Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВНУТРЕННЕЙ ЭНЕРГИИ БИОСПЕЦИФИЧЕСКИ ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩЕЙ СУСПЕНЗИИ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ ОБЪЕМНОЙ

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и иммунологии и предназначено для определения количественных параметров энергии и работы, совершаемой за счет биоспецифически взаимодействующих активных центров антител и антигенов соответственно, находящихся в виде раствора и суспензии в электролитической среде. Реакция агглютинации объемная (РАО) представляет собой биологическую систему с определенной целостностью и единством, в которой основные информационные и энергетические процессы происходят на уровне атомных и ядерных взаимодействий аминокислотных остатков активных центров антител и антигенов, характеризующихся, комплексным взаимодействием разнородных сил.

Биологические системы - совокупность взаимосвязанных и взаимодействующих живых элементов различной сложности (гены, клетки, ткани, органы, организмы, биоценозы, экосистемы, биосфера. (Дедю И.И. Экологический энциклопедический словарь / И.И. Дедю; Предисл. В.Д. Федорова. - Кишинев: Гл. ред. Молд. сов. энцикл., 1990. - 406 с. - ISBN 5-88550-006-1). С позиций термодинамики биологических систем РАО может быть отнесена к замкнутой системе, которая может обмениваться с окружающей средой лишь энергией и не может обмениваться веществом (Доброборский Б.С. Термодинамика биологических систем. Учебное пособие для студентов высших медицинских учебных заведений. Под ред. проф. Е.С. Мандрыко. Санкт-Петербург. 2006 - 52 с.).

В понятие внутренней энергии включаются кинетическая энергия хаотического движения молекул, потенциальная энергия взаимодействия между молекулами и внутримолекулярная энергия. Изменение внутренней энергии при переходе системы из одного состояния в другое будет всегда равно разности значений внутренней энергии в этих состояниях, независимо от пути, по которому совершался переход. Величины, характеризующие состояние системы, называют параметрами состояний (Савельев И.В. Курс общей физики, Т.1. Механика. Молекулярная физика: Уч. пособ. 4-е изд., перераб. - М.: Наука. Гл. ред. физ.-мат. лит., 1989-352 с. http://scask.ru/book_s_phis1.php?id=85).

Взаимодействие между молекулами характеризуется информационными и энергетическими процессами, широко распространенными в биологии. На молекулярном уровне они протекают не только при запоминании и переработке генетической информации, но и при взаимном узнавании макромолекул, обеспечивают специфичность и направленный характер ферментативных реакций, имеют важное значение при взаимодействии клеточных мембран и поверхностей (Рубин А.Б. Термодинамика биологических процессов // Соросовский образовательный журнал. 1998. №10. С.77-83.). Кроме того, активным началом потенцированных лекарств является информация, передающаяся в виде электромагнитных волн, влияние которых нельзя исключить при проведении микробиологических и иммунологических экспериментов в нормальных условиях с сопутствующими им незначительными флуктуациями окружающей температуры и световых потоков (Комиссаренко А.А., Салычева Л.В. Значение и сложности потенцирования в гомеопатии // Журнал Натуропатия и гомеопатия, 2004, 1 (5), 53-58.). В то же время, следует отметить, что реакция взаимодействия антитела и антигена является экзотермической и представляется частным случаем белок-белковых взаимодействий (Терентьев А.А., Молдогазиева Н.Т., Шайтан К.В. Динамическая протеомика в моделировании живой клетки. Белок-белковые взаимодействия // Успехи биологической химии. - 2009, - Т.49. - С.429-480).

Известны различные способы определения внутренней энергии отдельных материальных тел и взаимодействующих объектов. Процесс изменения внутренней энергии тела без совершения работы над ним или совершения работы самим телом, называется теплопередачей. Теплопередача может осуществляться за счет теплопроводности, конвекции, излучения.

Известен способ определения внутренней энергии идеального газа, у которого силы взаимодействия молекул отсутствуют, что влечет и отсутствие молекулярно-потенциальной энергии. В связи с отмеченным, внутренняя энергия идеального газа представляет собой только сумму значений кинетической энергии хаотического движения всех его молекул, что выражает формула: U=ΣE_i.

Для молекул газов, состоящих из двух, трех и большего числа атомов, также известны соответствующие формулы, позволяющие определять внутреннюю энергию известной массы (m) газа (Жданов Л.С. Учебник по физике для средних специальных учебных заведений. - М.: Наука, 1978. - 592 с., стр.63, 64).

Основным недостатком вышепоказанного способа определения внутренней энергии идеального газа является невозможность его применения для регистрации изменений внутренней энергии твердых тел и жидкостей.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ измерения изменений параметров состояния системы (температуры, давления, объема и т.д.) по их разности в начале и в конце того или иного процесса (Жданов Л.С., 1978, стр.67).

Вышеприведенный способ оценки внутренней энергии тела или системы тел по ее разности в начале и в конце процесса является неконкретным, отражающим только основные направления ее изменения. В связи с чем для достижения поставленной авторами цели требуется конкретизация и расширение круга разрешаемых проблем с использованием дополнительных источников и справочных данных.

Целью изобретения явилось экспериментальное доказательство возможности количественного определения в физических единицах системы СИ Джоулях (Дж) и внесистемных калориях (кал) величины внутренней энергии и работы, соответственно, проявляющейся и совершаемой в результате биоспецифического взаимодействия активных центров антител и антигенов в суспензии РАО.

Для достижения поставленной цели регистрацию разницы изменений температур опытной и контрольной систем осуществляли за счет помещения последних в равнозначные условия со стабилизацией влияния внешних температурных воздействий путем выполнения эксперимента с использованием модели жидкостного ледяного изотермического калориметра в термоизолирующей оболочке и откалиброванных электронных термодатчиков для оценки и учета температуры.

Сущностью технического решения предлагаемого изобретения явилось создание параметров состояния биоспецифически реагирующей суспензии РАО, представляющей собой опытную систему, в сравнении с аналогичной контрольной системой, биоспецифическое взаимодействие в суспензии которой заведомо отсутствовало, для оценки и учета разности параметров состояния систем по температуре (теплообразованию).

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки:

- изменение внутренней энергии биоспецифически реагирующей суспензии РАО оценивается в сравнении с аналогичной системой, где таковое отсутствует;

- изменение внутренней энергии биоспецифически реагирующей суспензии РАО оценивается в условиях ограниченного интервала температур от 6,0 до 18°C, в связи с тем, что сложная по молекулярному механизму РАО не проявляет выраженного отличия температурного параметра состояния системы вследствие взаимодействия активных центров антител и антигенов при биоспецифическом взаимодействии, а регистрация температурных отличий вблизи оптимальной температуры для серологической реакции (37°C) или около 0°C осложняется, с одной стороны, диссипацией тепловой энергии, с другой, - ее ограниченным температурным уровнем;

- в изменении внутренней энергии биоспецифически реагирующей суспензии РАО, наряду с электрическим и магнитным полями привносят свою долю атомные и ядерные взаимодействия, активирующиеся при «узнавании» активных центров антител и антигенов;

- использование жидкостного ледяного изотермического калориметра с термоизолирующей оболочкой, позволившего уловить достоверный сдвиг (увеличение) температуры в опытной биоспецифически реагирующей РАО;

- одновременный контроль температурных параметров состояния систем и калориметра с помощью откалиброванных цифровых термодатчиков.

Измерение параметров флуктуации температуры опытной системы относительно аналогичной контрольной системы при равнозначных условиях времени наблюдения за системами, термоизоляции, температуры окружающей среды, постоянном давлении, влажности, отсутствии посторонних излучений, позволило получить достоверные отличительные параметры состояния систем по температуре.

Для достижения технического эффекта и получения сопоставимых результатов в качестве моделей для изучения энергии, работы и информационных параметров реакции Ат-Аг в РАО использовали растворы бруцеллезных или туляремийных антител и суспензии убитых клеточных антигенов обозначенных возбудителей. Количественное определение белка в исходных растворах антител проводили на спектрофотометре СФ-46 («ЛОМО», г. Санкт-Петербург) при длине волны 280 нм. В опытах растворы антител применяли в титрах 1:50, 1:200 и 1:400. Суспензии обеззараженных клеток туляремийного и бруцеллезного вакцинных штаммов соответствовали 10 ед. мутности по ОСО-42-28-85П и их готовили из культур штаммов коллекции ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора. Для достоверности наличия биоспецифических свойств исходных ингредиентов РАО ставили контрольные реакции агглютинации на стекле с бруцеллезными и туляремийными ингредиентами. Опыты по измерению изменения температуры и объема реагирующей суспензии РОА выполняли в объеме 5,0 мл с соотношением объемов концентраций микробных взвесей и титров сывороток рекомендациям инструкций техники постановки РАО с бруцеллезными и туляремийными ингредиентами.

Прямые измерения основного параметра состояния системы - экзогенной тепловой энергии биоспецифически реагирующей суспензии РАО проводили с использованием экспериментальной модели жидкостного ледяного изотермического калориметра с термоизолирующей оболочкой, который состоял из емкости с водой, с принудительной ее агитацией магнитной мешалкой и охлаждающими элементами (кубики льда объемом 1,0 см³), закрытыми термоизолирующей оболочкой из пенопласта и алюминиевой фольгой, камеры для размещения опытной (биоспецифически реагирующей суспензией) и контрольной емкостей (в виде тонкостенных стеклянных пробирок) для контроля ингредиентов с гетерологичными суспензиями клеток, растворами антител. Кубики льда в камере калориметра использовали для компенсации диссипации и стабилизации тепловой энергии, образование и регистрация которой в результате взаимодействия активных центров Ат и Аг, ограничены температурными пределами агглютинации. Для измерения и учета температуры в опытной и контрольной пробирках, а также контроля температуры в камере жидкостного калориметра-интегратора использовали три откалиброванные на воздухе и в жидкости цифровые электронные термопары. Перед началом измерений камеру калориметра, опытную и контрольную емкости, а также ингредиенты РАО охлаждали до одинаковой температуры в пределах 6-18°C. После стабилизации показаний электронных термопар (появление равнозначных цифровых показаний на дисплеях) измерения проводили в течение 15 минут с ежеминутной регистрацией показаний термометров. Достоверность результатов учета оценивали по критерию достоверности p<0,05 после статистической обработки данных с помощью компьютерной программы «Министат», созданной на основе работы И.А. Ойвина (Ойвин И.А. Статистическая обработка экспериментальных исследований // Патологическая физиология. - 1960. - №4. - С.76-85).

Количество тепловой энергии в калориях, вырабатываемой в опытной системе в результате биоспецифического взаимодействия активных центров Ат и Аг определяли по температурной разнице параметров состояния с контрольной системой. При различных изменениях температур жидкой среды в опытной и контрольной системах на величину экспериментально определяемой разницы в °C, с учетом равнозначных условий выполнения опыта, по удельной теплоемкости жидкой среды, равной 1,0 кал/г град, и, далее, по времени наблюдения - t, коэффициенту механического эквивалента тепла I=4,18 Дж/кал осуществляли перевод калорий в единицы энергии и работы системы СИ - Джоули. Величину внутренней энергии биоспецифически реагирующей суспензии РАО определяли в Джоулях (система СИ) или калориях. Одна калория эквивалентна 4,18 Дж и равна количеству тепла, необходимому для нагревания 1,0 г воды от 19,5 до 20,5°C. Величину совершаемой при этом работы определяли по средней величине внутренней энергии системы в течение времени достижения в измерительных системах равновесного состояния (Савельев И.В., 1989).

Возможность практического использования заявляемого способа иллюстрируется примерами его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.

Пример 1. Калибровали электронные термодатчики в жидкой среде. Готовили 2,5 мл раствора бруцеллезных антител в титре 1:25 и 2,5 мл суспензии убитых клеток бруцеллезного микроба в концентрации 2×10⁹ мк/мл, которые, наряду с дозаторами и ледяным калориметром с жидкостной измерительной камерой экспозировали в холодильнике до установления их температуры на уровне 6,0°C. Для стандартизации условий выполнения эксперимента в камеру ледяного калориметра вносили кубики льда с температурой 0°C, помещали импеллер, ставили калориметр на магнитную мешалку с регулируемой угловой скоростью и под контролем электронного термодатчика устанавливали температуру на уровне 6,0°C. Затем в камере калориметра размещали опытную пробирку с 2,5 мл раствора бруцеллезных антител и контрольную с 2,5 мл раствора туляремийных антител, в которых под контролем термодатчиков устанавливали одинаковую температуру, равную 6,0°C и сразу в каждую из пробирок вносили суспензию специфического бруцеллезного антигена по 2,5 мл. Каждую минуту регистрировали показания температуры в опытной и контрольной пробирках (системах). Наблюдение и регистрацию вели до установления равновесного состояния между опытной и контрольной системами, которое обычно устанавливалось через 15 минут. Числовые значения температур в опыте и контроле, показанные в таблице 1, статистически обрабатывали и оценивали по критерию достоверности p<0,05. По величине средней разницы температур в опыте и контроле рассчитывали энергию и работу за время свершения реакции в калориях и джоулях, которые, соответственно, составили 4,18 Дж/мл (1,0 кал/мл) и 1890 Дж/мл.

Пример 2. Не отличается по методике выполнения от примера 1 за исключением того, что в нем испытан раствор бруцеллезных антител в титрах 1:200 при температуре в калориметре 12°C. При этом величины энергии и работы, соответственно, составили 2,9 Дж/мл (0,7 кал/мл) и 1300 Дж/мл.

Пример 3. Не отличается по методике выполнения от примера 1 за исключением того, что в нем испытан раствор бруцеллезных антител в титрах 1:400 при температуре в калориметре 18°C. При этом величины энергии и работы, соответственно, составили 1,25 Дж/мл (0,3 кал/мл) и 567 Дж/мл.

Пример 4. Не отличается по методике выполнения от примера 1 за исключением того, что в нем испытан раствор туляремийных антител в титре 1:50 при температуре в калориметре 6°C. При этом величины энергии и работы, соответственно, составили 3,34 Дж/мл (0,8 кал/мл) и 1530 Дж/мл.

Пример 5. Не отличается по методике выполнения от примера 1 за исключением того, что в нем испытан раствор туляремийных антител в титре 1:200 при температуре в калориметре 12°C. При этом величины энергии и работы, соответственно, составили 1,67 Дж/мл (0,4 кал/мл) и 756 Дж/мл.

Пример 6. Не отличается по методике выполнения от примера 1 за исключением того, что в нем испытан раствор туляремийных антител в титре 1:400 при температуре в калориметре 18°C. При этом величины энергии и работы, соответственно, составили 0,63 Дж/мл (0,15 кал/мл) и 284 Дж/мл.

Таким образом, заявляемый способ практически осуществим и прост в исполнении. Использование предлагаемого способа в биотехнологии, микробиологии и иммунологии позволит определять количественные параметры энергии и работы, совершаемой за счет биоспецифически взаимодействующих активных центров антител и антигенов, в экспериментальной работе, при разработке медицинских иммунобиологических препаратов и проведении сравнительной оценки их качества в физических единицах энергии и работы на основании измерения изменений внутренней энергии реакции агглютинации объемной.