СПОСОБ АНАЛИЗА МЕМБРАНОСВЯЗАННОГО ГЕМОГЛОБИНА В ЭРИТРОЦИТАХ С ПОМОЩЬЮ СПЕКТРОСКОПИИ ГИГАНТСКОГО КОМБИНАЦИОННОГО РАССЕИВАНИЯ НА НАНОСТРУКТУРИРОВАННЫХ ПОКРЫТИЯХ

Область техники

Изобретение относится к области медицинской диагностики и биоаналитических исследований, может быть применено для обнаружения биологических молекул и маркеров в биологических жидкостях (крови, слюне и др.), исследования строения биомолекул, для криминалистических целей.

Уровень техники

Спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния (ГКР-спектроскопия) с использованием наноструктурированных материалов на основе серебра находит применение в самых разных областях, связанных с обнаружением единичных клеток и биологических молекул при наномолярных концентрациях. Важным направлением биомедицинской диагностики с использованием ГКР-спектроскопии является исследование крови, а именно изменений структуры, конформации и, как следствие, кислород-связывающих свойств гемоглобина (Гб) в составе живых эритроцитов. Конформация и свойства Гб могут быть опосредованы патологиями сердечно-сосудистой системы или рядом наследственных заболеваний. Известно, что эритроциты содержат гемоглобин двух типов: цитоплазматический (Гб_цит) и мембранносвязанный Гб (Гб_мс). Традиционная спектроскопия КР при исследовании крови позволяет зарегистрировать спектры КР только от Гб_цит в эритроцитах, т.к. вклад Гб_мс незначителен ввиду того, что его концентрация очень мала - составляет меньше 0,5% от концентрации Гб_цит. В случае ГКР-спектроскопии усиление сигнала КР происходит от Гб_мс, расположенного в непосредственной близости к наноструктурам серебра, и, таким образом, по спектрам ГКР можно оценивать изменения конформации и О₂-связывающих свойств Гб_мс. Известно, что при многих сердечно-сосудистых заболеваниях (ССЗ) и сахарном диабете изменяется белковый состав и подмембранный цитоскелет эритроцитов и увеличивается количество белка полосы 3 (анионый обменник АЕ1), к которому прикрепляется мембраносвязанный Гб_мс (Santos-Silva, A., et al., Erythrocyte damage and leukocyte activation in ischemic stroke. Clin. Chim. Acta 2002. 320 (1-2), p.29-35 и Petropoulos, I.K., et al., Structural alterations of the erythrocyte membrane proteins in diabetic retinopathy. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol., 2007. 245(8), p. 1179-1188); при ССЗ и диабете изменяется активность ионного транспорта через плазматическую мембрану эритроцитов, а следовательно, в подмембранном пространстве эритроцитов наиболее существенно изменяются локальные концентрации ионов, в первую очередь, ионов Н⁺, Са²⁺, (Luneva, O.G., et al., Ion transport, membrane fluidity and haemoglobin conformation in erythrocytes from patients with cardiovascular diseases: Role of augmented cholesterol. Pathophysiology, 2007. 14(1): p. 41-46). Перечисленные факты дают возможность предположить, что уже на ранних этапах болезни существуют изменения в ионном составе цитоплазмы в примембранном пространстве эритроцитов, а также увеличивается число мест связывания Гб на плазматической мембране. Поскольку конформация Гб и его O₂-связывающие свойства напрямую зависят от концентрации ионов и связывания на мембране, то можно предположить, что по изменениям конформации Гб_мс можно судить о ранней стадии возникновения ССЗ. Таким образом, исследование функционального состояния и конформации Гб_мс имеет большое значение как для понимания процессов, протекающих в эритроцитах, так и может служить основой для проведения медицинской диагностики ССЗ.

Известен способ исследования Гб_мс в интактных эритроцитах методом ГКР-спектроскопии (Brazhe, N.A., et al., New Insight into Erythrocyte through In Vivo Surface-Enhanced Raman Spectroscopy. Biophysical Journal, 2009. 97(12): p. 3206-3214). В указанной работе наночастицы (НЧ) серебра, полученные по методу Леопольда и Лендла, были смешаны с эритроцитами в пропорции 1:1 до однородной смеси. Спектры ГКР снимали с использованием зеленого лазера длиной волны 532 нм. Оценочные коэффициенты усиления для различных полос поглощения порфиринового кольца гемоглобина составляют: в области 1172 см^-1-1,3·10⁵, 1375 см^-1-1,5·10⁴, 1580 см^-1-2,9·10⁴, 1640 см^-1-1,4·10⁴.

Аналогом настоящего изобретения является метод анализа β-каротина и гемоглобина в человеческой плазме крови с помощью спектроскопии гигантского комбинационного рассеивания (Casella, М., et al., Raman and SERS recognition of β-carotene and haemoglobin fingerprints in human whole blood. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2011. 79(5): p. 915-919).

Существенным недостатком данных методов исследования плазмы крови и Гб_мс в эритроцитах является использование коллоидного раствора наночастиц (НЧ), который может оказывать токсическое и осмотическое воздействие на клетки, маскировать ГКР-сигнал органическими молекулами или побочными продуктами, входящими в состав золей НЧ. Кроме того, возможно отсутствие эффективных прямых контактов НЧ с клетками или биомолекулами плазмы крови. Данные проблемы успешно решаются в заявляемом изобретении с использованием наноструктурированных покрытий в виде кольцевых наноструктур серебра, имеющих иерархическую структуру.

Описан метод исследования плазмы крови и эритроцитов с помощью ГКР-спектроскопии (Premasiri, W.R., J.С. Lee, and L.D. Ziegler, Surface-Enhanced Raman Scattering of Whole Human Blood, Blood Plasma, and Red Blood Cells: Cellular Processes and Bioanalytical Sensing. The Journal of Physical Chemistry В, 2012. 116(31): p. 9376-9386). В данной работе каплю крови, предварительно смешанную с наночастицами золота, наносили на подложку из SiO₂ и давали высохнуть в течение 1 ч. Спектры ГКР были сняты с использованием лазера длиной волны 785 нм. Отличительной особенностью указанного выше метода от заявляемого изобретения является то, что спектры ГКР снимаются не с живых эритроцитов, а с сушенной капли крови. В связи с этим такой способ невозможно использовать для медицинской диагностики живых биообъектов.

Единственная работа, в которой наноструктурированные подложки использовались для ГКР-анализа живых клеток, - это работа по обнаружению бактерий в крови (Liu, T.Y., et al., Functionilized arrays of Raman-enhancing nanoparticles for capture and culture-free analysis of bacteria in human blood. Nature Communications. 2011. 2:538. DOI: 10.1038/ncomms1546). В указанной работе предлагалось использовать подложки на основе анодного оксида алюминия, декорированного массивом наночастиц серебра и покрытого слоем ванкомицина. Недостаток таких подложек для мультифункционального использования биочипов определяется необходимостью замены слоя ванкомицина на другие гликопептиды для обнаружения других микроорганизмов. Кроме того, подобные подложки невозможно использовать для исследования небактериальных клеток.

Таким образом, известные из уровня техники аналоги настоящего изобретения не позволяют осуществлять неинвазивную диагностику живых клеток и эритроцитов методом спектроскопии гигантского комбинационного рассеивания в результате наличия стадии смешения клеток плазмы крови с коллоидными растворами наночастиц, имеющих менее эффективный контакт с клетками, более длительный период иммобилизации клеток.

Раскрытие изобретения

Задача и технический результат настоящего изобретения заключаются в создании способа анализа мембраносвязанного гемоглобина в эритроцитах с помощью спектроскопии гигантского комбинационного рассеивания на наноструктурированных покрытиях для диагностики живых клеток. Использование наноструктурированных подложек с контролируемой морфологией не вызывает гемолиз эритроцитов и позволяет осуществлять их диагностику методом ГКР в результате более эффективного контакта наночастиц (НЧ) с живыми клетками плазмы крови, исключая стадию смешения эритроцитов с коллоидными растворами НЧ и сокращая время иммобилизации клеток.

Поставленная задача решается тем, что заявленный способ анализа мембраносвязанного гемоглобина в эритроцитах с помощью спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) характеризуется тем, что для исследования используют наноструктурированные покрытия в виде кольцевых наноструктур серебра, имеющих иерархическую структуру, при этом ободки серебряных колец состоят из сообщающихся друг с другом пористых агрегатов серебра микронного размера, на поверхности которых расположены и внедрены в матрицу округлые наночастицы серебра размером 2-100 нм.

Также поставленная задача решается тем, что используемые в упомянутом выше способе анализа наноструктурированные покрытия с контролируемой морфологией не вызывают гемолиза эритроцитов и позволяют осуществлять их диагностику методом ГКР.

Частным вариантом настоящего изобретения является упомянутый выше способ, включающий подготовку клеток плазмы крови и их нанесение на наноструктурированные покрытия с последующей иммобилизацией и снятием ГКР-спектров.

Частным вариантом настоящего изобретения является упомянутый выше способ, согласно которому время иммобилизации клеток на наноструктурированных покрытиях составляет от 5 до 40 минут.

Другим частным вариантом настоящего изобретения является упомянутый выше способ, согласно которому ГКР-спектры получают с использованием зеленых лазеров с длиной волны 514 или 532 нм.

Изобретение иллюстрируется фигурами и примерами.

Описание чертежей

Фигура 1. (а) КР- и ГКР-спектры эритроцитов, теней эритроцитов и изолированного гемоглобина, полученные при различных условиях. Серым цветом обозначено среднее отклонение от экспериментальных результатов, черными линиями показаны усредненные спектры. (1) КР-спектр крови, разведенной в 3000 раз и (2) цельной крови, нанесенных на предметное стекло. (3) ГКР-спектр суспензии эритроцитов, полученных разведением крови в 3000 раз и поврежденных лазерным пучком с длиной волны 514 нм и с мощностью излучения, в 20 раз превышающей мощность, используемую в других ГКР-экспериментах. (4) ГКР-спектр суспензии эритроцитов, полученной разведением крови в 5000 раз, полученный при усреднении ГКР-спектров, зарегистрированных с различных участков подложки с использованием лазера 532 нм. (5) Серия ГКР-спектров суспензии эритроцитов, полученной разведением крови в 3000 раз, спектры ГКР регистрировали с использованием лазера 514 нм с одной и той же области на подложке с разницей в 2 мин между измерениями. (6, 7) ГКР-спектры суспензии эритроцитов, полученной разведением крови в 3000 раз, зарегистрированные с использованием лазера 514 нм и различных подложек с перекрывающимися кольцами серебра, визуально имеющими вид «серебряного зеркала», (б) ГКР-спектры изолированного гемоглобина и теней эритроцитов на наноструктурированных серебряных подложках (во всех случаях длина волны лазера - 514 нм). ГКР-спектры изолированного гемоглобина в концентрациях 1 мкМ (1) и 0.33 нМ (2), теней эритроцитов с низким содержанием Гб_мс спустя 15 мин после нанесения на подложки, необходимых для прикрепления теней к подложке (3). ГКР-спектры теней эритроцитов с Гб_мс, зарегистрированные с одной и той же области подложки и временной разницей между каждым спектром в 2 мин (4-8). (в) Схема порфиринового комплекса железа с характеристическими колебаниями связей, обозначенных цветом. (г) Схема, иллюстрирующая предполагаемые месторасположения эритроцитов на наноструктурированной серебряной подложке: 1 - на стенке, 2 - в месте соприкосновения со стенкой, 3 - в области с высокой плотностью кластеров серебра, 4 - на участке, не содержащем серебро.

Осуществление изобретения

Кровь получали из хвостовой вены самцов крыс линии Wistar. Разбавление крови в 3000 или 5000 раз осуществляли с использованием физиологического раствора Алена составом: рН=7.4, 145 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 4 мМ KCl, 4 мМ Na₂HPO₄, 1 мМ NaH₂PO₄, 1 мМ MgSO₄, 1 мМ CaCl₂.

Пример 1.

Для исследований методом растровой электронной микроскопии (РЭМ) и для осуществления ГКР-картирования эритроцитов образец цельной крови центрифугировали (3000 g, 10 мин) и удаляли супернатант. Каплю сконцентрированной после центрифугирования суспензии эритроцитов наносили на покрытия с кольцевыми наноструктурами из металлического серебра (Eugene A. Goodilin et al., Planar SERS nanostructures with stochastic silver ring morphology for biosensor chips, J. Mater. Chem., 2012, 22, 24479-2495%). ГКР-спектры образцов получали с использованием зеленых лазеров с длиной волны 514 или 532 нм.

Пример 2.

Изолированный гемоглобин выделяли с использованием фосфатного буфера (Na₂HPO₄:NaH₂PO₄·2H₂O=4:1) с низкой осмолярностью и рН=7.2. Гемолиз эритроцитов протекал с разрушением плазматической мембраны и выходом цитоплазматического гемоглобина в буферный раствор. Для очищения цитоплазматического гемоглобина от остатков плазматической эритроцитарную массу разбавляли в 5-15 раз буфером, центрифугировали в течение 10 мин (5000 g) и отбирали полученный супернатант, который применяли для регистрации спектров КР гемоглобина на покрытиях с кольцевыми наноструктурами из металлического серебра (способ получения в примере 1). ГКР-спектры образцов получали с использованием зеленых лазеров с длиной волны 514 или 532 нм. Концентрация гемоглобина в супернатанте, оцененная по спектрам поглощения, составляла 10^-4 М.

Пример 3.

Для получения «теней» эритроцитов (замкнутых везикул, состоящих из плазматической мембраны эритроцитов с Гб_мс) плазму крови отделяли от эритроцитов центрифугированием крови (440 g, 10 мин) в фосфатном буфере (рН=7.2) при 4°C. Количество эритроцитов подсчитывали в камере Горяева. Используя фосфатный буфер, доводили количество эритроцитов до 10⁷ клеток/мкл. Полученную суспензию эритроцитов разводили в 20 раз ледяным фосфатным буфером (рН=7.4) и центрифугировали при 4°C (4000 g, 40 мин). Супернатант, содержащий цитоплазматический гемоглобин, отделяли. Осадок, содержащий тени эритроцитов, суспендировали в свежеприготовленном ледяном фосфатном буфере (рН=7.4) и центрифугировали при 4°C (4000 об/мин, 40 мин). Процедуру повторяли 5 раз. Далее проводили концентрирование теней эритроцитов в буфере Алена (рН=7.4) путем центрифугирования образца (10000 g, 30 мин). Полученные тени эритроцитов имели розоватый цвет ввиду наличия мембраносвязанного гемоглобина, прикрепленного к АЕ1 обменнику мембраны. ГКР-анализ полученных «теней» эритроцитов проводили на покрытиях с кольцевыми наноструктурами из металлического серебра (способ получения в примере 1) с использованием зеленых лазеров с длиной волны 514 или 532 нм.

Пример 4.

Тени эритроцитов с низким содержанием мембраносвязанного гемоглобина получали по аналогичной методике, заменяя фосфатный буфер с рН=7.2 на буфер с рН=8.0. Щелочная среда способствовала отделению большего числа молекул мембраносвязанного гемоглобина от белка АЕ1. В отличие от предыдущих, тени без мембраносвязанного гемоглобина имеют белесый цвет. Для ГКР-экспериментов суспензию с тенями эритроцитов разбавляли в 1000 раз и наносили на покрытия с кольцевыми наноструктурами из металлического серебра (способ получения в примере 1). ГКР-спектры образцов получали с использованием зеленых лазеров с длиной волны 514 или 532 нм.

Как видно из Фиг. 1 при разбавлении крови обычный КР-сигнал исчезает: так, для образца крови, разбавленного в 3000 раз и помещенного на предметное стекло, КР-спектр отсутствует (Фиг. 1, а, спектры 1 и 2). Это свидетельствует о том, что спектр КР сильно разбавленных образцов не может быть зарегистрирован без ГКР-активной подложки. Показано, что лазерное излучение длиной волны 514 и 532 нм с оптимально подобранной мощностью (6 мВт на пятно диаметром 2 мм) позволяет сохранить эритроциты в живом состоянии. ГКР-исследования изолированного Гб и теней эритроцитов с Гб_мс, в присутствии наноструктурированных серебряных подложек показали, что наблюдаемые ГКР-спектры эритроцитов отвечают колебаниям связей гемопорфирина в Гб_мс (Фиг. 1, б). Так, ГКР-спектры живых эритроцитов (Фиг. 1, а, спектры 4-7) соответствуют усиленному сигналу КР Гб_мс. В ГКР-спектрах эритроцитов на наноструктурированных покрытиях с кольцевыми структурами (Фиг. 1, а, спектры 4 и 5) наблюдается наиболее интенсивный пик при 1370-1375 см^-1, а также два перекрывающихся пика в области 1560-1588 и 1620-1630 см^-1, возникающих вследствие усиления характеристических пиков КР гемопорфирина Гб, расположенных при 1550, 1564, 1588 см^-1 и 1622, 1640 см^-1, соответственно.

Таким образом, экспериментальные данные подтверждают, что заявленный способ позволяет анализировать мембраносвязанный гемоглобин в живых эритроцитах с помощью спектроскопии гигантского комбинационного рассеивания.