Результат интеллектуальной деятельности: НАБОР ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИХ НУКЛЕОТИДОВ И БИОЧИП ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В СПОСОБЕ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ МАРКЕРОВ ГАПЛОГРУПП Y-ХРОМОСОМЫ ЧЕЛОВЕКА: M130 (C), М145 (DE)

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области генетики, молекулярной биологии, судебной медицины и криминалистики и касается инструмента для определения гаплогрупп Y-хромосомы человека.

Уровень техники

Задача определения гаплогрупп Y-хромосомы актуальна как в области судебно-медицинской экспертизы для предположения этнической принадлежности преступника, так и в области научных исследований расселения и миграции народов. Известен ряд способов генотипирования однонуклеотидных полиморфизмов ДНК, к которым относятся SNP-маркеры гаплогрупп Y-хромосомы.

1. Анализ полиморфизма длины рестриктазных фрагментов ДНК (ПДРФ - анализ). В результате мутаций в геномной ДНК возникают новые или утрачиваются ранее существовавшие сайты рестрикции - места воздействия рестриктаз, расщепляющих цепь ДНК. Это, в свою очередь, обусловливает изменение длины получающихся рестриктазных фрагментов ДНК. Распределение фрагментов по длинам выявляется с помощью электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле. Метод трудоемок, малопроизводителен и не поддается автоматизации. Эти качества наряду с высокой требовательностью к количеству и сохранности исследуемой ДНК являются основными недостатками метода, приведшими к его исчезновению из молекулярно-биологической практики. [Joseph Т, Kusumakumary Р, Chacko Р, Abraham A, Radhakrishna Pillai M. Genetic polymorphism of CYP1A1, CYP2D6, GSTM1 and GSTT1 and susceptibility to acute lymphoblastic leukemia in Indian children. Pediatr Blood Cancer. 2004 Oct; 43(5):539-41.]

2. Секвенирование амплифицированных фрагментов ДНК, т.е. определение индивидуального генетического кода в заданном фрагменте ДНК. Самый точный и доказательный метод анализа индивидуальных генетических вариаций. Преимуществом является высокая точность и чувствительность метода, а недостатком - высокая стоимость оборудования и анализа, что мешает широкому внедрению метода в рутинную практику.

3. Выявление однонуклеотидного полиморфизма методом аллельспецифичной ПЦР. Аллельные варианты различаются за счёт того, что 3' концевой нуклеотид одного из праймеров в процессе ПЦР гибридизуется непосредственно с позицией SNP (т.е. если этот праймер комплементарен последовательности ДНК, то происходит амплификация продукта). Метод требует оборудования умеренной стоимости, однако для анализа полиморфизма в одном локусе потребуется 2 лунки плашки. Т.е. для исследования 1 образца по десяти маркерам гаплогрупп потребуется 20 лунок плашки. Зачастую в образце с места преступления может не оказаться количества ДНК, достаточного для проведения такого количества реакций. Преимуществом аллельспецифичной ПЦР является время анализа - всего 3-4 часа. [Murata M, Shiraishi Т, Fukutome К, Watanabe M, Nagao M, Kubota Y, Ito H, Kawamura J, Yatani R. Cytochrome P4501A1 and glutathione S-transferase Ml genotypes as risk factors for prostate cancer in Japan. Jpn J Clin Oncol. 1998 Nov; 28(11):657-60.]

4. Выявление однонуклеотидного полиморфизма методом гибридизации амплифицированного исследуемого образца с олигонуклеотидной матрицей. Данный метод предполагает предварительную мультиплексную амплификацию исследуемых фрагментов ДНК с использованием флюоресцентно меченных праймеров. В результате добавления избытка меченного праймера ПЦР достигается образование большого количества меченого преимущественно одноцепочечного продукта. Этот продукт гибридизуют с олигонуклеотидными зондами, иммобилизованными в определенном месте твердой подложки, либо в гелевых микрокаплях, закрепленных на подложке (такая матрица ДНК-зондов носит название биологического микрочипа или биочипа). Если последовательность анализируемой ДНК полностью комплементарна последовательность зонда, то образуется стабильный дуплекс (регистрируется флюоресцентный сигнал), если искомого фрагмента нет, или же в нем находится некомплементарное основание, то стабильного дуплекса не образуется (сигнал значительно ослаблен либо вообще не наблюдается). Простота метода, низкая стоимость и возможность использования флюоресцентной метки позволяет легко автоматизировать процесс. Кроме того, метод позволяет использовать мультиплексную ПЦР. Обычно при качественном подборе ПЦР-праймеров в ходе одной реакции могут быть амплифицированы до 15 локусов ДНК. Это является выигрышным моментом, учитывая обыкновенно малые количества ДНК, полученные с места преступления. [Wen SY, Wang H, Sun OJ, Wang SQ. Rapid detection of the known SNPs ofCYP2C9 using oligonucleotide microarray. World J Gastroenterol. 2003 Jun; 9(6):1342-6.] Пример реализации данного подхода описан в следующей работе [Наседкина Т.В., Фесенко Д.О., Митяева О.Н., Лысое Ю.П., Барский В.Е., Заседателев А.С. (2007). Способ генетической идентификации личности на основе анализа однонуклеотидного полиморфизма генома человека с использованием олигонуклеотидного биологического микрочипа. Патент PCT/RU/2007/000016, международная заявка № WO 2008088236], где предлагается инструмент, выполняющий выборочный анализ трех генов и позволяющий разделить всю популяцию на 1350 групп.

Ближайшим аналогом настоящего изобретения является инструмент, описанный в п.4.

Раскрытие изобретения

Сущность изобретения заключается в создании биочипа (под условным названием «Y-10»), в ячейках которого иммобилизованы оригинальные дифференцирующие олигонуклеотиды, подобранные таким образом, чтобы специфично связываться с аллелью исходного или группоспецифичного типа. Применение биочипа Y-10 позволит генотипировать 10 маркеров гаплогрупп Y-хромосомы: С, DE, G, H, I, J, L, N, О и R.

Дифференцирующие олигонуклеотиды (SEQ ID NO:1-20) иммобилизуются в ячейках гидрогелевого микрочипа, как описано в патенте [Мирзабеков А.Д., Рубина А.Ю., Паньков С.В., Перов А.Н., Чупеева В.В. Композиция для иммобилизации биологических макромолекул в гидрогелях, способ приготовления композиции, биочип, способ проведения ПЦР на биочипе. RU 2206575 С2] в концентрации 100-10000 пкмоль на 1 мкл геля в зависимости от задач исследователя. Схема расположения ячеек может быть произвольной, мы использовали схему, приведенную на Фиг.1. В верхней половине биочипа нанесены ячейки с дифференцирующими олигонуклеотидами исходного типа, а в нижней - группоспецифичные олигонуклеотиды. Флюоресцентный сигнал от ячеек в верхней части свидетельствует об исходном генотипе по данному маркеру, сигнал в нижней части - о принадлежности исследуемого образца к соответствующей гаплогруппе. Проведение анализа с использованием предлагаемого изобретения выполняется аналогично способу, описанному в работе [Наседкина Т.В., Фесенко Д.О., Митяева О.Н., Лысое Ю.П., Барский В.Е., Заседателев А.С. (2007). Способ генетической идентификации личности на основе анализа однонуклеотидного полиморфизма генома человека с использованием олигонуклеотидного биологического микрочипа. Патент PCT/RU/2007/000016, международная заявка № WO 2008088236}. По итогам гибридизации и отмывки анализируется полученная флуоресцентная картина, на основании чего делается вывод о генотипе (гаплогруппе) в исследуемом образце. Пример гибридизационной картины приведен на Фиг.2.

Характеристики анализируемых маркеров:

M130 - маркер гаплогруппы С. Высокой концентрации достигает у монголов (до 60%, а также у родственных им народов бурят, калмыков и хэзарейцев)

M145 - маркер гаплогруппы DE. Содержит два подкомпонента: гаплогруппу D и гаплогруппу Е. Достаточно широко распространена среди народов России и сопредельных стран.

Р257 - маркер западнокавказской гаплогруппы G.

М69 - маркер гаплогруппы Н. В наибольшей степени распространена у цыган, а также у коренных жителей Индии,

U179 - маркер гаплогруппы I. Встречается почти у 20% европейского населения, является единственной известной "большой" гаплогруппой, произошедшей на территории Европы.

М304 - маркер гаплогруппы J. Подгруппами гаплогруппы J являются J1 и J2. Гаплогруппа J1 (М267) - "западноазиатская" и "ближневосточная", наиболее типична для населения Восточной Анатолии. Распространена на Кавказе.

M185 - маркер гаплогруппы L. Происхождение этой гаплогруппы связывают с Южной Азией, с западом полуострова Индостан. Там же и превалируют ее носители. В России встречается не часто, но, тем не менее, достаточно для включения в список анализируемых гаплогрупп.

М231 - маркер гаплогруппы N. Гаплогруппа встречается в Центральной, Северной Европе и повсеместно в европейской и азиатской частях России. Наиболее генетически «чистые» представители - якуты, удмурты (68%) и финны (61%).

M175 - маркер гаплогруппы О. Характерна для представителей монголоидной расы. Высокая концентрация носителей этой гаплогруппы наблюдается в регионе Восточной и Юго-Восточной Азии у китайцев, японцев, филиппинцев, малайцев, а также у сопредельных народов, на которых они повлияли в качестве субстрата. Совершенно отсутствует эта гаплогруппа в Европе, Африке, Америке и на Ближнем Востоке.

Р224 - маркер гаплогруппы R. Наиболее распространена в Европе, Западной Евразии, индийском субконтиненте.

Данные, полученные с помощью настоящего изобретения, могут быть использованы для поисковых целей (этническая принадлежность, этническая специфика фамилии), сужения круга подозреваемых лиц, анализа смешанных образцов при изнасилованиях, определения принадлежности древних останков при проведении исследовательских работ.

В качестве образцов для исследования могут быть использованы любые биологические материалы, содержащие геномную ДНК: следы крови, слюны, пота, спермы, волосяная луковица, отпечатки пальцев, содержащие частички эпителия, влагалищный мазок, кости и проч.

Основным аспектом данного изобретения является набор дифференцирующих олигонуклеотидов, иммобилизованных на биочипе и последовательность которых приведена в Табл.1 и Перечне последовательностей (SEQ ID NO:1-20).

Осуществление изобретения

Задача настоящего изобретения состоит в создании биочипа, позволяющего определять 10 маркеров гаплогрупп Y-хромосомы: С, DE, G, H, I, J, L, N, О и R. Важнейшей задачей при осуществлении данного изобретения является обеспечение такой структуры дифференцирующих олигонуклеотидных зондов, чтобы происходило их связывание только с полностью комплементарными мишенями, обеспечивая яркий флуоресцентный сигнал в соответствующих им ячейках биочипа. В то же время неспецифическое связывание должно быть сведено к минимуму, чтобы исключить ложноположительное «срабатывание» ячеек. В связи с тем, что область полиморфного сайта консервативна (за исключением полиморфного нуклеотида), парные зонды (анализирующие один однонуклеотидный полиморфный сайт) отличаются только по внутреннему нуклеотиду и идентичны по флангам. В такой ситуации необходимо варьировать длину фланкирующих областей, чтобы обеспечить высокое специфическое и низкое неспецифическое связывание исследуемой мишени. Т.к. на данный момент отсутствуют точные термодинамические методики расчета структуры зонда, выбор структуры осуществляется эмпирически, последовательным подбором и экспериментальной проверкой. В ходе этой работы были выбраны такие структуры, и они приведены в Табл.1 и Перечне последовательностей (SEQ ID NO:1-20).

Согласно приведенным в Табл.1 структурам выполняется синтез дифференцирующих олигонуклеотидов. Для закрепления в геле или на поверхности - по 5'- или 3' - концу могут быть присоединены якорные группы, обеспечивающие иммобилизацию, например NH₂. Существуют разнообразные химические подходы к синтезу олигонуклеотидов, например фосфодиэфирный метод, гидрофосфорильный метод, и т.д. но наибольшее распространение в настоящее время имеет фосфорамидитный метод. Синтез олигонуклеотидов осуществляют, используя автоматические ДНК/РНК синтезаторы, например производства фирмы Applied Biosystems (США). Возможно использование широкого спектра групп для модификации иммобилизуемых олигонуклеотидов, таких как аминогруппа, тиол, гидразид, акриламидная группа, бензальдегид, тиофосфат и т.п. (Seliger H., Hinz М., Нарр Е, "Arrays of immobilized oligonucleotides - contributions to nucleic acids technology" Current Pharmaceutical Biotechnology, 2003, 4, 379-395). Модификация олигонуклеотида, имеющая целью введение активной группы, пригодной для последующей иммобилизации олигонуклеотида на биочипе, может быть осуществлена как в автоматическом режиме при синтезе с использованием широкого спектра модификаторов, которые коммерчески доступны, например, от Glen Research (USA), так и постсинтетически в ручном режиме.

Биочипы могут быть изготовлены путем создания на поверхности стеклянной подложки матрицы из ячеек полиакриламидного геля, активации ячеек и ковалентной иммобилизации в ячейках модифицированных олигонуклеотидов, несущих активные группы (Mirzabekov А. & Kolchinsky A. MAGIChip: Properties and applications in genomic studies. (2002) In Genomic Technologies : Present and Future. Eds. Galas D.J., S.J.McCormack. Caister Academic Press, pp.163-196). Также биочипы могут быть изготовлены методом химически индуцируемой или фотоиндуцируемой сополимеризации олигонуклеотида в акриламидном геле, как описано ранее (Vasiliskov, V., Timofeev E., Surzhikov S., Drobyshev, A., Shick, V. & Mirzabekov, A. 1999. Fabrication of microarray of gel-immobilized compounds on a chip by copolymerization. BioTechnique, 27, 592-606; Мирзабеков А.Д., Рубина А.Ю., Паньков С.В., Чернов Б.К Патент на изобретение N 2175972 «Способ иммобилизации олигонуклеотидов, содержащих непредельные группы, в полимерных гидрогелях при формировании микрочипа». Приоритет от 28.12.1999). Также биочипы могут быть изготовлены любыми другими известными специалисту в данной области способами (Seliger H., Hinz М., Нарр Е. "Arrays of immobilized oligonucleotides - contributions to nucleic acids technology" Current Pharmaceutical Biotechnology, 2003, 4, 379-395), а в качестве подложки, помимо стекла может быть использован другой материал (пластик, металл, гибкие мембраны и т.д.). Также для изготовления микрочипов могут быть использованы активированные подложки, коммерчески доступные от различных производителей (см., например, Ramakrishnan R, Dorris D, Lublinsky A, Nguyen A, Domanus М, Prokhorova A, Gieser L, Touma E, Lockner R, Tata M, Zhu X, Patterson M, Shippy R, Sendera TJ, Mazumder A. 2002.An assessment of Motorola CodeLink microarray performance for gene expression profiling applications. Nucleic Acids Res. 30: e30).

Для изготовления биочипа настоящего изобретения используют набор олигонуклеотидов SEQ ID NO:1-20, приведенных в Перечне последовательностей, а также Табл. 1. Расположение олигонуклеотидных зондов на биочипе может варьировать и определяется только удобством для интерпретации результатов гибридизации.

Далее приведем последовательность анализа с использованием данного изобретения. Образец ДНК используют как матрицу в мультиплексной «гнездной» двухэтапной ПЦР, использующей праймеры, специфично амплифицирующие локусы Y-хромосомы, содержащие маркеры М130 (С), М145 (DE), P257 (G), M69 (Н), U179 (I), М304 (J), M185 (L), M231 (N), M175 (О) и Р224 (R). ПЦР-праймеры не являются аспектом данного изобретения и могут быть подобраны и синтезированы квалифицированным исследователем самостоятельно. Мечение ПЦР-продукта на втором этапе ПЦР проводят с помощью праймеров, несущих флуоресцентную метку на 5'-конце, либо включением меченых трифосфатов в растущую цепь ампликона. В качестве флуоресцентной метки может быть использован любой флуорохром (например, без ограничения, FITC, Texas red, Су-3, Су-5 и т.д.), а также биотин. На втором этапе мультиплексной «гнездной» ПЦР праймеры, входящие в состав одной пары, используются в неравных количествах (преобладает обратный праймер). Это позволяет получать преимущественно одноцепочечный ампликон «-» цепи, способный к гибридизации с ДКН-зондами.

Меченый ПЦР-продукт используют для дальнейшей гибридизации на биочипе, содержащем иммобилизованные дифференцирующие олигонуклеотиды. Перед постановкой гибридизации ампликон денатурируют путем прогрева готовой гибридизационной смеси при 95°С в течение 5 мин с последующим охлаждением во льду. Гибридизация может быть проведена в любом известном специалисту в данной области гибридизационном буфере, например в SSPE-буфере или гуанидиновом буфере. Типичные условия гибридизации - 8-12 ч. при 37°С. Отмывка может быть проведена в любом известном в данной области техники буфере с добавлением соли (SSC, SSPE и т.п.) или в деионизованной воде, за 10-15 мин (J.F.Sambrook and D.W. Russell, 2001, "Molecular cloning: a laboratory manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Анализируемый фрагмент ДНК образует совершенные гибридизационные дуплексы только с соответствующими полностью комплементарными ему олигонуклеотидами. Со всеми остальными олигонуклеотидами анализируемый фрагмент ДНК будет образовывать несовершенные дуплексы, стабильность которых существенно ниже стабильности совершенных дуплексов.

Регистрация гибридизационной картины может быть произведена с помощью любой детектирующей системы, распознающей флуоресцентный сигнал (флуоресцентный микроскоп с ПЗС-камерой, лазерный сканер или портативный анализатор биочипов, доступные коммерчески от большого числа производителей, например портативный анализатор биочипов, производимый серийно ООО «БИОЧИП-ИМБ», и снабженной регистрирующим устройством (ПЗС-камерой, видеокамерой, фотокамерой)). Анализ изображения может быть произведен как визуально, так и в автоматическом режиме с использованием специальной программы. Дискриминацию совершенных и несовершенных дуплексов проводят после отмывки биочипа, сравнивая интенсивности флуоресценции соответствующих ячеек биочипа. Интенсивность сигнала в случае образования совершенного дуплекса выше, чем в случае несовершенного. Используя схему расположения олигонуклеотидов на биочипе, определяют генотип исследуемого образца.

Таким образом, с помощью биочипа «Y-10» можно проводить генотипирование образца ДНК по маркерам М130 (С), М145 (DE), P257 (G), M69 (Н), U179 (I), M304 (J), М185 (L), M231 (N), M175 (О) и Р224 (R).

Далее изобретение иллюстрируется примерами, которые показывают применение способа экспресс-анализа генетического полиморфизма. Следует, однако, понимать, что приводимые примеры служат исключительно для иллюстрации и не предназначены для ограничения объема притязаний, выраженных в формуле изобретения. На основании настоящего описания специалист в данной области сможет легко предложить свои варианты и модификации осуществления изобретения, не отходя от общей концепции настоящего изобретения и без привлечения собственной изобретательской деятельности, так что должно быть понятно, что такие варианты и модификации также будут входить в объем притязаний настоящего изобретения.

Пример 1. Изготовление биочипа «Y-10».

Олигонуклеотиды для иммобилизации на микрочипе синтезируют на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA Synthesizer (Applied Biosystems, США) с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры. 3'-конец олигонуклеотидов содержит спейсер со свободной аминогруппой, который вводят в состав олигонуклеотида при синтезе путем использования 3'-Ammo-Modifier C7 CPG 500 (Glen Research, USA).

Присоединение флуоресцентной метки к олигонуклеотидам по свободной аминогруппе осуществляют в соответствии с рекомендациями производителя.

Биочип изготавливают методом сополимеризации олигонуклеотида в акриламидном геле, как описано ранее (Патент на изобретение N 2175972 «Способ иммобилизации олигонуклеотидов, содержащих непредельные группы, в полимерных гидрогелях при формировании микрочипа» Мирзабеков А.Д., Рубина А.Ю., Паньков С.В., Чернов Б.К. Приоритет от 28.12.1999). Биочип содержит 20 типов олигонуклеотидов (SEQ ID NO:1-20), список которых представлен также в Таблице 1. Ячейки наносят согласно схеме на Фиг. 1.

Пример 2. Проведение исследования ДНК с помощью биочипа «Y-10»

Образец ДНК выделяют из слюны испытуемого набором Qiagen. Для амплификации всех анализируемых локусов используют мультиплексную двухэтапную «гнездную» ПЦР с набором локус-специфичных праймеров. ПЦР проводят на приборе MiniCycler (MJ Research, Inc., USA) в объеме 25 мкл реакционной смеси, составом: для 1-го этапа: 1 × буфер (67 мМ Трис-HCl, рН 8,6, 166 мМ (NH₄)₂SO₄, 0,01% Тритон Х-100), 1,5 мМ MgCl₂, 0,2 мМ каждого из dNTP («Силекс», Россия), 1-5 рМ каждого из праймеров 1-го этапа, 1 мкл геномной ДНК и 1,5 ед. акт. Taq-полимеразы («Силекс», Россия). ДНК денатурируют 5 мин при 94°С и проводят в первом этапе 35-45 циклов амплификации (94°С - 30 с, 60°С - 30 с, 72°С - 1 мин), затем 7 мин при 72°С. Смесь второго этапа ПЦР отличается составом и концентрацией праймеров: верхние праймеры берут в концентрации 1-5 пкмоль/мкл, а нижние 5-50 пкмоль/мкл. В смесь добавляют 2 мкл продукта из первого этапа и амплифицируют по схеме: 3,5 мин 94°С, 34 цикла (94°С - 30 с, 62°С - 30 с, 72°С - 1 мин), 7 мин при 72°С. Смесь также содержит 0,01 мМ Cy5-dUTP. Нижние праймеры 2-го этапа предварительно помечены по 5' концу флуоресцентным красителем Су5 (возб./исп.: 640/657 нм). После проведения ПЦР содержимое пробирки используют для гибридизации на биочипе в буфере следующего состава: 25% формамид (Gibco BRL), 5 × SSPE. Готовую гибридизационную смесь перед гибридизацией денатурируют при 95°С в течение 5 мин, охлаждают во льду, 2 мин., и вносят в гибридизационную камеру биочипа (30 мкл). Гибридизацию проводят в течение 8-12 ч при температуре 37°С. Отмывку проводят в буфере 1 × SSPE при комнатной температуре в течение 10 мин.

Пример 3. Регистрация и интерпретация результатов гибридизации.

Регистрацию гибридизационной картины производят с помощью портативного анализатора биочипов, снабженного ПЗС-камерой, производимого ООО «БИОЧИП-ИМБ». Изображение записывается в виде файла с расширением .spe и может быть переведено в другие графические форматы, такие как .jpg, .jpeg, .tiff и проч.

Определим генотип по гибридизационной картине, представленной на Фигуре 2. Для всех маркеров, кроме Ml 75 (маркер гаплогруппы О, 9-й столбец слева) флюоресцируют ячейки с дифференцирующими олигонуклеотидами исходного типа (верхние ряды), а для Ml 75 верхние ячейки исходного типа не дают сигнал, а нижние, группоспецифичные, флюоресцируют, что свидетельствует о принадлежности образца к Y-хромосомной гаплогруппе О.