СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ ЯЗВЕННОЙ БОЛЕЗНИ ДВЕНАДЦАТИПЕРСТНОЙ КИШКИ У ЕВРОПЕОИДОВ ХАКАСИИ НА ОСНОВЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО ТЕСТИРОВАНИЯ

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии и гастроэнтерологии, касается способа раннего прогнозирования риска развития язвенной болезни у европеоидов Хакасии и может быть использовано для выявления патологии до появления органических изменений в виде язвенной болезни. В эпидемиологическом исследовании язвенной болезни у жителей Хакасии установлено, что у европеоидов в сравнении с хакасами в два раза выше распространенность этого заболевания и более тяжелое клиническое течение.

Язвенная болезнь - полиэтиологическое и патогенетически неоднородное заболевание, лидирующее в структуре патологии органов пищеварительной системы. Среди факторов, повышающих риск развития язвенной болезни, важное место занимает наследственность [5]. В настоящее время доказаны три этиологических фактора язвенной болезни: относительная гиперсекреция соляной кислоты, инфекция Helicobacter pylori, прием нестероидных противовоспалительных препаратов [2, 3].

Конвенционными факторами риска язвенной болезни принято считать мужской пол, курение, пубертатный возраст, наличие сопутствующих заболеваний.

Известен способ прогнозирования риска развития язвенной болезни (патент RU 2231794 C2), включающий исследования желудочных проб, основанный на измерении скорости диффузии ионов водорода через слой слизи, покрывающей слизистой оболочки желудка, путем введения в желудок тестового 0,1 H раствора соляной кислоты и исследования динамики проникновения ионов водорода в слизистой оболочки путем эвакуации содержимого желудка, тем самым определяют риск развития язвенной болезни.

Недостатком этого способа является сложность выполнения, которая заключается в многократной эвакуации содержимого желудка и введении в желудок большого количества соляной кислоты.

Известен способ «Способ прогнозирования тяжести течения кислотозависимых заболеваний ЖКТ у детей» (патент RU 2231068 C1), где прогноз течения язвенной болезни ведется с учетом коэффициента относительной гомозиготности, рассчитанного по числу выявленных рецессивных фенотипов изучаемых менделирующих признаков. В способ включен перечень, состоящий из 41 признака (ямочки на щеках, щель между зубами, способность свертывать язык трубочкой, группа крови и др.).

Этот способ дает возможность прогнозировать развитие язвенной болезни на основе расчета коэффициента относительной гомозиготности. Способ, по мнению авторов, может использоваться в условиях поликлиники в качестве маркера для отбора детей в группу риска по кислотозависимым заболеваниям органов пищеварения.

Недостатками метода является то, что он используется для прогнозирования тяжести течения часто встречающихся заболеваний ЖКТ, риска развития осложнений и рецидивов у больных с уже имеющейся кислотозависимой патологией, а также ограниченность группы детским возрастом.

Известен способ «Способ прогнозирования вероятности возникновения язвенной болезни двенадцатиперстной кишки» (патент RU 2143684 C1), учитывающий генетическую составляющую риска язвенной болезни двенадцатиперстной кишки (антигены системы АВО, типы гаптоглобулина, трансферрина, кислой фосфатазы и т.д.).

Недостатком данного метода является игнорирование генетических особенностей развития воспалительной реакции при Helicobacter pylori-инфекции. Так как генетическая детерминированность иммунного ответа патогенетически значима в развитии язвенной болезни двенадцатиперстной кишки и соответствует концепции воспалительной теории ульцерогенеза [1].

Кроме того, все перечисленные способы не являются превентивными и не учитывают этно-популяционные характеристики населения, включая адаптационно-генетические аспекты взаимодействия человека с микроорганизмом и внешней средой, которые необходимы для формирования предпосылок персонализированной медицины.

Задача предлагаемого способа - раннее прогнозирование развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у европеоидов (пришлого населения) Республики Хакасия.

Технический результат заявляемого способа состоит в повышении точности прогноза развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, а достигается тем, что устанавливают факторы риска на основе клинико-лабораторного исследования больного.

Отличие способа заключается в том, что определяют полиморфизмы в генах цитокинов и генотип микроорганизма, а установленным факторам риска присваивают градации (A1-A2) и числовые значения, где

A1 - генотип полиморфизма C+3953Т гена IL-1β: TT=0,44, TC=0,51, CC=2,63;

A2 - генотип полиморфизма гена IL-1Ra VNTR: R2R2=1,74, R2R3=8,08, R2R4=1,33, R3R3=1,59, R3R4=0,30, R4R4=0,51.

После чего определяют прогностические коэффициенты P1, P2 по формулам

P1=-1,54+0,57*A1+0,53*A2, где

P1 - вероятность отнесения к группе с низким риском ЯБ;

A1 - генотип полиморфизма C+3953Т гена IL-1β;

A2 - генотип полиморфизма гена IL-1Ra VNTR;

0,57, 0,53 - численные значения, являются коэффициентами в прогностической модели;

-1,54 - константа для пациентов с низким риском развития ЯБ.

P2=0,21+1,77*А1+1,70*А2, где

P2 - вероятность отнесения к группе с высоким риском ЯБ;

A1 - генотип полиморфизма C+3953Т гена IL-1β;

A2 - генотип полиморфизма гена IL-1Ra VNTR;

1,77, 1,70 - численные значения, являются коэффициентами в прогностической модели;

0,21 - константа для пациентов с высоким риском развития ЯБ.

При P1>P2 прогнозируют низкий риск, а при P1<P2 прогнозируют высокий риск развития ЯБ.

Данные формулы были получены на основании исследования 35 пациентов, относящихся к европеоидной популяции Хакасии, страдающих язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки.

Отбор пациентов язвенной болезнью делали на основании клинических, эндоскопических и морфологических данных. Обязательным критерием включения в группу исследования было наличие у пациентов HP. Присутствие бактерий подтверждалось одним из четырех методов: быстрый уреазный тест, серологический, гистобактериоскопическое исследование биоптатов слизистой оболочки желудка или метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

В исследование не включались пациенты с сочетанной патологией.

Пациентам, включенным в исследование, в предшествующие шесть месяцев не проводилось лечение антибактериальными и нестероидными противовоспалительными препаратами, ингибиторами протонной помпы, глюкокортикоидами, а также эрадикационная терапия. Возраст всех обследованных пациентов от 18 до 55 лет. Обязательным условием было информированное согласие на участие в исследовании.

Новым является то, что для осуществления способа рассчитывают прогностические индексы, учитывающие генетические факторы (C+3953T IL1β и IL1RA VNTR) и этническую принадлежность - европеоиды.

Данные отличительные признаки не известны в научно-медицинской и патентной литературе. Таким образом, предложенный способ соответствует критерию «новизна».

Совокупность отличительных признаков не вытекает явным образом для специалиста из уровня техники. Таким образом, предлагаемый способ соответствует критерию «изобретательский уровень».

Данный способ прошел клинические испытания на клинической базе Хакасского государственного университета им. Н.Ф. Катанова - Республиканской клинической больнице им. Г.Я. Ремишевской. Таким образом, данное техническое решение соответствует критерию изобретения «промышленно применимо».

Способ осуществляют следующим образом.

Способ решения задачи заключается в том, что при амплификации специфического участка гена IL-1β и рестрикции ферментом Taq I определяют наличие аллеля C в гомозиготном состоянии в положении C+3953T, а также при выявлении гомозиготности по числу тандемных повторов соответствующих 2R при амплификации IL-1Ra VNTR у пациентов, инфицированных vacA-штаммом Helicobacter pylori, прогнозируют ранний риск развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки.

Кровь для выделения ДНК собирают из локтевой вены в пробирку с ЭДТА. ДНК экстрагируют из лейкоцитов. В работе использовали полиморфные маркеры генов C+3953T IL1β и IL1RA VNTR [4, 6]. Реакции проводились в термостате для проведения ПЦР-амплификации (ТПЧ-ПЦР-01 - «Терцик» ЗАО НПФ ДНК-технология, Москва).

Фрагменты ПЦР денатурировали при температуре 92°C в течение 90 с - денатурация, затем 40 циклов (60°C - отжиг праймеров 30 с, 74°C - элонгация 30 с, 92°C денатурация 30 с), затем 72°C 10 мин наработка продукта.

Рестрикция: к амплификату добавляли смесь для рестрикции: 0,15 мкл фермента, содержащего 3 ед., 0,15 мкл BSA, 1,5 мкл буфера из расчета на 1 пробу. Инкубировали при +37°C либо при +65°C в течение 12 ч.

Детекцию продуктов амплификации проводили в 4% агарозном геле с содержанием 0,1% водного раствора бромистого этидия («Sigma», США). В качестве маркера размера ДНК использовали плазмиду pUC19, расщепленную рестриктазой MspI («Сибэнзим», г. Новосибирск).

Определяют полиморфизмы/мутации в генах цитокинов и генотип микроорганизма. Установленным факторам риска присваивают градации (A1-A2) и числовые значения. После чего определяют прогностические коэффициенты P1, P2, сравнивают их числовые характеристики между собой и оценивают риск развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки. При P1>P2 прогнозируют низкий риск, а при P1<P2 прогнозируют высокий риск развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки.

Предложенный способ прогнозирования язвенной болезни поясняется примерами конкретного выполнения.

Пример 1.

Пациентка М., европеоидного происхождения, 39 лет, с синдромом язвенной диспепсии. В анамнезе - язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки у отца пациентки. Методом ПЦР биоптата слизистой оболочки желудка выявлен генотип возбудителя - s1m1 vacA Helicobacter pylori, a методом ПДРФ - анализа определены генотипы ТТ+3953 IL-1β и R3R3 IL-1RaVNTR.

Интерпретация результатов:

P1=-1,54+0,57*0,44+0,53*1,59=-1,54+0,2508+0,8427=-0,4465

P2=0,21+1,77*0,44+1,70*1,59=0,21+0,7788+2,703=3,6918

P1 меньше Р2 (-0,4465<3,6918). Следовательно, у данной пациентки определен высокий риск развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки. При повторном обследовании в 2012 г. диагностирована язвенная болезнь - прогноз подтвердился.

Пример 2.

Пациент В., европеоидного происхождения, 47 лет, клинические проявления диспепсии. Методом ПЦР биоптата слизистой оболочки желудка выявлен - s1s2 vacA штамм Helicobacter pylori, методом ПДРФ-анализа - генотипы CC+3953 IL-1β и R2R2 IL-1Ra VNTR.

Интерпретация результатов:

P1=-1,54+0,57*2,63+0,53*1,74=-1,54+1,4991+0,9222=0,8813

P2=0,21+1,77*2,63+1,70*1,74=0,21+4,6551+2,958=7,8231

P1 меньше P2 (0,8813<7,8231). Следовательно, у данного пациента определен высокий риск развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки. При повторном обследовании в 2013 г. методом ФГС выявлена язвенная болезнь, то есть прогноз подтвердился.

Оценка эффективности предполагаемого способа прогнозирования проводилась в экспериментальной группе (n=26 пациентов с диспепсией) и в контрольной группе (n=38 доноров добровольцев без клинических и инструментальных признаков язвенной болезни). Группу контроля наблюдали в течение 3-х лет, в период с 2009 по 2013 годы, в этой группе язвенная болезнь была выявлена у 4 больных. Точность прогноза - 97,7%.

Таким образом, новый способ обладает достаточно высокой чувствительностью (100%), специфичностью (50%) и точностью (75%) в оценке риска развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, что позволит проводить целенаправленные и ранние профилактические мероприятия распространенного заболевания.

Источники информации

1. Особенности цитокинового профиля у пациентов с хроническим H. pylori - ассоциированным гастритом и язвенной болезнью [Текст] / Э.А. Кондрашина, Н.М. Калининина, Н.И. Давыдова [и др.] // Цитокины и воспаление. - 2002. - Т.1, №4. - С.3-11.

2. Штыгашева О.В. Распространенность инфекции Helicobacter pylori и частота диспептических жалоб у населения Хакасии [Текст] / О.В. Штыгашева, В.В. Цуканов // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. - 2004. - №2. - С.33-36.

3. Ющук Н.Д. Иммунный ответ при инфекции, вызванной Helicobacter pylori [Текст] / Н.Д. Ющук, И.В. Маев, К.Г. Гуревич // Журнал Микробиологии. - 2003. - №6. - С.86-91.

4. Association of IL-1B and IL-1 receptor antagonist haplotypes with rate of decline in lung function in smokers [Text] / L. Joos, L. McIntyre, J. Ruan [et al.] // Thorax. - 2001. - Vol.56. - P.863-866.

5. Ethnic difference of Helicobacter pylori gastritis: Korean and Japanese gastritis is characterized by male- and antrum-predominant acute foveolitis in comparison with American gastritis [Text] / I. Lee, H. Lee, M. Kim [et al.] // World Journal of Gastroenterology. - 2005. - Vol.11 (1). - P.94-98.

6. The Mouthwash: A Non-Invasive Sampling Method to Study Cytokine Gene Polymorphisms [Text] / M.L. Laine, M.A. Farre, J.B.A. Crusius [et al.] // Periodontol. - 2000. - Vol.71, №8. - P.1315-1318.