4-(2-ГИДРОКСИЭТОКСИ)МЕТИЛ)-5-МЕТИЛ-2-МЕТИЛМЕРКАПТО-1,2,4-ТРИАЗОЛО[1,5-a]ПИРИМИДИН-7(4Н)-ОН - ВЕЩЕСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОВИРУСНЫМ ДЕЙСТВИЕМ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ ПРОТИВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЛИХОРАДКИ ЗАПАДНОГО НИЛА

Заявляемое изобретение касается разработки нового вещества - 4-((2-гидроксиэтокси)метил)-5-метил-2-метилмеркапто-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(4H)-она, имеющего формулу

и предназначенного для лечения лихорадки Западного Нила у людей и животных.

Изобретение относится к области новых биологически активных веществ и касается соединений, активных против возбудителя лихорадки Западного Нила

Расширение ареалов распространения арбовирусных инфекций привели к ухудшению эпидемической обстановки в Российской Федерации.

С 1999 года на юге России сформировался устойчивый активный очаг лихорадки Западного Нила, поддерживаемый циркуляцией возбудителя среди мелких млекопитающих, птиц, комаров и подтверждаемый наличием иммунного ответа к вирусу Западного Нила у населения (см. Мероприятия по борьбе с лихорадкой Западного Нила на территории Российской Федерации (эпидемиологический надзор, диагностика, клиника, лечение и профилактика) Методические рекомендации. - М., 2001).

Ежегодно до 2008 года в Южном федеральном округе (ЮФО) зарегистрировались крупные вспышки этой инфекции, сопровождаемые в половине случаев неврологическими проявлениями: энцефалитами и менингоэнцефалитами (см. Борисевич С.В., Бондарев В.П. Лихорадка Западного Нила: прошлое и настоящее. // Молекул. медицина. - 2008. - №5. - С.47-51).

Увеличение заболеваемости ЛЗН стимулирует поиск новых и оценку эффективности уже имеющихся противовирусных препаратов. До начала вспышек лихорадки Западного Нила в 1999 году в России отсутствовали этиотропные и неспецифические препараты, а основу терапии ЛЗН составляли патогенетические средства (см. Мероприятия по борьбе с лихорадкой Западного Нила на территории Российской Федерации (эпидемиологический надзор, диагностика, клиника, лечение и профилактика). Методические рекомендации. - М., 2001).

Анализ данных, опубликованных в зарубежных источниках информации, в отношении этиотропных, эффективных неспецифических препаратов в отношении ЛЗН свидетельствует лишь о наличии единичных препаратов, в частности, рибавирина, α-2b интерферона, α- и β-интерферонов (мышиных)), эффективность которых показана in vivo (см. Odelola H.А. Antiviral activity of Virazole on replication of viruses isoleted in Nigeria. In: Siegenthaler W., Lathy R. editors. Current chemotherapy. Vol.1. Washington: American Society of Microbiology. - 1978. - Vol.1. - P.3343-3345) и vitro (см. Jordan I., Briese Т., Fisher N. et al. Ribavirin inhibits West Nile virus replication and cytopathic effect in neural cells // J. Infect. Dis. - 2000. - Vol.182. - P. 1214-1217. Shahar A., Lustig S., Akov Y. et al. Different pathogenicity of encephalitic togaviruses in organotypic cultures of spinal cord slices // J. Neurosci. Res. - 1990. - Vol.25. - P.345-352. Anderson J.F., J.J. Rahal. Efficacy of Interferon alpha-2b and Ribavirin against West Nile virus in vitro // Emerg. Inf. Dis. - 2002. - Vol.8, n. 1. - P.107-108).

Израильскими исследователями сконструирован гомологичный иммуноглобулин, обеспечивающий эффективное лечение тяжелых случаев ЛЗН (см. Z. Shimoni, V.J. Niven, S. Pitlick, S. Bulvic. Treatment of West Nile virus enchephalitis with intraveenous immunoglobulin // Emerg. Inf. Dis. - 2001. - Vol.7, n. 4. - P.759).

Отечественными специалистами также была выявлена умеренная эффективность амиксина в отношении вируса Западного Нила и высокая эффективность рибавирина (см. Логинова С.Я., Ковальчук А.В., Борисевич С.В. и др. Противовирусная эффективность индуктора интерферона амиксина в отношении экспериментальной формы лихорадки Западного Нила // Вопр. вирусол. - 2004. - №2. - С.14-17). Однако высокая токсичность рибавирина не позволяет его использовать в равноэквивалентных дозах для человека (см. Логинова С.Я., Борисевич С.В., Пащенко Ю.И., Бондарев В.П. Профилактика и терапия экспериментальной формы лихорадки Западного Нила // Антибиот. и химиотер. - 2009. - Том.54, №№11-12. - С.17-20; Логинова С.Я., Борисевич С.В., Максимов В.А., Бондарев В.П. Оценка токсичности неспецифических медицинских противовирусных средств, предназначенных для профилактики и лечения опасных и особо опасных вирусных инфекций // Антибиот. и химиотер. - 2009. - Том.54, №№3-4. - С.11-14).

С учетом изложенного, поиск и разработка эффективных средств профилактики и лечения этого вирусного заболевания являются актуальными.

Из уровня техники известны низкомолекулярные соединения, используемые для лечения и профилактики лихорадки Западного Нила, в частности, применение гетероциклических соединений (см. патенты МХ 2010013269, МХ 2011008988, WO 2008124550, WO 2010039538, WO 2012135402, WO 2011137447, WO 2012145567, RU 2365591), производные Сахаров (см. патент WO 2010027996), синтетические нуклеозиды (см. патенты NZ 588670, NZ 579880, МХ 2009002707, US 2012245335).

Наиболее близким техническим решением к заявляемому изобретению является соединение - натриевая соль 2-метилтио-5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(3H)-она, проявившее активность против возбудителя лихорадки Западного Нила и других флавивирусов (см. патент РФ №2365591 на изобретение «Лекарственное средство, обладающее противовирусным действием и содержащее 2-метилтио-5-метил-6-нитро-1,2,4 триазоло(1,5-а)пиридин-7(3H)-OH», дата подачи 21.05.2007 г., опубликовано 27.08.2009 г.

Техническим результатом данного изобретения является создание нового эффективного химического соединения, обладающего противовирусной активностью, в частности, против возбудителя Лихорадки Западного Нила (далее - ЛЗН).

Указанный технический результат достигается тем, что предложено новое соединение - 4-((2-гидроксиэтокси)метил)-5-метил-2-метилмеркапто-1,2,4-триазоло[1,5-a]пиримидин-7(4Н)-он, обладающее противовирусной активностью против возбудителя Лихорадки Западного Нила и имеющее формулу

Указанный результат достигается тем, что способ получения 4-((2-гидроксиэтокси)метил)-5-метил-2-метилмеркапто-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(4Н)-она заключается в дезацетилировании 4-((2-ацетоксиэтокси)метил)-5-метил-2-метилмеркапто-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(4Н)-она (II) при действии раствора метилата щелочного металла в алифатическом одноатомном спирте, при этом 4-((2-Ацетоксиэтокси)метил)-5-метил-2-метилмеркапто-1,2,4-триазоло[1,5-a]пиримидин-7(4Н)-он (II) получают при взаимодействии 5-метил-2-метилмеркапто-1,2,4-триазоло[1,5-a]пиримидин-7(4Н)-она (III) с (2-ацетоксиэтокси)метилацетатом (IV) в присутствии силицирующего средства, например, N,О-бис(триметилсилил)ацетамида (BSA) или гексаметилдисилиламин (ГМДС) и триметилсилилтрифторметилсульфоната (TMSOTf) в апротонном растворителе.

В качестве апротонного растворителя применяют, например, ацетонитрил, хлористый метилен, хлороформ.

Применение 4-((2-гидроксиэтокси)метил)-5-метил-2-метилмеркапто-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(4Н)-она для лечения лихорадки Западного Нила (ЛЗН).

Технических решений, совпадающих с совокупностью существенных признаков заявляемого изобретения, не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности, как «новизна».

Заявляемые существенные признаки, предопределяющие получение указанного технического результата, явным образом не следуют из уровня техники, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности, как «изобретательский уровень».

Условие патентоспособности «промышленная применимость» подтверждено на примерах конкретного применения.

4-((2-Гидроксиэтокси)метил)-5-метил-2-метилмеркапто-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(4Н)-он (I) получают путем дезацетилирования 4-((2-ацетоксиэтокси)метил)-5-метил-2-метилмеркапто-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(4Н)-она (II) раствором метилата щелочного металла в присутствии алифатического одноатомного спирта

При этом получение 4-((2-ацетоксиэтокси)метил)-5-метил-2-метилмеркапто-1,2,4-триазоло[1,5-a]пиримидин-7(4H)-она осуществляют путем взаимодействия 5-метил-2-метилмеркапто-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(4Н)-она (III) с (2-ацетоксиэтокси)метилацетатом (IV) в присутствии N,O-бис(триметилсилил)ацетамида (BSA или гексаметилдисилиламин (ГМДС) и триметилсилилтрифторметилсульфоната (TMSOTf) в апротонном растворителе, в качестве которого может быть использован или ацетонитрил, или хлористый метилен, или хлороформ.

Заявляемое соединение (I) представляет собой белое кристаллическое вещество, растворимое в воде, полярных растворителях, таких как метанол, диметилформамид, диметилсульфоксид, ацетон, но малорастворимое в бензоле, гексане и большинстве неполярных растворителей.

Данные элементного анализа, ЯМР-, УФ- и ИК-спектроскопии, а также масс-спектрометрии полностью соответствуют приписываемому строению.

Осуществление заявляемого изобретения подтверждается примерами конкретного выполнения.

Пример 1.

Синтез 4-((2-ацетоксиэтокси)метил)-5-метил-2-метилмеркапто-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(4Н)-она (II)

В 30 мл хлористого метилена суспендируют 7, г (35,7 ммоль) 5-метил-2-метилмеркапто-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(4Н)-она (III), после чего добавляют 12,9 мл (52,5 ммоль) BSA и 0,63 мл (3,57 ммоль) TMSOTf и перемешивают в течение 30 минут до полного растворения исходного гетероцикла. К полученному раствору при перемешивании и охлаждении на ледяной бане добавляют (2-ацетоксиэтокси)метилацетат (IV) и выдерживают реакционную смесь при комнатной температуре 8 часов, после чего разбавляют 20 мл хлористого метилена и 10%-ным раствором Na₂CO₃ (50 мл) и перемешивают в течение 10 минут. После разделения фаз водный слой экстрагируют хлористым метиленом (3×50 мл), экстракт высушивают над Na₂SO₄ и продукты алкилирования делят хроматографически.

Получено 3,3 г 3-((2-ацетоксиэтокси)метил)-5-метил-2-метилмеркапто-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(4Н)-она (34%) и 4,0 г 4-((2-ацетоксиэтокси)метил)-5-метил-2-метилмеркапто-1,2,4-триазоло[1,5-a]пиримидин-7(4Н)-она (41%). Тпл. 118-123°C; Вычислено для C₁₂H₁₆N₄O₄S, M=312,34, C: 46.14; H: 5.16; N: 17.94, Найдено, C: 46.10; Н: 5.11; N: 18.10. ЯМР ¹Н, δ, м.д.: 1.98 (с, 3H, COCH₃), 2.53 (с, 3H, SCH₃), 2.61 (с, 3H, CH₃), 3.78-3.80 (м, 2H, CH₂), 4.01-4.12 (м, 2Н, CH₂), 5.66 (с, 2Н, CH₂), 5.92 (с, 1H, Н6); ЯМР ¹³C, δ, м.д.: 13.4 (SCH₃), 17.5 (C₅CH₃), 20.5 (CO-CH₃), 62.7 (C4′), 67.1 (C3′), 76.5 (C1′), 101.2 (C6), 151.6 (C5), 153.0 (C3a), 153.9 (C7), 162.9 (C2), 170.2 (CO-CH3); Масс-спектрометрия (электроспрей) m/z: 313.14 [M+H]⁺; ИК: 1458, 1567, 1714, 1733, 2935, 3012.

Пример 2.

Синтез 4-((2-ацетоксиэтокси)метил)-5-метил-2-метилмеркапто-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(4H)-она (II)

К суспензии 5,0 г (25,2 ммоль) 5-метил-2-метилмеркапто-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(4Н)-она в 25 мл хлористого метилена последовательно добавляют 9,3 мл (37,8 ммоль) BSA и 0,44 мл (2,52 ммоль) TMSOTf и перемешивают в течение 20 минут до полного растворения исходного вещества. К образовавшемуся раствору при комнатной температуре добавляют (2-ацетоксиэтокси)метилацетат и выдерживают 4 часа, после чего разбавляют 30 мл хлористого метилена и 10%-ным раствором Na₂CO₃ (50 мл) и перемешивают в течение 10 минут. После разделения фаз водный слой экстрагируют хлористым метиленом (3×50 мл), экстракт высушивают над Na₂SO₄. Изомеры делят так же как показано в примере 1.

Получено 3,0 г 3-((2-ацетоксиэтокси)метил)-5-метил-2-метилмеркапто-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(4Н)-она (38%) и 3,2 г 4-((2-ацетоксиэтокси)метил)-5-метил-2-метилмеркапто-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(4H)-она (40%).

Пример 3.

Синтез 4-((2-ацетоксиэтокси)метил)-5-метил-2-метилмеркапто-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(4H)-она (II)

Смешивают 10 мл ГМДС, 0,5 мл ДМФА и 2 г (10 ммоль) 5-метил-2-метилмеркапто-1,2,4-триазоло[1,5-a]пиримидин-7(4Н)-она (III), кипятят в течение 16 часов, после чего досуха испаряют летучие вещества в вакууме. К полученному остатку силильного производного добавляют 10 мл хлороформа, 1,7 мл (10 ммоль) (2-ацетоксиэтокси)метилацетата (IV) и 0,3 мл (2 ммоль) TMSOTf, после чего реакционную смесь кипятят в течение 1 часа, охлаждают до комнатной температуры, разбавляют 10 мл хлороформа, добавляют 10%-ный раствор Na₂CO₃ (10 мл), перемешивают в течение 10 минут. Водный слой экстрагируют хлороформом (3×20 мл), после объединения экстракты высушивают Mg₂SO₄ и продукты алкилирования делят так же как в примере 1. Получено 1,1 г 3-((2-ацетоксиэтокси)метил)-5-метил-2-метилмеркапто-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(3H)-она (35%) и 1.1 г 4-((2-ацетоксиэтокси)метил)-5-метил-2-метилмеркапто-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(4H)-она (35%).

Пример 4.

Синтез 4-((2-Гидроксиэтокси)метил)-5-метил-2-метилмеркапто-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(4H)-она (I)

К 30 мл метанольного раствора 3,0 г 3-((2-ацетоксиэтокси)метил)-5-метил-2-метилмеркапто-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(4Н)-она добавляют раствор 10 мг металлического натрия в 1 мл метанола. Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре 8 часов, после чего охлаждают и отфильтровывают образовавшиеся кристаллы 4-((2-гидроксиэтокси)метил)-5-метил-2-метилмеркапто-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(4Н)-она. Масса 2,1 г (7,78 ммоль, 82%) Тпл. 151-154°C; Вычислено для C₁₀H₁₄N₄O₃S, M=270,31, C: 44.43; H: 5.22; N: 20.73, Найдено, C: 44.53; H: 5.18; N: 20.70. ЯМР ¹H, δ, м.д.: 2.52 (с, 3H, SCH₃), 2.61 (с, 3H, CH₃), 3.48-3.51 (м, 2H, CH₂), 3.59-3.62 (м, 2H, CH₂), 4.44-4.47 (м, 1H, OH), 5.66 (с, 2H, CH₂), 5.89 (с, ¹Н, H6); ЯМР ¹³C, 6, м.д.: 13.4 (Me), 17.6 (SCH₃), 59.9 (C4′), 71.1 (C3′), 76.8 (C1′), 101.1 (C6), 151.8 (C5), 153.0 (C7), 153.9 (C3a), 162.9 (C2); Масс-спектрометрия (электроспрей) m/z: 271.09 [M+H]⁺; ИК: 1269, 1456, 1566, 1705, 2954, 3477;

Пример 5.

Синтез 4-((2-Гидроксиэтокси)метил)-5-метил-2-метилмеркапто-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(4H)-она (I)

В изопропаноле (35 мл) растворяют 15 мг металлического калия, после чего при перемешивании добавляют 2,5 г 3-((2-ацетоксиэтокси)метил)-5-метил-2-метилмеркапто-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(4H)-она и оставляют реакционную смесь при комнатной температуре на 8 часов, затем охлаждают и отфильтровывают образовавшиеся кристаллы 4-((2-гидроксиэтокси)метил)-5-метил-2-метилмеркапто-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(4H)-она. Масса 1,8 г (6,48 ммоль, 80%)Определение биологического действия заявляемого соединения

Пример 6.

Оценка цитотоксичности исследуемого соединения с использованием постоянной культуры клеток GMK-AH (1Д)

Для формирования сплошного монослоя в пробирки вносили по 1 мл суспензии клеток с плотностью 200 тыс./мл, инкубировали при температуре (37,0±0,5)°C, 5% CO₂. Затем ростовую среду удаляли и вносили свежую питательную среду, содержащую различные концентрации исследуемого препарата (от 1000 до 6,25 мкг/мл). Затем пробирки инкубировали в течение 5 суток при температуре (37,0±0,5)°C, 5% CO₂. С использованием светового микроскопа наблюдали за состоянием монослоя клеток: частичная или полная деструкция монослоя клеток, повреждение отдельных клеток, образование клеточного синцития. Контролем являлись пробирки с монослоем, в которые внесена поддерживающая среда без препарата.

Результаты оценки цитотоксичности исследуемого препарата свидетельствуют, что субстанция в концентрации 50 мкг/мл не вызывает видимых изменений в культуре клеток GMK-AH (1Д). Полученные данные приведены в Таблице 1.

Пример 7.

Изучение эффективности заявляемого соединения в отношении вируса Западного Нила проводили в культуре клеток GMK-AH (1Д).

Монослой культуры клеток GMK-AH (1Д) инфицировали вирусом Западного Нила в дозе 0,05 БОЕ/клетку. Адсорбцию вируса проводили при температуре 37°C 5%-ным CO₂, в течение 60 мин. По окончании инкубирования монослой трижды промывали поддерживающей средой, содержащей по 100 ед./мл пенициллина и стрептомицина, для удаления не адсорбировавшегося вируса и вносили исследуемые соединения в концентрации, составляющей ½ МПК. Препарат RVL-346 растворяли в DMSO до конечной концентрации 10 мкг/мкл и далее разводили до нужной концентрации поддерживающей питательной средой. На каждое соединение использовали не менее 10 пробирок с монослоем клеток. Инкубирование проводили при температуре 37°C, 5% CO₂, в течение 48 часов. Далее проводили криодеструкцию клеток и объединяли пробы. Инфекционный титр в объединенных пробах определяли титрованием методом формирования негативных колоний под агаровым покрытием в культуре клеток GMK-AH (1Д).

Результаты изучения противовирусной активности азолового соединения выявили, что субстанция подавляет репродукцию вируса ЛЗН на 1,5 lg. Коэффициент ингибирования для исследованного препарата составил 96,7% (см. Таблицу 2).

Таким образом, новое химическое соединение не токсично в используемых концентрациях, обладает значимой противовирусной активностью in vitro в отношении вируса Лихорадки Западного Нила.