ложнооперированных животных, с моделированием ишемии мышц голени и в группе животных, которым вводился дигидрокверцетин на 21 и 28 сутки после операции.

Морфологическое исследование выполняется на материале стандартных участков мышцы, взятых после выведения животных из эксперимента. Обработка материала производится по стандартной методике с фиксацией в формалине, заливкой в парафин, окраской гематоксилином и эозином. Общеморфологическое и морфометрическое исследования выполняются с применением системы для сканирования и архивирования изображений MiraxDesk.

Дигидрокверцетин вводится внутрижелудочно в суточной дозе 5,5 мг/кг каждые 46 часов первые 7 суток эксперимента.

При статистической обработке данных рассчитывается среднее значение, величина стандартного отклонения. Различия считаются достоверными при р<0,05.

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ

Экспериментальные животные были разделены на следующие группы:

1) интактные животные (n=20);

2) ложнооперированные животные (n=20);

3) моделирование ишемии мышц голени (n=20);

4) моделирование ишемии мышц голени + дигидрокверцетин (n=20);

Моделирование ишемии мышц правой голени осуществляли на вторые сутки под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг веса внутрибрюшинно), оперативным удалением участка магистральных сосудов, включающего бедренную, подколенную, переднюю и заднюю большеберцовые артерии. Стимуляцию неоангиогенеза проводили у животных 4-й группы внутрижелудочным введением дигидрокверцетина в суточной дозе 5,5 мг/кг каждые 46 часов первые 7 суток эксперимента.

При оценке состояния микроциркуляторного русла в ишемизированной мышце учитывали уровень микроциркуляции в ней и данные морфологического исследования.

Уровень микроциркуляции в мышцах голени определяли при помощи оборудования производства компании Biopac systems: полиграфа MP 100 с модулем лазерной доплеровской флоуметрии LDF100C и инвазивного игольчатого датчика TSD144. Регистрацию и обработку результатов лазерной доплеровской флоуметрии (ЛДФ) производили с помощью программы AcqKnowledge версии 4.2., значения микроциркуляции выражали в перфузионных единицах (ПЕ). Запись кривой уровня микроциркуляции осуществляли в пяти точках (середина длины мышцы, точки на 3-5 мм выше и ниже, латеральнее и медиальнее первой) в течение 30 секунд в каждой точке. Из полученных пяти значений выводили среднее, которое вносили в протокол и принимали за уровень микроциркуляции в мышцах голени у данного животного. Из 10 полученных значений рассчитывали среднее, которое принимали за уровень микроциркуляции в данной группе животных на данном сроке исследования. Регистрацию уровня микроциркуляции проводили в группе интактных животных и в группах ложнооперированных животных, с моделированием ишемии мышц голени и в группе животных, которым вводился дигидрокверцетин на 21 (n=10) и 28 (n=10) сутки после операции.

Морфологическое исследование выполняли на материале стандартных участков мышц голени, взятых после выведения животных из эксперимента. Обработку материала производили по стандартной методике с фиксацией в формалине, заливкой в парафин, окраской гематоксилином и эозином. Общеморфологическое и морфометрическое исследования выполняли с применением системы для сканирования и архивирования изображений MiraxDesk.

Среднее значение уровня микроциркуляции в интактной мышце голени крыс составляет 526±34 ПЕ. При гистологическом исследовании миоциты образуют плотные пучки, в толще которых проходят полнокровные венулы и артериолы, содержащие единичные эритроциты. Просветы сосудов широкие, эндотелиальные клетки без патологических изменений.

Среднее значение уровня микроциркуляции в мышцах голени ложнооперированных крыс составляет на 21 сутки 527±10 ПЕ на 28 сутки - 532±34 ПЕ. Результаты лазерной доплеровской флоуметрии не имеют достоверных отличий от показателей, полученных в группе интактных животных (р=0,19; р=0,43 соответственно), при гистологическом исследовании отличий от строения интактных мышц также не выявлено.

После моделирования ишемии мышц голени уровень микроциркуляции в них резко снижается, восстановление его начинается лишь после 14 суток, однако до 90 суток остается достоверно ниже значения, зарегистрированного в группе интактных животных.

Учитывая результаты, полученные при анализе возможности компенсаторного восстановления регионарного кровообращения в применяемой нами модели, а также литературные данные, как наиболее информативные расценены 28-е сутки (361±9 ПЕ), 21-е (323±7 ПЕ) рассматривались как промежуточные.

На 21-е сутки ишемизированная мышца макроскопически выглядела набухшей, в ней имелись крупные участки серовато-коричневатого цвета. Данные участки гистологически представляли собой крупные очаги организующегося некроза с резорбцией некротических волокон и разрастанием грануляционной ткани. На 28-е сутки цвет мышцы нормализовался, но она выглядела несколько гипотрофичной. При гистологическом исследовании участки резорбируемого некроза были значительно мельче, а в микроциркуляторном русле отмечались полнокровие и новообразование единичных капилляров. Вблизи участков некроза встречались пучки атрофированных мышечных волокон.

Введение дигидрокверцетина способствовало достоверному повышению уровня регионарного кровотока в ишемизированной мышце голени крыс. Показатели ЛДФ в этих группах достоверно выше таковых в контрольной группе на соответствующем сроке - 21-е сутки - 453±8 ПЕ (р<0,05), 28-е сутки - 700±21 ПЕ (р<0,05).

То есть можно говорить о том, что компенсаторное восстановление регионарного кровообращения в ишемизированных мышцах животных опытных групп произошло до 28-х суток эксперимента. В контрольной серии восстановление исходного значения наблюдается значительно позже (в срок до 90 суток).

При макроскопической оценке мышцы ишемизированной голени крыс после введения дигидрокверцетина на 21-е и 28-е сутки ишемии не отличались по цвету и виду от интактных. При гистологическом исследовании некротические изменения в них не обнаруживались. Однако в некоторых участках встречались мелкие очаги атрофирующихся миоцитов с пролиферацией клеток перимизия.

При большом увеличении в ишемизированных мышцах голени отмечалось усиленное новообразование капилляров, более выраженное на 28-е сутки ишемии.

Таким образом, полученные результаты позволяют констатировать возможность стимуляции неоангиогенеза в ишемизированной скелетной мышце дигидрокверцетином.