СПОСОБ СНИЖЕНИЯ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОГО СКАЧКА РАСТВОРОВ КРИОПРОТЕКТОРОВ

Изобретение относится к области криобиологии и может использоваться для снижения температурного скачка при кристаллизации растворов с клетками живых организмов.

Известен способ снижения низкотемпературного скачка путем внесения затравки для кристаллообразования (йодистое серебро, кристаллы льда) (см. кн. Пушкарь Н.С., Белоус A.M. Введение в криобиологию. - Киев: Наукова Думка, 1975. - С.21)

Однако этот способ нетехнологичен и приемлем только для небольшого количества замораживаемого материала.

Наиболее близким по технической сущности является способ механического сидинга, который выполняют при температурах (-5)°C-(-7)°C вручную путем прикосновения пинцетом или другим предметом к пробирке, содержащей раствор с клетками (см. кн. Хименков А.В., Брушков А.В. Введение в структурную криологию. - М.: Наука, 2005. - С.203).

Однако данный способ снижения температурного скачка при криоконсервации является трудоемкой операцией, занимающей много времени.

Техническая задача - создание способа снижения низкотемпературного скачка при кристаллизации растворов криопротекторов, позволяющего повысить целостность дефростированных клеток после криоконсервации.

Технический результат - снижение низкотемпературного скачка растворов криопротекторов при замораживании клеток живых организмов.

Он достигается тем, что в способе, включающем замораживание криораствора с биологическим материалом в жидком азоте, до операции замораживания раствора криопротекторов с клетками живых организмов осуществляют дистанционное воздействие на замораживаемый раствор ультразвуковым излучением частотой 0,50-10 МГц.

Способ осуществляется следующим образом.

Клетки живых организмов разбавляют криопротектором, ставят на эквилибрацию. Перед замораживанием на смесь криопротектора с клетками живых организмов воздействуют ультразвуковым излучением на всю площадь раствора, на расстоянии, которое зависит от мощности излучателя (чем мощнее излучатель, тем больше расстояние), частотой 0,50-10 МГц, т.к. при данных параметрах сигнала наблюдали снижение низкотемпературного скачка растворов криопротекторов, что влияет на повышения целостности дефростированных клеток после криоконсервации.

Пример 1. Работы проводили в лаборатории «Водные биоресурсы и аквакультура» Южного научного центра Российской академии наук совместно с научно-исследовательской лабораторией «Криотехнологии в аквакультуре» Астраханского государственного технического университета.

Исследовали 4 раствора - дистиллированную воду; базовый раствор для осетровых рыб (NaCl - 6,5 г/л, KCl - 0,25 г/л, CaCl₂ - 0,3 г/л, NaHCO₃ - 2 г/л, Tris-HCl до рН 7.5-8) (см. ст.Burzawa-Gerard E., Goncharov B.F., Dumas A., Fontaine Y.A. Further biochemical studies on carp gonadotropin, biochemical and biological comparison of c-GTH and a gonadotropine from Acipenser stellatus Pall. // Gen.Comp.Endocrinol. 1976. V.29, №4. - P.499); базовый раствор +10% диметилсульфоксида; базовый раствор +10% диметилсульфоксида +10% яичного желтка.

Емкости для замораживания были выполнены из кварцевого стекла, т.к. через кварцевое стекло проходят ультразвуковые волны. Объем образца составлял 50 мкл. Толщина слоя раствора - 0,2 мм. Замораживание образцов было выполнено двумя вариантами. Первый - контрольный, без ультразвука, второй - с воздействием ультразвукового излучения (частота 0,88 МГц, мощность 1 Вт/см² на расстоянии 1 см от ультразвукового излучателя) на всю площадь раствора.

Растворы замораживали в парах жидкого азота при (-130)°C. Температуру измеряли термометром АТТ-2006.

В таблице 1 показана термограмма замораживания раствора: а - дистиллированная вода: контрольный вариант, не обработанный ультразвуком (---); подвергнутый обработке ультразвуком раствор (-), b - базовый раствор для осетровых: контрольный вариант, не обработанный ультразвуком (---); подвергнутый обработке ультразвуком раствор (-), с - базовый раствор +10% диметилсульфоксида: контрольный вариант, не обработанный ультразвуком (---); подвергнутый обработке ультразвуком раствор (-), d - базовый раствор +10% диметилсульфоксида +10% яичного желтка: контрольный вариант, не обработанный ультразвуком (---); подвергнутый обработке ультразвуком раствор (-).

Из таблицы 1 видно, что при замораживании контрольного варианта происходит переохлаждение (до (-2)-(-9)°C), а потом при кристаллизации льда температура повышается до 0°C, что не наблюдается в растворах, обработанных неконтактным ультразвуковым излучением. Снижение низкотемпературного скачка при кристаллизации растворов криопротекторов, позволяет повысить целостность дефростированного биологического материала.

Таким образом, дистанционное воздействие на замораживаемый раствор ультразвуковым излучением, за счет облучения всей площади, вызывает снижение влияния низкотемпературного скачка растворов криопротекторов, полностью исчезает эффект переохлаждения, скорость замерзания принимает непрерывный и плавный характер, что влияет на повышение целостности дефростированных клеток после криоконсервации.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Пушкарь Н.С., Белоус A.M. Введение в криобиологию. - Киев: Наукова Думка, 1975. - С.21.

2. Burzawa-Gerard E., Goncharov B.F., Dumas A., Fontaine Y.A. Further biochemical studies on carp gonadotropin, biochemical and biological comparison of c-GTH and a gonadotropine from Acipenser stellatus Pall. // Gen.Comp.Endocrinol. 1976. V.29, №4. - P.499.

3. Хименков А.Н., Брушков А.В. Введение в структурную криологию. - М.: Наука, 2005. - С.203. (прототип)